Summary
तीव्रता का अध्ययन निमेटोड कीड़ा
Abstract
Β-amyloid पेप्टाइड (Aβ) का संचय अल्जाइमर रोग के प्रेरण के लिए केंद्रीय होना आम तौर पर माना जाता है, लेकिन विषाक्तता (ओं) की प्रासंगिक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है. Aβ भी समावेश शारीरिक Myositis, एक गंभीर मानव मायोपथी में intramuscularly जमा. तीव्रता का अध्ययन निमेटोड कीड़ा Caenorhabditis एलिगेंस transgenically मानव Aβ व्यक्त इंजीनियर कर सकते हैं. ऊतक या Aβ अभिव्यक्ति के समय पर निर्भर करता है, ट्रांसजेनिक कीड़े आसानी से औसत दर्जे का phenotypes कि Aβ विषाक्तता का एक पढ़ने के रूप में सेवा कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, अखिल neuronal Aβ अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक कीड़े दोष साहचर्य सीखने (Dosanjh एट अल 2009.) है, जबकि विधान मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक कीड़े एक प्रगतिशील, उम्र पर निर्भर पक्षाघात (लिंक, 1995 phenotype दिखाने, कोहेन एट अल 2006.). एक विशेष रूप से उपयोगी सी. एलिगेंस मॉडल mRNA निगरानी प्रणाली में एक परिवर्तन के तापमान के प्रति संवेदनशील रोजगार के तापमान inducible एक Aβ transgene की मांसपेशियों की अभिव्यक्ति इंजीनियर, तापमान upshift (एट लिंक अल 2003.) पर एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पक्षाघात phenotype में जिसके परिणामस्वरूप. उपचार है कि इस मॉडल में काउंटर Aβ विषाक्तता [उदाहरण के लिए, एक सुरक्षात्मक transgene (हसन एट अल 2009.) की अभिव्यक्ति या जिन्कगो biloba अर्क (वू एट अल 2006) के लिए जोखिम] reproducibly इन ट्रांसजेनिक के तापमान upshift द्वारा प्रेरित पक्षाघात की दर को बदल कीड़े. यहाँ हम इस ट्रांसजेनिक सी. में पक्षाघात की दर को मापने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन एलिगेंस मॉडल, प्रयोगात्मक चर कि इस माप को प्रभावित कर सकते हैं पर विशेष ध्यान के साथ.
Protocol
1) पक्षाघात परख के लिए निमेटोड ग्रोथ मीडिया प्लेटों की तैयारी.
पक्षाघात assays मानक निमेटोड ग्रोथ मीडिया (एन जी एम) नियमित रूप से सी के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों पर प्रदर्शन कर रहे हैं एलिगेंस प्रचार और आनुवंशिकी (Stiernagle 2006).
- एन जी एम NaCl, अग्रवाल और एक Erlenmeyer कुप्पी में Peptone युक्त समाधान आटोक्लेव और बाँझ CaCl 2, Uracil, कोलेस्ट्रॉल, 1M MgSO 4 और 1M 4 केपीओ की उचित मात्रा में जोड़ने. विभाज्य प्रत्येक 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में तरल एन जी एम के 10 एमएल. एन जी एम रात कमरे के तापमान पर जमना के लिए अनुमति दें.
- यदि प्रत्येक थाली पर यौगिकों / अर्क, विभाज्य निकालने के प्रभाव के लिए परीक्षण और एक स्प्रेडर का उपयोग करने के लिए थाली की सतह पर समान रूप से निकालने वितरित. निकालने के लिए कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखे की अनुमति दें. 1 एमएल से अधिक वॉल्यूम अधिक समय के लिए सूखी आवश्यकता होगी.
- ई. के 250 μL साथ प्रत्येक प्लेट स्पॉट कोलाई तनाव OP5O लेग 0.4-0.6 की एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए रातोंरात मीडिया में हो गया है. बैक्टीरिया रात कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति दें.
