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Medicine

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) intravaskuläre Molecular Imaging von entzündlichen Plaque, einen multimodalen Ansatz, um Imaging der Atherosklerose

doi: 10.3791/2257 Published: August 4, 2011

Summary

Wir Detail eines neuen Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Katheter für die 2-dimensionale intravaskulären molekulare Bildgebung von Plaque Biologie

Abstract

Die vaskuläre Reaktion auf eine Verletzung ist eine gut orchestrierte Entzündungsreaktion durch die Akkumulation von Makrophagen innerhalb der Gefäßwand führt zu einer Akkumulation von Lipid-beladenen intra-luminale Plaque, die Proliferation glatter Muskelzellen und progressive Verengung des Gefäßlumens ausgelöst. Die Bildung solcher Plaques neigen zum Bruch zugrunde liegt die Mehrzahl der Fälle von akutem Myokardinfarkt. Die komplexen molekularen und zellulären inflammatorischen Kaskade wird durch die Rekrutierung von T-Lymphozyten und Makrophagen und ihre parakrine Effekte auf Endothel-und glatten Muskelzellen orchestriert. 1

Molekulare Bildgebung in der Atherosklerose hat sich zu einem wichtigen klinischen und Recherche-Tool, dass in vivo Visualisierung der Entzündung und andere biologische Prozesse ermöglicht entwickelt. Mehrere Beispiele aus jüngster Zeit zeigen, die Fähigkeit, mit hohem Risiko Plaques bei Patienten zu erkennen und die Auswirkungen der pharmacotherapeutics in Atherosklerose. 4. Während eine Reihe von molekularen Bildgebung Ansätze (insbesondere MRT und PET) können Bild-biologische Aspekte der großen Gefäße wie der A. carotis Arterien, kaum Möglichkeiten gibt es für die Bildgebung der Koronararterien. 2 Das Aufkommen der hochauflösenden optischen Bildgebung Strategien, insbesondere Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF), mit aktivierbaren fluoreszierenden Sonden gekoppelt, haben eine erhöhte Empfindlichkeit und führte zur Entwicklung neuer Strategien intravaskulären zur Verbesserung der biologischen Bildgebung des menschlichen koronaren Atherosklerose.

Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) molekulare Bildgebung nutzt Anregungslicht mit einer definierten Bandbreite (650 bis 900 nm) als Quelle für Photonen, die, wenn eine optische Kontrastmittel oder fluoreszierende Sonde geliefert, emittiert Fluoreszenz im NIR-Fenster, die erkannt werden können mit einem geeigneten Emissionsfilter und eine hohe Empfindlichkeit charge-coupled-Kamera. Im Gegensatz zu sichtbarem Licht dagegen dringt NIR-Licht tief ins Gewebe, ist deutlich weniger gedämpft durch endogene Photonen-Absorber wie Hämoglobin, Lipide und Wasser und ermöglicht eine hohe Ziel-Rausch-Verhältnis durch reduzierte Autofluoreszenz in der NIR-Fenster. Imaging in der NIR-"Fenster" kann erheblich verbessern das Potenzial für in-vivo-Bildgebung. 2,5

Entzündliche Cystein-Proteasen wurden gut untersucht mit aktivierbaren NIRF-Sonden 10 und spielen eine wichtige Rolle in der Atherogenese. Via Abbau der extrazellulären Matrix, beitragen Cysteinproteasen wichtiger, um das Fortschreiten und Komplikationen der Arteriosklerose 8. Vor allem die Cystein-Protease, Cathepsin B, hoch exprimiert und kolokalisiert mit Makrophagen in der experimentellen murinen, Kaninchen und Menschen Atherome. 3,6,7 Darüber hinaus können Cathepsin B Aktivität in Plaques in vivo unter Verwendung eines zuvor beschriebenen 1 erfasst werden -D intravaskulären Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Technik 6 in Verbindung mit einem injizierbaren Nanosensor Mittel, das aus einem Poly-Lysin Polymerrückgrat derivatisiert mit mehreren NIR Fluorochrome (VM110/Prosense750, ex / em 750/780nm, VisEn Medical, Boston, MA) besteht aus dass die Ergebnisse in starke intramolekulare Abschrecken bei Studienbeginn. 10 Nach gezielte enzymatische Spaltung von Cystein-Proteasen, wie Cathepsin B (bekannt mit Plaque-Makrophagen kolokalisiert), der Fluorochrome zu trennen, was zu erheblichen Verstärkung der NIRF Signal. Intravaskuläre Erkennung von NIR Fluoreszenz-Signal durch den Einsatz neuartiger 2D intravaskulären NIRF Katheter ermöglicht nun hochauflösende, geometrisch exakte in vivo Detektion von Cathepsin B Aktivität in entzündeten Plaque.

