Summary
상패 생물학의 2 차원 분자 이미징을위한 intravascular 우리는 세부 새로운 가까운 적외선 형광 (NIRF) 카테터를
Abstract
상해에 대한 혈관 반응은 지질 라덴 내부 luminal 상패, 부드러운 근육 세포 증식과 혈관 루멘의 점진적 축소의 축적으로 이어지는 혈관 벽 내에서 macrophages의 축적에 의해 실행 잘 조율된 염증 반응이다. 파단 underlies 급성 심근 경색의 경우 대다수하는 경향이 이러한 취약한 plaques의 형성. 복잡한 분자 및 세포의 염증 캐스케이드는 내피 및 평활근 세포에 대한 T lymphocytes과 macrophages 및 paracrine 효과의 채용에 의해 조율된 것이있다 1.
죽상 경화증의 분자 이미징은 염증과 다른 생물 학적 과정의 생체내 시각화에 있습니다 중요한 임상 연구 도구로 발전했습니다. 몇몇 최근의 예를 들면 환자의 위험도가 높은 plaques을 감지하고, 죽상 경화증의 pharmacotherapeutics의 효과를 평가할 수있는 능력을 보여줍니다. 4 분자 이미징 방법의 숫자가 (특히 MRI와 PET의)는 경동맥과 같은 대형 선박의 이미지 생물 학적 측면 수 있지만 부족한 옵션 관상 동맥의 이미지를 위해 존재하는 동맥, 2. 고해상도 광학 영상 전략의 출현, 특히 가까운 적외선 형광 (NIRF)에서, activatable 형광 프로브와 결합은 향상된 감도를 가지고 새로운 intravascular 전략의 개발에 주도 인간의 관상 동맥 죽상 경화증의 생물 학적 이미지를 향상시킬 수 있도록 지원합니다.
적외선 형광 (NIRF) 근처 분자 이미징은 광학 대비 대리인 또는 형광 프로브에게 전달하면 검색 수 NIR 창에서 형광 방출, 그 광자의 소스로 정의된 밴드 폭 (650-900 nm의)로 여기 빛을 활용 적절한 방출 필터와 고감도 전하 결합 카메라를 사용합니다. 가시 광선 반대로, NIR 조명은 조직에 깊이 침투 등 혈색소, 지방질과 물 같은 내생 광자의 absorbers에 의해 현저하게 적은 감쇠하고, NIR 윈도우의 감소 autofluorescence에 의한 높은 목표 - 투 - 배경 비율을 수 있습니다. NIR '창'사이 영상은 크게 생체내 이미징에 대한 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 2,5
염증성 시스테인 프로 테아제가 잘 activatable NIRF 프로브 10을 사용 공부하고, atherogenesis에서 중요한 역할을하고 있습니다. 세포외 기질의 분해를 통해 시스테인 프로 테아제의 진행과 죽상 경화증 8 합병증에 중요한 기여하고 있습니다. 특히, 시스테인 프로 테아제, 카텝신 B가 높은 표현과 실험 murine, 토끼, 인간 atheromata에 macrophages와 colocalizes. 또한 3,6,7가, plaques에 카텝신 B 활동이 이전에 한 설명을 활용하여 생체내에 느꼈습 수 있습니다 - D 여러 NIR의 fluorochromes (VM110/Prosense750, 예 / 그들 750/780nm, VisEn 의료, 워번, MA)와 derivatized 폴리 - 라이신 폴리머 백본으로 구성되어 있습니다 주사용 nanosensor 요원과 함께 intravascular 가까운 적외선 형광 기술 6 기본에 강한 분자내 담금질에 결과를. 10 다음은 NIRF 신호의 실질적인 확대의 결과로, 이러한 카텝신 B (상패의 macrophages와 colocalize로 알려져 있음), 별도의 fluorochromes로 시스테인 프로 테아제에 의해 효소 절단을 목표로. 활용 소설 2D intravascular NIRF의 카테터에 의해 NIR 형광 신호의 Intravascular 감지 지금은 염증 플라크의 카텝신 B 활동의 생체내 검출에 기하학적으로 정확한 고해상도 수 있습니다.