प्रासंगिक चर
प्लेटों की उम्र पक्षाघात परख पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है, के रूप में बड़े प्लेटों के बाहर सूखी हैं. का प्रयोग करें प्लेटें पक्षाघात परख के एक सप्ताह के भीतर डाला. आदर्श परिणामों के लिए, [नीचे (2) देखें] तुल्यकालिक कीड़ा आबादी की दीक्षा से पहले 3-4 दिन प्लेटें डाल. किसी भी प्रयोग के लिए, केवल एक ही बैच से डाला प्लेटों का उपयोग करें.
लॉन के आकार (यानी देखा बनाम फैल) और / या बैक्टीरिया के प्रकार बदलकर भी कीड़े के व्यवहार बदल जाएगा. पक्षाघात assays के विकल्प ई. का उपयोग किया जा सकता है एक खाद्य स्रोत (जैसे, HT115 आरएनएआई प्रयोगों खिलाने में इस्तेमाल किया तनाव), लेकिन यह पक्षाघात के कैनेटीक्स बदल सकते हैं, इस प्रकार उचित आंतरिक नियंत्रण की आवश्यकता के रूप में कोलाई उपभेदों.
2) आयु तुल्यकालिक इल्ली जनसंख्या की तैयारी
CL4176 तनाव (SMG (cc546 टीएस) 1 मैं; dvIs27 [myo-3 / Aβ minigene + rol 6 (su1006) जीन मार्कर] एक्स सबसे अधिक Aβ प्रेरित पक्षाघात परख करने की क्रिया के लिए इस्तेमाल किया यह तनाव और अन्य ट्रांसजेनिक मॉडल उपलब्ध हैं. Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) से एक मामूली शुल्क के लिए अकादमिक शोधकर्ताओं के लिए.
- परीक्षण जनसंख्या यह एक सिंक्रनाइज़ माता - पिता की पीढ़ी के साथ शुरू करने के लिए बेहतर है की उम्र synchrony को अधिकतम करने के लिए. एक हफ्ते पहले परीक्षण जनसंख्या के पक्षाघात परख की शुरुआत, एक प्लैटिनम कीड़ा पिकर का उपयोग करने के लिए कई 10 सेमी एन जी एम OP50 के साथ एक 2 घंटे अंडे के लिए फैल प्लेटों पर 20-30 gravid वयस्कों हस्तांतरण 16 पर रखना ° (सी CL4176 के लिए अनुमोदक तापमान ). Gravid वयस्कों निकालें और संतान 7 दिनों के लिए विकसित करने के लिए, जिसके द्वारा वे "दूसरे दिन" हो जाएगा gravid वयस्कों की अनुमति.
- (1 दिन) दूसरे दिन gravid वयस्कों के लिए उम्र तुल्यकालिक परीक्षण आबादी को तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए ऑब्जेक्ट के लिए 50-75 आयु - तुल्यकालिक कीड़े युक्त तीन प्रतियों प्लेटें उत्पन्न है. एक प्लैटिनम कीड़ा पिकर का उपयोग, 60 (10 एमएल मात्रा) मिमी एन जी एम OP50 साथ देखा प्लेटों पर 10-12 दिन 2 gravid वयस्कों के हस्तांतरण. कीड़े 16 ° C पर अंडे देना 2 घंटे के लिए, फिर से वयस्कों लेने और अंडे पक्षियों के बच्चे के लिए अनुमति देते हैं और 16 में बढ़ती डिग्री सेल्सियस की अनुमति दें इस बिंदु पर यह सबसे अच्छा है कोई है जो प्लेटों नहीं स्कोरिंग उन्हें कोड है, तो गणक प्रयोगात्मक शर्तों को अंधा हो जाएगा.
