Summary
We detail een nieuw nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) katheter voor twee-dimensionale intravasculaire moleculaire beeldvorming van plaque biologie
Protocol
In vivo diermodel: generatie van experimentele AortoIliac Atherosclerose
1) Baseline Angiografie en Balloon ontbossing en erosie
- Voorafgaand aan het verkrijgen baseline angiografie en ballon ontblooting, is een Nieuw-Zeelandse wit konijn gevoed met een hoog cholesterolgehalte (1%) dieet voor 1 week. Dit dier is gebruikt voor translationeel relevantie als 1) het aorto-iliacs schepen in konijnen zijn hetzelfde kaliber als de menselijke kransslagaders (2.5-3.5mm) en 2) de hyperlipidemie, ballon-letsel model genereert ontstoken atherosclerose met soortgelijke ontstekingscellen (macrofagen ) en moleculen (cathepsinen) als in de menselijke atherosclerose.
- Naar aanleiding van cholesterol voeding, het dier is verdoofd met propofol en ketamine. Een one-inch ventrale middellijn nek incisie wordt gemaakt met behulp van met behulp van een groot 15-scalpel. Met behulp van stompe dissectie technieken, is de spieren onder de fascia aan de rechterkant van de luchtpijp blootgesteld. De linker sternocephalicus spier is gescheiden langs de bindweefsel knooppunt, en de juiste gemeenschappelijke halsslagader wordt blootgesteld. De slagader is gescheiden van de nervus vagus. Proximale en distale hechtdraad lussen worden geplaatst op de slagader, zodat voor het terugtrekken en occlusie. A 1 tot 2 mm afgeschuinde arteriotomie wordt gemaakt waardoor een vijf Franse (buitendiameter 1.67mm) vasculaire schede wordt ingebracht en heparine (1000μ/mL, ~ 150units/kg) is intra-arterieel toegediend via de schede.
- Contrastvloeistof (Ultravist) wordt vervolgens geïnjecteerd (1 tot 2 ml) over een periode van 2 seconden tot een controle angiogram van de distale aorta en beide iliacale slagaders te verkrijgen.
- De iliofemoral slagaders en de aorta worden dan gewond raken door endotheliale denudatie. Met behulp van standaard methoden fluoroscopie, is een 3FR Fogarty embolectomie catheter geplaatst in het distale iliofemoral slagader en opgeblazen met 0,3 tot 0,5 cc van het contrast (50% contrast/50% zoutoplossing) of lucht. De katheter wordt dan proximaal teruggetrokken in zijn opgeblazen toestand een afstand langs de rechter iliacale en distale aorta tot aan de take-off van de linker nierslagader. Naar aanleiding van de ballon denudatie, is angiografie herhaald om vat doorgankelijkheid document. Na de angiografie, alle katheters en scheden zijn verwijderd en de proximale juiste gemeenschappelijke halsslagader wordt geligeerd, worden de spieren en fascia gehecht met een 4 / 0 resorbeerbaar garen, en de huid incisie gesloten met een 4 / 0 niet-resorbeerbare hechtdraad.
- Het dier is dan toegestaan om te herstellen met de toediening van een dosis antibiotica (Cephazolin, 0,5 gram IM). Pijnstillers, inclusief 0,01 mg / kg buprenorfine IM (twee maal per dag als nodig). Dieren worden vervolgens voortgezet op 1% cholesterol gedurende 4 weken na de ballon denudatie. In week 5, zijn dieren overgebracht naar 0,3% cholesterol dieet.
Geïntegreerde multi-modale beeldvorming van Rabbit Atheromata
2) Labeling van proteolytisch actieve ontstoken plaque met behulp van injecteerbare nanosensor, angiografie, intravasculaire ultrasound (IVUS), en in vivo intravasculaire NIRF beeldvorming van Rabbit atheroma
- Acht weken na de ballon letsel en 24 uur voor beeldvorming, is het konijn geïnjecteerd met intraveneuze 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) via het oor ader.
- Vierentwintig uur na de injectie, de dieren worden verdoofd en arteriële toegang wordt verkregen via links gemeenschappelijke halsslagader (zie stap 1.2). Intra-arteriële heparine wordt toegediend (150 eenheden / kg). Baseline angiografie wordt verkregen als hierboven.