로 이전 1 - D spectroscopic 접근 방식에 반대하는 카테터 기반의 2D NIRF 이미지를 사용하여 죽상 경화증의 생체내 분자 이미징에서 6 소설과 혈관 염증을 감지하는 대식 세포 풍부한 플라크의 확대 테아제 활동을 활용하여 유망 도구입니다. 11,12가 다음과 같은 연구 프로토콜은 이미지에 intravascular 2 차원 NIRF의 카테터의 사용을 설명하고 상패 생물학의 주요 측면을 활용하여 플라크 구조를 특징. 그것은 혈관 조영술 및 intravascular 초음파 (IVUS)을 포함한 기존의 임상 이미징 기술과 통합 번역 플랫폼 염증성 atheromata 구별 독특하고 새로운 통합 multimodal 분자 이미징 기술을 제공하고, 인간 크기의 관상 동맥에 intravascular NIRF 신호의 검출을 허용 .
Protocol
생체내 동물 모델 : 실험 AortoIliac의 죽상 경화증의 생성
1)베이스 라인 혈관 조영술 및 풍선 발가벗김
- 이전 기준 혈관 조영술 및 풍선 발가벗김를 얻기 위해 뉴질랜드 화이트 토끼는 높은 콜레스테롤 (1 %) 1 주일 동안 음식을 공급합니다. 이 동물은 토끼의 aorto - iliacs 선박은 hyperlipidemic, 풍선 - 부상 모델은 유사한 염증 세포 (macrophages 베어링 염증 죽상 경화증을 생성 인간의 관상 동맥 (2.5 - 3.5mm) 및 2)와 같은 구경이 있습니다) 1로 translational 관련이 사용된다 인간의 죽상 경화증의 등)와 분자 (cathepsins).
- 콜레스테롤 먹이에 따라, 동물은 propofol과 마취제를 anesthetized 있습니다. 1 인치 복부 정중선 넥 절개는 15 사이즈 - 메스 블레이드를 사용하여 사용하여 이루어집니다. 무딘 절개 기법을 사용하여 기관의 오른쪽에있는 근막 아래 근육이 노출됩니다. 왼쪽 sternocephalicus 근육은 그 결합 조직 접합 따라 구분하고, 오른쪽 공통 경동맥가 노출됩니다. 동맥은 미주 신경에서 분리됩니다. 근위 및 말초 봉합 고리는 철회와 폐색 수 있도록 동맥에 위치하고 있습니다. 2mm로 1 arteriotomy을 beveled은 5 프랑스어 (1.67mm 외경)가 혈관 칼집 삽입 및 헤파린 (1000μ/mL ~ 150units/kg) 칼집을 통해 내부 arterially 관리입니다 어떤 통해 이루어집니다.
- 대비 염색 (Ultravist)은 다음 말초 대동맥의 제어 혈관 촬영 및 모두의 장골의 동맥을 얻기 위해 이초 기간 동안 (1 2mL) 주입입니다.
- iliofemoral 동맥과 대동맥은 다음 내피 발가벗김으로 부상하고 있습니다. 표준 fluoroscopy 방법을 사용하여 3Fr 포가티의 embolectomy 카테터는 말초 동맥 iliofemoral에 배치하고 0.3-0.5 대비 CC (생리 50% contrast/50 %)이나 공기와 부풀 수 있습니다. 카테 테르는 다음의 비정상적 상태에서 proximally 왼쪽 신장 동맥의 도약까지 오른쪽 장골의 및 말초 대동맥을 따라 거리를 철회합니다. 풍선 발가벗김 다음, 혈관 조영술은 선박 명백을 문서에 반복됩니다. 혈관 조영술에 따라 모든 카테터와 sheaths이 제거되고 근위 바로 일반적인 경동맥의 동맥이 출혈도 잡았이며, 근육과 근막은 4 / 0 흡수성 봉합사로 봉합하고 피부 절개는 4 / 0이 아닌 흡수성 봉합사로 닫혀 있습니다.
- 동물은 그러던 어느 선량 항생제 (Cephazolin, 0.5 g IM)의 관리와 복구하는 허용됩니다. 0.01 MG / kg buprenorphine 메신저 (필요에 따라 하루에 두 번)를 포함 통증 약물. 동물 그러면 사주 후 풍선 발가벗김 1 %의 콜레스테롤을 계속하고 있습니다. 주 5, 동물은 0.3 % 콜레스테롤 식단으로 전환됩니다.