प्रासंगिक चर
जब अंडे रखी है भ्रूण विकास के चरण (~ इष्टतम शर्तों के तहत जंगली प्रकार के कीड़े के लिए मंच 26 सेल) वयस्क उम्र और पोषण की एक समारोह है. यदि gravid परीक्षण आबादी की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया वयस्कों पुराने या भूखे हैं, बाद में मंच अंडे, निर्धारित किया जाएगा जनसंख्या और पक्षाघात कैनेटीक्स के reproducibility की उम्र synchrony को कम करने. यह मोनो axenic (यानी, केवल OP50 बैक्टीरिया) से आवश्यक है संस्कृतियों (माइक्रोबियल contaminants के गंभीर रूप से इस परख को प्रभावित कर सकते हैं) किया जाता है, और reproducibility सबसे अधिक है अगर तीन प्रतियों प्लेटें कीड़े के समान संख्या है.
3) transgene प्रेरण और पक्षाघात परख
- (3 दिन) 25 Upshift प्लेटें ° तुल्यकालिक अंडे के अंत के बाद सी 48 घंटे करना, कीड़े तीसरे लार्वा चरण (L3) पर होना चाहिए. प्लेट्स एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में stacking सभी प्लेटें एक ही समय में 25 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए अनुमति के बिना व्यवस्था की जानी चाहिए.
- (4 दिन) 18-20 बजे upshift की दीक्षा के बाद कीड़े के पक्षाघात (तनाव CL4176) स्कोरिंग शुरू. इस बिंदु पर, जनसंख्या में सभी कीड़े को चौथे (L4) लार्वा चरण तक पहुँच होना चाहिए. दो घंटे की वेतन वृद्धि में स्कोरिंग प्लेटों के प्रत्येक पर जब तक सभी कीड़े के झोले के मारे हुए हैं आगे बढ़ें. अज्ञात कारणों के लिए, पक्षाघात शरीर की लंबाई भर में भी नहीं है: सिर क्षेत्र कीड़ा के लिए आगे बढ़ संघर्ष के अंतिम भाग है. इस प्रकार w,orms है कि हाल ही में पक्षाघात शुरू की है थाली भर अनुवाद नहीं है, लेकिन उनके सिर को स्थानांतरित कर सकते हैं, जिससे उनके पूर्वकाल के आसपास बैक्टीरिया समाशोधन और मंजूरी दे दी जीवाणुओं की एक "प्रभामंडल" छोड़ने कर सकते हैं. ये कीड़े हमेशा पूरी तरह से पंगु हो जाएगा, और इसलिए halos के साथ कीड़े झोले के मारे हुए के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. कुछ कीड़े halos नहीं है लेकिन यह भी सहज आंदोलन दिखाएगा नहीं होगा, इन कीड़ा पिकर साथ उकसाने द्वारा परीक्षण कर रहे हैं. यदि एक prodded कीड़ा उकसाने पर एक पूरे शरीर की लहर प्रचार नहीं गुजरना कर सकते हैं, यह भी रूप में झोले के मारे हुए रन. कुशल स्कोरिंग के लिए, यह आसान है थाली के एक बेदाग़ क्षेत्र को झोले के मारे हुए कीड़े कदम इतना है कि वे अनजाने अगले स्कोरिंग अवधि नहीं rescored जाएगा. (यह भी गलत वर्गीकृत कीड़े प्रदर्शित करने के लिए आंदोलन की अनुमति देता है, एक अंक सुधार की अनुमति है).
- पक्षाघात वक्र उत्पन्न करने के लिए, हर समय बिंदु पर प्रत्येक थाली है कि झोले के मारे हुए नहीं किया गया है पर कीड़े के अंश एक प्रतिशत कनवर्ट किया जाता है, और औसत "unparalyzed" प्रतिशत upshift दीक्षा से समय के खिलाफ योजना बनाई है. (इस ढंग से की साजिश रचने के लिए तर्क है कि जिसके परिणामस्वरूप वक्र औपचारिक रूप से अस्तित्व वक्र के अनुरूप है, और इस प्रकार मानक गैर पैरामीट्रिक अस्तित्व आँकड़ों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है.)