- Een IVUS catheter is geladen op een klinische kransslagader in staat is 0.014 inch draad en ingebracht in de schede. Met behulp van fluoroscopie, is de radiopake tip van de draad distaal gepositioneerd in de rechter bekkenslagader. De IVUS katheter wordt vervolgens gevorderd in het proximale bekkenslagader met behulp van een standaard klinische monorail techniek.
- Een 100 mm pullback is geïnitieerd en beelden worden vastgelegd. Longitudinale reconstructie van het schip wordt verkregen en luminale plaque is geïdentificeerd.
- De NIRF katheter 11,12 is geladen op de 0,014 inch draad (monorail systeem), en de katheter wordt zorgvuldig ingebracht in de schede en belichtingskop is distaal gepositioneerd in de juiste iliacale slagader.
- Meerdere geautomatiseerde pullbacks (1 mm / sec lengterichting pullback, 30 rondes per minuut) worden uitgevoerd en fluorescentie signalen binnen de zones van atherosclerose worden genoteerd. De beelden worden opgenomen en de verdere verwerking met de juiste schaal en windowing afhankelijk van het bereik van het signaal is bereikt.
3) Euthanasie en isolatie van ex vivo aorto-iliacale weefsel
- Euthanasie is bereikt met 1cc van euthanasie agent (oplossing van 390mg natrium-pentobarbital en 50 mg fenytoïne natrium), intraveneuze, enkele injectie.
- De arteriële boom is geperfuseerd met 0,9% fysiologische zoutoplossing tot de vena cava inferior is vrij van bloed. De atherosclerotische aorta en de slagaders zijn geïdentificeerd en vrij gesneden uit de omliggende weefsels. Bovendien hebben kleine 2 x 2 cm stukjes liver-, nier-, milt en het hart worden ook verkregen.
- Ex vivo NIRF beeldvorming met de intravasculaire NIRF beeldvorming catheter kan worden gedaan in dit stadium. Het schip is langwerpig en de NIRF katheter is opnieuw ingevoegd in proximale aorta totdat de belichtingskop is gepositioneerd op de juiste bekkenslagader of bifurcatie. Meerdere geautomatiseerde pullbacks worden uitgevoerd zoals hierboven (zie 2.6).
4) Ex vivo Fluorescentie reflectie Imaging (vrij) van ontleed aorta en de slagaders
- Ontleed weefsel wordt geplaatst in 10-20 cc fysiologische zoutoplossing en vervoerd voor vrij analyses (Kodak Image Station 4000mm Pro, Carestream Health, Inc.)
- Aorta, iliacale schepen zijn verlengd te benaderen real-time lengtes en beelden worden verkregen bij verschillende golflengten [wit licht, groen fluorescent kanaal (ex 495 nm, 515 nm em), Cy5 (ex-565 nm, 670 nm em) en Cy7 (ex 650 nm, 760 nm em)] kanalen. Een reeks van de blootstelling tijden worden gebruikt voor elke golflengte (0,1-30sec) en verworven afbeeldingen worden geëxporteerd als DICOM of 16-bit ongeschaald TIFF-bestanden voor verdere analyse. Als positieve en negatieve controles, zijn organen (lever, milt, nieren en hart) afgebeeld op vergelijkbare kanalen en belichtingstijden.
- Gebieden van verhoogde signaal in het nabij-infrarode kanaal (780nm +) worden vermeld in atherosclerotische bloedvaten.
5) Tissue Inbedding voor het snijden en immunohistochemische analyse
- Gebieden van normale (niet-beschadigde weefsel, dat wil zeggen links bekkenslagader) en gebieden van de plaque worden geïdentificeerd en kleine 5-10 mm ringen van het weefsel zijn ingebed in OCT (Optimal Cutting Temperature) media. Blokken worden opgeslagen bij -80 C tot snijden.
- Standaard technieken voor het snijden en immunohistochemische analyses worden uitgevoerd. Hematoxyline en eosine kleuring, Ram-11 en Cathepsine B vlekken worden uitgevoerd.
