Summary
Мы подробно нового ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) катетер для 2-мерных внутрисосудистого молекулярной визуализации налета биологии
Protocol
В модели животных онлайне: Поколение экспериментальной Атеросклероз аортоподвздошный
1) Базовый Ангиография и воздушных шаров Денудация
- До получения базовых ангиографии и воздушный шар денудации, Новой Зеландии белый кролик питается высокий уровень холестерина (1%) диета в течение 1 недели. Это животное используется для поступательного отношение, как 1) аорто-iliacs судов в кролики же калибра, как человеческие коронарных артерий (2,5 3,5 мм) и 2) гиперлипидемией, воздушный шар травмы модель порождает воспаленной атеросклероза подшипников аналогичного воспалительных клеток (макрофагов ) и молекул (катепсины), как в человека атеросклероза.
- После холестерина кормления животных под наркозом с пропофола и кетамина. Один дюйм вентральный вырез шеи средней линии осуществляется с помощью использования размера 15-лезвие скальпеля. Использование методов тупой диссекции, мышц под фасции на правой стороне трахеи подвергается. Левая мышца sternocephalicus отделяется вдоль ее соединительной ткани соединения, а правой общей сонной артерии подвергается. Артерии отделяется от блуждающего нерва. Проксимального и дистального петли шва располагаются на артерии, чтобы обеспечить опровержение и окклюзии. От 1 до 2 мм скошенные arteriotomy производится через который 5 французских (наружный диаметр 1.67mm) сосудистой оболочки вставляется и гепарин (1000μ/mL, ~ 150units/kg) вводят внутри-arterially через оболочку.
- Контрастность красителя (Ультравист) затем вводят (от 1 до 2 мл) в течение 2 Второй период для получения контроля ангиограмма дистальной аорты и оба подвздошных артерий.
- Iliofemoral артерий и аорты, затем ранения в результате денудации эндотелия. Используя стандартные методы рентгеноскопии, 3FR катетер Фогарти эмболэктомия помещается в дистальной iliofemoral артерии и надуваются от 0,3 до 0,5 мл контраста (50% contrast/50% раствора) или по воздуху. Катетер затем отозвано проксимально в наполненном состоянии расстояние вдоль правой подвздошной и дистальной аорты до взлета левой почечной артерии. После шар денудации, ангиография повторяется в документе судна проходимости. После ангиографии, все катетеры и оболочки удаляются и проксимальных правой общей сонной артерии лигируют, мышцы и фасции зашивается с 4 / 0 рассасывающиеся нити, а разрез кожи закрыты с 4 / 0, не рассасывающиеся нити.
- Животное затем позволили восстановить с администрацией одну дозу антибиотиков (Cephazolin, 0,5 г IM). Боль лекарства в том числе 0,01 мг / кг бупренорфина IM (два раза в день по мере необходимости). Животные затем продолжил на 1% холестерина в течение 4 недель после шар денудации. На неделе 5, животные перешли на 0,3% холестерина диету.
Комплексная мультимодальных изображений Кролика Atheromata
2) Маркировка протеолитически активной воспаленными доска использованием инъекционного наносенсор, ангиография, внутрисосудистое ультразвуковое исследование (ВСУЗИ), и в естественных условиях внутрисосудистого NIRF изображений Кролик атеромы
- Восемь недель после травмы воздушный шар, и за 24 часа до обработки изображений, кролика вводят внутривенно 500 нмоль / кг Prosense/VM110 (PerkinElmer) через ухо вены.
- Двадцать четыре часа после инъекции, животных под наркозом и артериальной доступ получен с помощью левой общей сонной артерии (см. шаг 1.2). Внутриартериального гепарин вводят (150 ЕД / кг). Базовый ангиографии получается, что и выше.
- ВСУЗИ катетер загружается на клинические коронарной артерии способны 0,014 дюйм проволоки и вставляется в ножны. Использование флуороскопа, рентгеноконтрастный кончик провода расположены дистально в правой подвздошной артерии. ВСУЗИ катетер затем продвинулся в проксимальных подвздошной артерии с использованием стандартной техники клинических монорельсовая дорога.
- 100 мм откат по инициативе и изображения записываются. Продольные реконструкция судна получается и просвета доска выявлено.
- Катетер NIRF 11,12 загружается на 0,014 дюйм проволоки (монорельсовые системы), и катетер осторожно вставляется в ножны и обработки изображений головка располагается дистально в правой подвздошной артерии.
- Несколько автоматизированных откатах (1 мм / с продольными откат, 30 выстрелов в минуту) выполняются и флуоресценции сигналов в пределах зоны атеросклероза отмечаются. Изображения записываются и дальнейшей обработки с соответствующим масштабированием и оконной на основе спектра сигнала достигается.
3) Эвтаназия и изоляции бывших естественных аорто-подвздошных ткани
- Эвтаназия осуществляется с 1cc эвтаназии агента (решение 390mg натрия фенобарбитала и фенитоина 50 мг натрия), внутривенно, одной инъекции.