In vivo molekulare Bildgebung der Atherosklerose mit Katheter-basierte 2D-Bildgebung NIRF, als auf einen Stand der 1-D-spektroskopischen Ansatz gegenüber, ist 6 ein neuartiger und vielversprechender Tool, das Augmented-Protease-Aktivität nutzt in Makrophagen-reichen Plakette Gefäßentzündung zu erkennen. 11,12 Folgende Forschungs-Protokoll beschreibt die Verwendung eines intravaskulären 2-dimensionalen NIRF Katheter Bild und charakterisieren Plaque-Struktur unter Verwendung von zentralen Aspekten der Plaque Biologie. Es ist ein übersetzbar Plattform, wenn sie mit bestehenden klinischen Imaging-Technologien, einschließlich Angiographie und intravaskulären Ultraschall (IVUS) integriert und bietet ein einzigartiges und neuartiges integrierte multimodale molekulare Bildgebung, die entzündliche Atherome unterscheidet, und ermöglicht den Nachweis von intravaskulären NIRF-Signale in menschliche Größe Koronararterien .

Protocol

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In-vivo-Tiermodell: Generation of Experimental aortoiliakalen Atherosklerose

1) Baseline-Angiographie und Ballondenudation

  1. Vor Erhalt Baseline-Angiographie und Ballondenudation, ist eine weiße Neuseeland-Kaninchen eine hohe Cholesterinwerte (1%) Ernährung für 1 Woche gefüttert. Dieses Tier ist für translationale Relevanz als 1 eingesetzt) ​​die aorto-iliacs Schiffe bei Kaninchen sind die gleichen Kaliber wie die menschliche Koronararterien (2,5-3.5mm) und 2) die hyperlipämischen, Ballon-Verletzung Modell generiert entzündeten Atherosklerose Lager ähnlich Entzündungszellen (Makrophagen ) und Molekülen (Cathepsine) als in der menschlichen Atherosklerose.
  2. Nach Cholesterin Ernährung, wird das Tier narkotisiert mit Propofol und Ketamin. Eine Ein-Zoll-ventralen Mittellinie Hals Einschnitt erfolgt über mit einer Größe 15-Skalpell. Mit stumpf-Techniken, die Muskeln unterhalb der Faszie auf der rechten Seite der Luftröhre freigelegt. Die linke sternocephalicus Muskel entlang ihres Bindegewebes Übergang getrennt, und die rechte Arteria carotis communis ausgesetzt ist. Die Arterie wird vom Nervus Vagus getrennt. Proximale und distale Naht-Schleifen sind auf der Arterie positioniert, um für den Rückzug und Okklusion zu ermöglichen. A 1 bis 2 mm abgeschrägt Arteriotomie wird, durch die ein 5 Französisch (Außendurchmesser 1.67mm) Gefäßscheide eingelegt ist und Heparin (1000μ/mL, ~ 150units/kg) ist intraarteriell über die Scheide verabreicht werden.
  3. Kontrastmittel (Ultravist) wird dann injiziert (1 bis 2 ml) über einen 2 Sekunden Zeit, um eine Steuerung Angiogramm der distalen Aorta und beide Beckenarterien zu erhalten.
  4. Die iliofemorale Arterien und der Aorta werden dann durch endotheliale Denudation verletzt. Mit Standard-Durchleuchtung Verfahren ist eine 3FR Fogarty Embolektomie Katheter in die distalen iliofemorale Arterie platziert und aufgeblasen mit 0,3 bis 0,5 ccm Gegensatz (50% contrast/50% iger Kochsalzlösung) oder in der Luft. Der Katheter wird dann proximal im aufgeblasenen Zustand zurückgenommen einem Abstand entlang der rechten Beckenkamm und distalen Aorta bis zum take-off der linken Nierenarterie. Nach der Ballondenudation, ist die Angiographie wiederholt werden, um Schiff Durchgängigkeit Dokument. Nach Angiographie, alle Katheter und Schleusen entfernt werden und der proximalen rechten Arteria carotis communis ligiert werden die Muskeln und Faszien mit einer 4 / 0 resorbierbares Nahtmaterial vernäht, und der Hautschnitt verschlossen mit einem 4 / 0 nicht-resorbierbares Nahtmaterial.
  5. Das Tier ist dann erlaubt, mit Verabreichung einer einzigen Dosis Antibiotika (Cefazolin, 0,5 Gramm IM) zu erholen. Schmerzmittel einschließlich 0,01 mg / kg Buprenorphin IM (zweimal täglich je nach Bedarf). Die Tiere werden dann auf 1% Cholesterin für 4 Wochen post-Ballondenudation fortgesetzt. In Woche 5, werden die Tiere auf 0,3% Cholesterin-Diät umgestellt.