प्रासंगिक चर
ट्रांसजेनिक myo-3/Aβ कीड़े के upshift पहले वे पक्षाघात के लिए मध्य L4 मंच तक पहुँचने, myo 3-प्रमोटर developmentally विनियमित है के रूप में शुरू किया जाना है, और काफी देर से L4 या वयस्क कीड़े में अभिव्यक्ति कम होने चाहिए. इसी तरह, अगर कीड़े भूखे हो जाते हैं हैं इस transgene की अभिव्यक्ति अवरुद्ध है, इसलिए यह जरूरी है कि कीड़े प्रयोग भर में अच्छी तरह से तंग आ चुके हैं. हम एक झोले के मारे हुए के लिए किसी भी शर्तों के तहत ठीक कीड़ा कभी नहीं देखा है, और upshift के 12-16 घंटा के बाद, सभी CL4176 कीड़े पंगु बना होगा, भले ही वे 16 डिग्री सेल्सियस के लिए downshifted तनाव CL4176, transgene अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त upregulation कारण पक्षाघात कम तापमान पर हो (यानी, 20-25 ° C) हालांकि पक्षाघात के समय को बदल दिया जाएगा. पक्षाघात दर विशिष्ट ट्रांसजेनिक तनाव इस्तेमाल किया (हम CL4176 की तुलना में दोनों तेज और धीमी दर के साथ myo-3/Aβ उपभेदों का निर्माण किया है) पर निर्भर करता है है, तो वैकल्पिक उपभेदों के साथ स्कोरिंग खिड़की को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
4) प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 में दिखाया गया है CL4176 के लिए एक पक्षाघात की वक्र की एक साजिश है, दोनों अनुपचारित और 6.27 कैफीन मिमी (एन जी एम थाली में अंतिम एकाग्रता) को उजागर. लगभग 4 बजे, जो हम इस मॉडल में के रूप में Aβ विषाक्तता के दमन का संकेत व्याख्या की पक्षाघात में अत्यधिक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण देरी में इस उपचार का परिणाम है. चित्रा 2 में दिखाया गया है एक स्वतंत्र प्रयोग cafestol, एक और कॉफी में पाया यौगिक के प्रभाव को परख करने की क्रिया है. इस साजिश के लिए विशिष्ट उपचार है कि Aβ विषाक्तता प्रभाव नहीं है. नोट है कि दोनों प्रयोगों में के बारे में आधा इलाज CL4176 आबादी 24 घंटे में रुक कर रहे हैं, और पक्षाघात 28 घंटा से पूरा हो गया है. CL4176 आबादी नियंत्रण के पक्षाघात के लिए ठेठ timeframes हैं. इस समय से महत्वपूर्ण विचलन बदल पर्यावरण शर्तों या transgene प्रतियों की सहज विलोपन का संकेत कर रहे हैं. (CL4176 chromosomally myo-3/Aβ transgene के कई प्रतियों के साथ एकीकृत ट्रांसजेनिक सरणी शामिल हैं हालांकि इस ट्रांसजेनिक सरणी सामान्य रूप से काफी स्थिर है. तापमान पर तनाव के किसी भी प्रचार> 16 डिग्री सेल्सियस दुर्लभ कीड़े है कि एक आया है के लिए चुन लिए जाएँगे transgenes का सहज विलोपन, कि Aβ अभिव्यक्ति और धीमी पक्षाघात परिणाम कम होगा वेरिएंट में जिसके परिणामस्वरूप.)