- Артериального дерева озарен 0,9% физиологического раствора до нижней полой вены ясно крови. Атеросклеротических артерий аорты и подвздошных были выявлены и расчлененных свободным от окружающих тканей. Кроме того, малые 2 х 2 см куски Liверсии, почки, селезенка и сердце, также получены.
- Экс естественных изображений с NIRF внутрисосудистого катетера NIRF изображения можно сделать на данном этапе. Судно удлиненные и катетер NIRF повторно вставлен в проксимальной аорты до визуализации головка располагается в правой подвздошной артерии или бифуркации. Несколько автоматизированных откатах выполняются как указано выше (см. п. 2.6).
4) Ex естественных условиях флуоресцентного отражения Imaging (ПТ) расчлененного аорты и подвздошных артерий
- Расчлененный ткани помещают в 10-20 мл физиологического раствора и транспортируется для анализа ПТ (Kodak Image станции 4000мм Pro, Carestream Health, Inc.)
- Аорты, сосудов подвздошной вытянуты приблизить реального времени длины и изображения, полученные при разных длинах волн [белый свет, зеленый флуоресцентный канал (бывший 495 нм, ет 515 нм), Cy5 (бывший 565 нм, ет 670 нм) и Cy7 (экс 650 нм, ет 760 нм)] каналов. Серия экспозиций используются для каждой длины волны (0.1-30сек) и полученные изображения экспортируются как DICOM или 16-битных TIFF-файлах немасштабированный для дальнейшего анализа. Как положительный и отрицательный контроль, органы (печень, селезенка, почки и сердце) изображаются на аналогичных каналов и экспозиции.
- Районы повышенного сигнала в ближней ИК-каналу (780 +) отмечены в атеросклеротических артериях.
5) Ткань для вложения Секционирование и иммуногистохимического анализа
- Области нормального (не поврежденных тканей, т.е. левая подвздошной артерии) и области зубного налета были выявлены и небольшие кольца 5-10 мм тканей, внедренных в октябре (оптимальная температура резка) средства массовой информации. Блоки хранятся при температуре -80 С до секционирования.
- Стандартные методы секционирования и иммуногистохимического анализа выполняются. Гематоксилином и эозином пятно, Рам-11 и B Катепсин окрашивания выполняются.
Анализ и интеграция мультимодальных изображений (ангиография, ВСУЗИ, NIRF и ПТ)
6) Обработка NIRF и ПТ изображений
- DICOM-файлов, содержащих изображения данных из NIRF и ЛИИ (приняты на ближней инфракрасной области 780 нм канал) откатах, обрабатываются с использованием MATLAB и Osirix программного обеспечения, соответственно. Правильное окон для отображения полного спектра интенсивности сигнала достигается. Заключительные экспорта изображений в виде файлов TIFF.
- Файлы импортируются в стандартное программное обеспечение для обработки изображений (основной могут быть использованы). Изображения выравниваются на основе опорных точек (например, позвонки на ангиографию, подвздошных бифуркации, и почечной артерии). Области нормальной судна и доска определены.
- Регионы интереса (ROI) вручную прослеживается (для нормальной ткани и области зубного налета) и средняя интенсивность сигнала приобретаются использованием MATLAB Osirix и, соответственно, для ПТ и NIRF изображений. Для руководства соответствующих отслеживание, продольные ВСУЗИ образ судно используется и определение нормальной судна и доска легко идентифицируются.
- Target-на фон (TBR) нормативы рассчитаны на доску зон.
Представитель Результаты:
По завершении выше протокола, мы можем выявить и охарактеризовать областях расширенной деятельности протеазы катепсина при воспалительных доска в аорте и подвздошных сосудов. Инъекция активируемые наносенсор (Prosense/VM110) позволяет определить протеолитически активной бляшки. Они появляются в виде ярких или сигнал интенсивной зон при использовании ПТ отображаемого в ближнем инфракрасном канале (750 нм). NIRF откатах коррелируют с повышенной интенсивностью сигнала на ПТ и выравнивания с ВСУЗИ, которые позволяют анатомические регистрации сигналов NIRF. Расчетная доска TBR, полученные от ПТ и NIRF были сходными (см. Рисунок 3: среднее NIRF TBR 4.2, означает пт TBR 2.9). Иммуногистохимический анализ ярких доска подтверждает интенсивное присутствие RAM-11 и B Катепсин деятельности в области зубного налета (данные не приведены).
Рисунок 1. Схема Катетер 2D NIRF Для расширения клинического потенциала 1D NIRF зондирования подход 6, мы построили новый 2-D NIRF-катетер для внутрисосудистого изображений. 11,12 заказ катетер состоит из оптического волокна (125 мкм диаметром размещалась в полиэтиленовой трубы: 2.9F), который освещает использованием 750 нм лазерный источник возбуждения. Лазерный луч света под углом 90 градусов относительно оси волокна. Система использует два автоматизированных двигателей (вращательное и поступательное), чтобы дать сопутствующей 360 изображений степени и продольных откат получить истинное 2D-изображений. Изображения, используемые с разрешения ссылку 11.