Analyses en integratie van multimodale beelden (angiografie, IVUS, NIRF en vrij)
6) Verwerking van NIRF en vrij beelden
- DICOM-bestanden met beeldgegevens van NIRF en vrij (genomen op nabij-infrarood 780 nm kanaal) pullbacks worden verwerkt met behulp van MATLAB en Osirix software, respectievelijk. De juiste window tot een volledige reeks van het signaal intensiteit display is bereikt. Uiteindelijke beelden worden geëxporteerd als TIFF-bestanden.
- Bestanden worden geïmporteerd in de standaard image processing software (Keynote kan worden gebruikt). Beelden worden afgestemd op basis van referentiepunten (dat wil zeggen wervels op angiogram, iliacale bifurcatie, en renale arterie). Gebieden van de normale schepen en plaque worden geïdentificeerd.
- Regio's van interest (ROI) worden handmatig opgespoord (voor normaal weefsel en gebieden van plaque) en het gemiddelde signaal intensiteiten worden verkregen met behulp van Osirix en MATLAB respectievelijk, voor zowel vrij en NIRF beelden. Het begeleiden juiste tracing, is de longitudinale IVUS beeld van het vaartuig dat wordt gebruikt en de identificatie van de normale schip en plaque zijn gemakkelijk te herkennen.
- Target-tot achtergrond (TBR) ratio's zijn berekend voor plaque zones.
Representatieve resultaten:
Na voltooiing van bovengenoemde protocol, kunnen we identificeren en karakteriseren gebied van augmented cathepsine protease activiteit bij inflammatoire plaque in de aorta en iliacale vaten. Injectie van een activeerbare nanosensor (Prosense/VM110) stelt ons in staat te identificeren proteolytisch actief plaque. Deze verschijnen als heldere of het signaal intense zones als beeld gebracht met behulp van vrij in het nabije infrarood kanaal (750 nm). De NIRF pullbacks correleren met een verhoogde signaal intensiteit met vrij en uitlijningen met IVUS die anatomische registratie van NIRF signalen mogelijk te maken. Berekend plaque TBR's verkregen uit Vrij en NIRF waren vergelijkbaar (zie figuur 3: de gemiddelde NIRF TBR 4,2, betekent vrij TBR 2.9). Immunohistochemische analyse van heldere plaque bevestigt intense aanwezigheid van RAM-11 en Cathepsine B-activiteit op het gebied van de plaque (gegevens niet getoond).
Figuur 1. Schematische weergave van 2D-NIRF katheter Om het klinisch potentieel van een 1D NIRF sensing benadering van 6 uit te breiden, bouwden we een nieuwe 2-D NIRF-katheter voor intravasculaire beeldvorming. 11,12 De custom-built katheter bestaat uit een optische vezel (125 micron diameter gehuisvest in polyethyleen buis: 2.9F) dat verlicht met behulp van een 750 nm laser excitatie bron. Laserlicht wordt uitgezonden op een hoek van 90 graden ten opzichte van glasvezel-as. Het systeem maakt gebruik van twee geautomatiseerde motoren (rotatie en translatie) om gelijktijdig 360 graden beeldvorming en longitudinale pullback in staat te stellen ware 2D-beeldvorming te verkrijgen. Beelden worden gebruikt met toestemming van referentie 11.
Figuur 2. Schematische demonstreren protease-gemedieerde activering van de nanosensor, Prosense/VM110. Afbeelding gebruikt met toestemming van referentie 10.