चित्रा 1. CL4176 कीड़े अनुपचारित या 6.27 मिमी कैफीन (सिग्मा) उजागर करने के लिए तनाव के लिए पक्षाघात वक्र संकेत बार तापमान upshift की दीक्षा से कर रहे हैं. त्रुटि सलाखों = SEM
चित्रा 2. CL4176 0.48 मिमी cafestol (सिग्मा) उजागर करने के लिए कीड़े के लिए पक्षाघात वक्र. त्रुटि सलाखों = SEM
Discussion
प्रोटोकॉल हम वर्णित है को प्रभावी ढंग से Aβ विषाक्तता पर यौगिकों के प्रभाव की परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रकाशित उदाहरण जिन्कगो biloba निकालने घटक के प्रभाव (वू एट अल 2006) और Reserpine (आर्य एट अल 2009) शामिल हैं. कम्पाउँड कि अन्य प्रणालियों में Aβ विषाक्तता के खिलाफ रक्षात्मक किया गया है भी इस मॉडल में रक्षात्मक हो सकता है (उदाहरण के लिए, Memantine, हमारे अप्रकाशित परिणाम) दिखाया गया है. इस मॉडल की स्थापना के लिए एक महत्वपूर्ण तर्क है कि अच्छी तरह से विकसित की आनुवंशिक और आणविक उपकरणों सी में उपलब्ध है एलिगेंस Aβ विषाक्तता के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, Aβ विषाक्तता पर प्रभाव विशिष्ट परिवर्तन (उदाहरण के लिए, एक daf-2 उत्परिवर्तन हानि के समारोह, Florez McClure एट अल 2007. शुरू करने से संकेत की तरह इंसुलिन को कम करने के प्रभाव) assayed किया जा सकता है, और इस मॉडल को भी कर सकते हैं अधिक अभिव्यक्ति transgenes (Fonte एट अल 2008) के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. हमने हाल ही में इस मॉडल का व्यापक प्रयोग किया है Aβ में एक एमिनो एसिड प्रतिस्थापन (अप्रकाशित डेटा) की विषाक्तता पर प्रभाव की जांच करने के लिए.
ट्रांसजेनिक मॉडल यहाँ वर्णित assays तीव्र Aβ अभिव्यक्ति की मांसपेशियों में सेल समारोह पर प्रभाव. पक्षाघात की मांसपेशी कोशिकाओं और उनके sarcomere के समय में बरकरार हैं, पक्षाघात phenotype मांसपेशी कोशिका मृत्यु का परिणाम नहीं है. हालांकि, पक्षाघात के बाद (~ 48 घंटा प्रारंभिक upshift के बाद) वहाँ मांसपेशियों की अखंडता और कीड़े की अंततः मौत के के एक बे्रकडाउन है. हम Aβ अभिव्यक्ति के इस बहाव प्रभाव जांच नहीं की है या यह एक विषाक्तता मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया.
inducible Aβ अभिव्यक्ति यहाँ वर्णित मॉडल उपचार है कि β-amyloid से प्रति गठन मिलाना की जांच के लिए उपयुक्त नहीं है. हालांकि विधान Aβ अभिव्यक्ति के फार्म का आसानी से detectable amyloid जमा (तलछट एट अल 1998;. लिंक एट अल २,००१) के साथ ट्रांसजेनिक कीड़े, inducible Aβ अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक कीड़े शायद ही कभी amyloid जमा है और पक्षाघात phenotype amyloid बयान (ड्रेक एट अल के स्वतंत्र प्रकट होता है. 2003). हमारे परिणाम को देखने के साथ संगत कर रहे हैं कि घुलनशील oligomeric Aβ के संचय, नहीं बयान amyloid से प्रेरित Aβ अभिव्यक्ति के परिणामों की तीव्र विषाक्तता.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम जो मदद प्रोटोकॉल विकसित यहाँ वर्णित है, विशेष रूप से जिन Fonte, जो मूल प्रक्रिया विकसित लिंक प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम (AG12423) NIH और अल्जाइमर एसोसिएशन (चरम पुरस्कार) से CDL को पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl (6g) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Agar (40g) | Sigma-Aldrich | A7002 | |
| Peptone (5g) | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| ddH2O (2L) | |||
| 1M CaCl2 (2mL) | 147.02mg/mL in ddH2O | ||
| Uracil (2mL) | 2mg/mL in ddH2O | ||
| Cholesterol (2mL) | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | ||
| 1M MgSO4 (2mL) | 246.5mg/mL in ddH2O | ||
| 1M KPO4 (50mL) | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | ||
| Erlenmeyer Flask | VWR international |
References
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