Рисунок 2. Схема демонстрирует протеазы-опосредованной активации наносенсор, Prosense/VM110. Изображение используется с разрешения ссылки 10.
Рисунок 3. В естественных условиях и бывших естественных Налет TBRs (цель-в фоновый коэффициентов)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Воспаление высокого риска и уязвимых бляшек, вероятно, ответственны за большинство инфарктов миокарда. Выявления таких бляшек до появления симптомов имеет важное клиническое значение как в прогнозировании исходов и руководящие медикаментозной терапии. Обычные коронарных артерий формы визуализации, такие как рентгеновская ангиография обычно сосредоточены на характеристике просвета сужения, а не освещает лежащих в основе биологического профилей с высокой степенью риска, как правило, без стенозирующего поражения. Внутрисосудистое NIRF молекулярной визуализации предлагает лаборатории катетеризации сердца переводимые подход, который включает в себя биологию налета воспаление за счет использования наносенсоров, которые определяют активные макрофаги в пределах зубного налета, сотовые признак воспаленных доска склонны к разрыву. 9
Следующий протокол описанных выше использует смешанные интегративный подход, сочетающий ангиографии и ВСУЗИ NIRF визуализации для выявления воспаленные бляшки. Этот роман 2D NIRF катетер капитализирует на благоприятные оптические свойства ближней инфракрасной флуоресценции пропускную способность обнаруживать молекулярные подписей через кровь, и является перспективным в естественных условиях подход к молекулярной визуализации. Наносенсор Prosense/VM110 связан с флуорохромами, которые испускают fluroescence при 780 нм и использовать автоматическое тушение при отсутствии протеолитического расщепления или активацию фермента катепсина (очень выраженное в резидент макрофагов). Обнаружение в естественных условиях флуоресцентного сигнала от катетеров NIRF позволяет идентифицировать макрофагов нагруженные налета (TBR 2.9). Использование бывших естественных флуоресценции отражательной томографии (ПТ) подтверждает наличие сигнала ИК флуоресценции в области зубного налета (TBR 4.2). Иммуногистохимическое окрашивание RAM-11 и катепсина в районах налета подтвердить интенсивной инфильтрации катепсина-B позитивных макрофагов (данные не приведены).
Включение ВСУЗИ и NIRF сигнала могут быть приварены к карте интенсивности сигнала в пределах видимого доски по длине судна (данные не приведены) и предлагает уникальную возможность для дальнейшего выяснения просвета морфологии зубного налета и макрофагов содержания. Текущие ограничения выше метода относятся невозможность точно совместно зарегистрировать ВСУЗИ и NIRF откатах. Одновременное откат с помощью интегрированного двойного модальных катетер бы повысить точность сигнала месте и, возможно, включить разрешение расположения сигнала в стенках сосудов (т.е. глубина сигнала в просвете, СМИ или адвентиции). Двойной модальных NIRF / ВСУЗИ или NIRF / оптической когерентной томографии (ОКТ) катетеры слияния, как ожидается, следовательно, обеспечить дальнейшее разграничение сигнала и включения доска архитектуры с биологией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
FAJ - Бывший консультант, медицинский VisEn; Гонорары, Boston Scientific
Acknowledgments
Поддержка эта работа была предоставлена Национальным институтом здоровья грант R01 HL 108229, Американской ассоциации сердца Ученый развития грант № 0830352N, Медицинского института Говарда Хьюза развития карьеры Award, Бродвью Ventures, Седьмой рамочной программы Европейского сообщества (FP7/2007-2013 по гранту договор № 235689), и MGH Уильям Шрейер стипендий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prosense 750 | Visen Medical | VM110 | 500 nmol/kg IV injection |
| Heparin Sodium | APP Pharmaceuticals | 401586D | |
| Cephazolin | NovaPlus | 46015683 | |
| Lidocaine HCL 2% | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 | |
| Ketamine | Hospira Inc. | NDC 0409-2051-05 | |
| High Cholesterol Diet 1% | Research Diets | C30293 | |
| HIgh Cholesterol Diet 0.3% | Research Diets | C30255 |
References
- Andersson, J., Libby, P. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).
- Calfon, M. A., Vinegoni, C. Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques. Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).
- Chen, J., Tung, C. -H. In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis. Circulation. 105, 2766-2771 (2002).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Molecular Imaging of Cardiovascular Disease. Circulation. 116, 1052-1061 (2007).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).
- Jaffer, F. A., Vinegoni, C. Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis. Circulation. 118, 1802-1809 (2008).
- Kim, D. -E., Kim, J. -Y. Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Naghavi, M., Libby, P. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation. 108, 1664-1672 (2003).
- Weissleder, R., Tung, C. -H. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).
- Razansky, R. N., Rosenthal, A. Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo. Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).
- Jaffer, F. A., Calfon, M. A. Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury. Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).