래빗 Atheromata의 통합 멀티 모달 이미징
2) 주사용 nanosensor를 사용하여 proteolytically 적극적인 염증 상패의 라벨링, 혈관 조영술, intravascular 초음파 (IVUS), 그리고 토끼 Atheroma의 생체내 intravascular NIRF 이미징에
- 이전 이미지에 풍선 부상 24 시간 다음 8 주이 토끼는 귀 정맥을 통해 정맥 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer)으로 주입됩니다.
- 주사 후 24 시간 정도, 동물 anesthetized과 동맥 액세스 (단계 1.2 참조) 왼쪽 일반적인 경동맥을 통해 얻을집니다. 내부 간선 헤파린은 (150 단위 / kg) 관리합니다. 베이스 라인 혈관 조영술은 위와 같이 얻어진다.
- IVUS 카테터는 관상 동맥 임상 능력이 0.014 인치 와이어에로드하고 칼집에 삽입됩니다. fluoroscopic지도를 사용하여 와이어의 radiopaque 팁은 오른쪽 장골의 동맥에 distally 위치입니다. IVUS 카테터는 다음 표준 임상 모노레일 기술을 사용하여 근위 장골의 동맥에 고급 있습니다.
- 100mm의 pullback이 시작되고 이미지가 기록됩니다. 선박의 종방향 재건을 취득하고 luminal 상패가 식별됩니다.
- NIRF 카테터 11,12은 0.014 인치 와이어 (모노레일 시스템)에로드하고, 카테터는 조심스럽게 칼집 및 이미징 헤드에 삽입되는 오른쪽 장골의 동맥에 distally 위치입니다.
- 여러 자동 pullbacks (1mm / 초 세로 pullback, 분당 30 라운드)가 수행되고 죽상 경화증의 영역 내에 형광 신호가 설명되어 있습니다. 이미지가 기록 및 신호 범위에 따라 적절한 스케일링과 윈도우로 추가 처리가 이루어집니다.
3) 안락사와 전직 생체내 aorto - 장골의 조직의 분리
- 안락사는 안락사 에이전트 1cc (390mg 나트륨 50mg pentobarbital과 phenytoin의 나트륨 용액), 정맥, 단일 주사로 수행됩니다.
- 하부 대정 맥은 혈액의 명확 때까지 간선 나무는 0.9 % 정상적인 생리와 perfused 있습니다. atherosclerotic 대동맥과 장골의 동맥은 식별 및 주변 조직에서 무료로 해부하고 있습니다. 리튬의뿐만 아니라, 소형 2 X 2cm 개버전, 신장, 비장 및 심장도 얻을 수 있습니다.
- intravascular NIRF 이미징 카테터와 전 생체내 NIRF 영상이 단계에서 수행할 수 있습니다. 배는 길쭉한되고 이미징 헤드가 오른쪽 장골의 동맥이나 분기점에 위치 때까지 NIRF 카테터는 근위 대동맥에 다시 삽입됩니다. 여러 자동 pullbacks는 (2.6 참조) 위와 같이 수행됩니다.
해부 대동맥과 장골의의 동맥 4) 전 생체내 형광 반사율 이미징 (금)
- 해부 조직은 정상적인 생리의 10-20 CC에 위치하고 금 분석 (코닥 이미지 스테이션 4000MM 프로 Carestream 건강, 주식 회사)에 이송됩니다.
- 대동맥, 장골의 혈관은 대략 실시간 길이로 길쭉한하고 이미지는 여러 파장 [하얀 빛, 녹색 형광 채널 (예 : 495 NM, 엠 515 NM), Cy5 (예 : 565 NM, 엠 670 NM)와 Cy7 (예에서 얻을 수있다 650 NM, 그들을 760 NM)] 채널. 노출 시간의 일련의 각 파장에 대한 활용 아르 (0.1 - 30sec)과 인수 이미지 DICOM 또는 추가 분석을위한 16 비트 소수 자릿수가없는 TIFF 파일로 내보낼 수 있습니다. 긍정적이고 부정적인 컨트롤로, 장기 (간, 비장, 신장 및 심장)와 유사한 채널과 노출 시간에 몇 군데 있습니다.