Figuur 3. In vivo en ex vivo Plaque TBRs (target-tot achtergrond ratio's)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ontstoken hoog risico of kwetsbare plaques zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het grootste deel van hartinfarcten. De identificatie van dergelijke plaques voorafgaand aan de aanvang van de symptomen heeft belangrijke klinische implicaties, zowel in het voorspellen van de resultaten en het begeleiden van medische therapie. Conventionele coronaire arteriële beeldvormende technieken, zoals x-ray angiografie meestal gericht op de karakterisering van luminaal vernauwingen in plaats van het verlichten van de onderliggende biologische profielen van hoog-risico, meestal niet-stenotische laesies. Intravasculaire NIRF moleculaire beeldvorming biedt een hartkatheterisatie laboratorium vertaalbare aanpak die de biologie van plaque ontsteking bevat door gebruik te maken nanosensoren die actief macrofagen te identificeren binnen plaque, een cellulair kenmerk van een ontstoken plaque gevoelig voor scheuren. 9
Het volgende protocol hierboven beschreven maakt gebruik van een multimodale geïntegreerde benadering te combineren angiografie, IVUS en NIRF beeldvorming van ontstoken plaque te identificeren. Deze nieuwe 2D NIRF katheter speelt in op de gunstige optische eigenschappen van het nabij-infrarood fluorescentie bandbreedte om moleculaire signaturen te detecteren door middel van bloed, en is een veelbelovende in vivo benadering voor de moleculaire beeldvorming. De nanosensor Prosense/VM110 is gekoppeld aan fluorochromen dat fluroescence uitzenden op 780 nm en gebruik maken van auto-quenching in de afwezigheid van proteolytische splitsing of activering door het enzym cathepsine B (hoog tot expressie in ingezeten macrofagen). Detectie van in vivo fluorescentie-signaal door de NIRF catheter kan de identificatie van de macrofaag-beladen plaque (TBR 2.9). Het gebruik van ex vivo fluorescentie reflectie imaging (vrij) bevestigt de aanwezigheid van NIR fluorescentie-signaal in gebieden van de plaque (TBR 4.2). Immunohistochemische kleuring van het RAM-11 en cathepsine in gebieden van plaque bevestigen de intense infiltratie van cathepsine-B positieve macrofagen (gegevens niet getoond).
De integratie van IVUS en NIRF signaal kan worden gefuseerd aan kaart intensiteit van het signaal binnen zichtbare plaque langs de lengte van het schip (gegevens niet getoond) en biedt een unieke kans om verder te ontrafelen luminale plaque morfologie en macrofagen content. Huidige beperkingen van de bovenstaande techniek onder meer het onvermogen om precies co-registratie van de IVUS en NIRF pullbacks. Gelijktijdige pullback via een geïntegreerde dual-modale katheter zou de nauwkeurigheid van het signaal plaats en mogelijk in staat stellen resolutie van de locatie van het signaal binnen de vaatwand (dat wil zeggen de diepte van het signaal binnen lumen, media of adventitia). Dual modale NIRF / IVUS of NIRF / optische coherentie tomografie (OCT) fusie katheters zijn daarom naar verwachting verdere afbakening van het signaal geven en plaque architectuur nemen met biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
FAJ - Voormalig Consultant, VisEn Medical, honoraria, Boston Scientific
Acknowledgments
Steun voor dit werk werd verzorgd door National Institutes of Health subsidie # R01 HL 108229, American Heart Association Scientist Development Grant # 0830352N, Howard Hughes Medical Institute Career Development Award, Broadview Ventures, zevende Europese Gemeenschap Programme (FP7/2007-2013 onder subsidieovereenkomst overeenkomst # 235689), en de MGH William Schreyer Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prosense 750 | Visen Medical | VM110 | 500 nmol/kg IV injection |
| Heparin Sodium | APP Pharmaceuticals | 401586D | |
| Cephazolin | NovaPlus | 46015683 | |
| Lidocaine HCL 2% | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 | |
| Ketamine | Hospira Inc. | NDC 0409-2051-05 | |
| High Cholesterol Diet 1% | Research Diets | C30293 | |
| HIgh Cholesterol Diet 0.3% | Research Diets | C30255 |
References
- Andersson, J., Libby, P. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).
- Calfon, M. A., Vinegoni, C. Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques. Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).
- Chen, J., Tung, C. -H. In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis. Circulation. 105, 2766-2771 (2002).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Molecular Imaging of Cardiovascular Disease. Circulation. 116, 1052-1061 (2007).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).
- Jaffer, F. A., Vinegoni, C. Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis. Circulation. 118, 1802-1809 (2008).
- Kim, D. -E., Kim, J. -Y. Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Naghavi, M., Libby, P. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation. 108, 1664-1672 (2003).
- Weissleder, R., Tung, C. -H. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).
- Razansky, R. N., Rosenthal, A. Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo. Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).
- Jaffer, F. A., Calfon, M. A. Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury. Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).