- 가까운 적외선 채널 (780nm +) 증가 신호의 영역은 atherosclerotic 동맥에 설명되어 있습니다.
Sectioning 및 immunohistochemical 분석을위한 5) 조직 퍼가기
- 분야 일반 (비 부상을 조직, 즉 왼쪽 장골의 동맥) 및 상패의 영역이 식별하고 조직의 작은 5-10mm 고리가 OCT (최적 절삭 온도) 미디어에 포함됩니다. 블록은 sectioning까지 -80 C에 저장됩니다.
- sectioning 및 immunohistochemical 분석을위한 표준 기술이 수행됩니다. Hematoxylin 및 eosin 숫양 - 11 카텝신 B의 얼룩이 수행됩니다, 얼룩.
분석 및 멀티 모달 이미지의 통합 (혈관 조영술, IVUS, NIRF 및 금)
NIRF 및 금 영상의 6) 처리
- NIRF 및 금에서 이미지 데이터를 포함하는 DICOM 파일 (니어 적외선 780 nm의 채널에서 촬영) pullbacks는 각각, MATLAB 및 Osirix 소프트웨어를 사용하여 처리됩니다. 신호 강도의 전체 범위를 표시하는 적절한 윈도우가 이루어집니다. 최종 이미지는 TIFF 파일로 내보낼 수 있습니다.
- 파일은 표준 이미지 처리 소프트웨어 (기조 연설을 사용할 수 있습니다)로 가져올 수 있습니다. 이미지 참조 포인트 (혈관 촬영, 장골의의 분기, 그리고 신장 동맥에서 즉, 척추)에 따라 정렬됩니다. 일반 선박 및 상패의 영역은 식별됩니다.
- 관심 (ROI)의 영역은 수동으로 추적 (플라크의 정상 조직과 영역에 대한) 및 신호 강도가 금 및 NIRF 이미지 모두 각각 Osirix 및 MATLAB을 사용하여 획득 의미입니다. 적절한 추적을 안내하기 위해 선박의 길이 IVUS 이미지가 사용되며, 일반 선박과 상패의 식별을 쉽게 식별됩니다.
- 대상 - 투 배경 (TBR) 비율은 상패 영역에 대한 계산됩니다.
대표 결과 :
위의 프로토콜의 완료되면, 우리는 확인할 수 있으며 대동맥과 장골의 혈관 내에 염증 플라크의 확대 카텝신 프로 테아제 활동의 영역을 특징. activatable nanosensor (Prosense/VM110)의 주입은 우리가 proteolytically 적극적인 플라크를 확인할 수 있습니다. 이들은 밝은 표시 또는 가까운 적외선 채널 (750 NM)에 금을 사용하여 몇 군데 때 강렬한 영역 신호. NIRF의 pullbacks 증가 신호 금에 의해 강도 및 NIRF 신호의 해부 등록을 허용 IVUS와 정렬과 상관 관계. 금 및 NIRF에서 얻은 계산 상패의 TBR가 (NIRF TBR 4.2 말은 금 TBR 2.9을 의미 그림 3 참조)와 유사했다. 밝은 플라크의 Immunohistochemical 분석 RAM - 11 및 상패 영역 (데이터가 표시되지 않음)에 카텝신 B 활동의 강한 존재를 확인합니다.
그림 1. 1D NIRF 감지 방식 6의 임상 잠재력을 확장하기 위해 2D NIRF의 카테터의 개략도, 우리가 소설 intravascular 이미징을위한 2 - D NIRF - 카테터를 잽니다. 11,12 맞춤식 카테터는 광섬유 (125 미크론 직경 지내게 구성되어 있습니다 폴리에틸렌 튜브에 : 2.9F)을 750 NM 레이저 여기 소스를 사용하는 조명. 레이저 빛은 섬유 축에 비해 90도 각도로 방출됩니다. 이 시스템은 진정한 2D 영상을 얻기 위해 수반하는 360도 이미징 및 세로 pullback 수 있도록 두 가지 자동 모터 (회전과 translational) 사용합니다. 이미지 참조 11 허가와 함께 사용.
그림 2. nanosensor의 개략도 보여주는 프로 테아제 - 중재 활성화, Prosense/VM110. 참조 10 허가와 함께 사용 이미지.
그림 3. 생체내 및 전직의 생체내 플라크의 TBRs (배경 비율 목표 대)에서
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Discussion
염증 고위험 또는 취약 plaques은 심근 infarctions의 대부분에 대한 가능성이 책임이 있습니다. 이전 증상의 발병 이러한 plaques의 식별은 결과를 예측 의료 치료 지침 모두에 중요한 임상적 의미가 있습니다. 이러한 X - 선 혈관 조영술과 같은 기존의 관상 동맥 동맥 영상 modalities 일반적으로 luminal narrowings의 특성보다는 높은 위험, 보통이 아닌 stenotic 병변의 기본 생물 학적 프로파일을 계몽에 중점을두고 있습니다. Intravascular NIRF 분자 이미징은 파열하는 경향이 상패 이내에 활성 macrophages를 확인 nanosensors을 활용하여 상패 염증의 생물학을 통합함으로써 심장 catheterization 연구실 번역 방식, 염증 상패의 세포 특징을 제공합니다 9.
위에서 설명한 다음 프로토콜은 염증 플라크를 식별하는 혈관 조영술, IVUS와 NIRF 이미지를 결합 multimodal 통합 접근 방식을 활용합니다. 이 소설 2D NIRF의 카테터 혈액을 통해 분자 서명을 감지 가까운 적외선 형광 대역폭의 유리한 광학 특성에 capitalizes하고, 분자 이미징에 생체내 접근의 유망입니다. nanosensor Prosense/VM110는 780 nm의에서 fluroescence를 방출하고 proteolytic 절단 또는 효소 카텝신 B (매우 macrophages 주민 표현)에 의해 활성화의 부재에서 자동 담금질을 활용 fluorochromes하기 위해 결합합니다. NIRF의 카테터에 의해 생체내 형광 신호의 탐지는 대식 세포 - 라덴 상패의 식별 (TBR 2.9)을 수 있습니다. 예 생체내 형광 반사율 영상 (금)의 사용은 플라크 분야 (TBR 4.2) 내에서 NIR 형광 신호의 존재를 확인합니다. 카텝신 - B 긍정적인 macrophages (데이터가 표시되지 않음)의 강한 침투 확인 상패의 영역 내에서 RAM - 11 카텝신의 Immunohistochemical 염색법.
IVUS와 NIRF 신호의 설립은 선박 (데이터가 표시되지 않음)의 길이를 따라 보이는 상패 이내지도 신호 강도에 융합 더욱 luminal 플라크의 형태 및 대식 세포의 내용을 명료하게하다 수있는 독특한 기회를 제공하실 수 있습니다. 위의 기술의 현재 한계를 정확히 IVUS와 NIRF의 pullbacks 공동 등록하는 무능력을 포함합니다. 통합 이중 모달 카테터를 통해 동시 pullback 신호 위치의 정확도를 향상시키고 잠재적으로 혈관 벽 (예 : 루멘 내에서 신호의 깊이, 미디어, 또는 adventitia) 내에서 신호의 위치의 해상도를 사용합니다. 이중 모달 NIRF / IVUS 또는 NIRF / 광학 일관성 tomography (-10 월) 퓨전 카테터는 신호의 자세한 묘사를 제공하고 생물과 상패 아키텍처를 통합하는 것이 예상됩니다.
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Disclosures
FAJ - 전 컨설턴트, VisEn 의료, Honoraria, 보스턴 사이 언티픽
Acknowledgments
이 작품에 대한 지원이 보건 부여의 국립 연구소에서 제공한 # R01 HL 108,229, 미국 심장 협회 과학 개발 그랜트 # 0830352N, 하워드 휴즈 의학 연구소의 경력 개발 상, 브로드뷰 벤처, 유럽 공동체의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (부여 이하 FP7/2007-2013 계약 # 235689)와 MGH 윌리엄 슈라 이어 원정대.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prosense 750 | Visen Medical | VM110 | 500 nmol/kg IV injection |
| Heparin Sodium | APP Pharmaceuticals | 401586D | |
| Cephazolin | NovaPlus | 46015683 | |
| Lidocaine HCL 2% | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 | |
| Ketamine | Hospira Inc. | NDC 0409-2051-05 | |
| High Cholesterol Diet 1% | Research Diets | C30293 | |
| HIgh Cholesterol Diet 0.3% | Research Diets | C30255 |
References
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