Integrierte Multi-modal Imaging von Rabbit Atherome

2) Kennzeichnung von proteolytisch aktiv entzündeten Plaque mit injizierbaren Nanosensor; Angiographie, intravaskulären Ultraschall (IVUS) und in vivo intravaskuläre NIRF Abbildung von Kaninchen Atherom

  1. Acht Wochen nach der Ballon-Verletzung und 24 Stunden vor der Bildgebung, ist das Kaninchen mit intravenöser 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) über Ohrvene injiziert.
  2. Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion werden die Tiere betäubt und arterieller Zugang ist über linken Arteria carotis communis erhalten (siehe Schritt 1.2). Intra-arterielle Heparin verabreicht wird (150 Einheiten / kg). Baseline-Angiographie ist wie oben erhalten.
  3. Ein IVUS-Katheter wird auf eine klinische koronare Lage 0,014 Zoll Draht geladen und in die Scheide. Mit Durchleuchtungskontrolle wird die röntgendichte Spitze des Drahtes distal in die rechte A. iliaca positioniert. Die IVUS-Katheter wird dann in der proximalen A. iliaca mit einem Standard-klinischen Monorail-Technik fortgeschritten.
  4. Ein 100 mm Pullback wird initiiert und Bilder aufgenommen wurden. Longitudinal Rekonstruktion des Schiffes erhalten und luminalen Plaque identifiziert wird.
  5. Die NIRF Katheter 11,12 auf das 0,014 Zoll Draht (Monorail-System) geladen, und der Katheter wird vorsichtig in die Scheide und Imaging-Kopf eingefügt wird distal in die rechte A. iliaca positioniert.
  6. Mehrere automatische Pullbacks (1 mm / sec Längs Pullback, 30 Schuss pro Minute) durchgeführt und die Fluoreszenz-Signale innerhalb der Zonen der Atherosklerose werden zur Kenntnis genommen. Die Bilder werden aufgezeichnet und die weitere Verarbeitung mit entsprechender Skalierung und Fenstertechnik auf den Messbereich des Signals erreicht.

3) Euthanasie und Isolierung von ex vivo aortoiliakalen Gewebe

  1. Euthanasie ist mit 1cc der Euthanasie-Agent (Lösung von 390mg Natrium-Pentobarbital und 50mg Phenytoin-Natrium), intravenös, einzelne Injektion erreicht.
  2. Die arterielle Baum ist mit 0,9% Kochsalzlösung perfundiert, bis die untere Hohlvene ist klar, von Blut. Die atherosklerotischen Aorta und Beckenarterien werden identifiziert und freipräpariert aus dem umgebenden Gewebe. Darüber hinaus kleine 2 x 2 cm große Stücke von liver, Niere, Milz und Herz sind auch erhalten.
  3. Ex vivo NIRF Bildgebung mit der intravaskulären Bildgebung NIRF Katheter kann in dieser Phase durchgeführt werden. Das Schiff ist länglich und die NIRF Katheter wird in proximalen Aorta wieder eingesetzt, bis das Imaging-Kopf auf der rechten A. iliaca oder Bifurkation positioniert ist. Mehrere automatische Pullbacks wie oben ausgeführt (siehe 2.6).

4) Ex vivo Fluoreszenz-Imaging Reflexion (FRI) der sezierten Aorta und Beckenarterien

  1. Dissected Gewebe wird in 10-20 ccm physiologischer Kochsalzlösung gelegt und transportiert für Fri-Analysen (Kodak Image Station 4000mm Pro, Carestream Health, Inc.).
  2. Aorta, Iliakalgefäße sind ungefähre Echtzeit Längen gestreckt und Bilder sind bei mehreren Wellenlängen [weißes Licht, grün fluoreszierende Kanal (ex 495 nm, em 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, em 670 nm) und Cy7 (ex erhalten 650 nm, em 760 nm)] Kanäle. Eine Reihe von Belichtungszeiten sind für jede Wellenlänge genutzt (0,1-30sec) und aufgenommenen Bilder werden im DICOM-oder 16-Bit-TIFF-Dateien unscaled für weitere Analysen exportiert. Als positive und negative Kontrollen sind Organe (Leber, Milz, Niere und Herz) bei ähnlichen Kanälen und Belichtungszeiten abgebildet.
  3. Bereiche mit erhöhtem Signal in der Nah-Infrarot-Kanal (780nm +) sind in atherosklerotischen Arterien festgestellt.

5) Tissue Embedding für Schneid-und immunhistochemische Analyse

  1. Bereiche der normalen (nicht verletzten Gewebe, dh links iliaca) und Bereiche der Plaque identifiziert und kleinen 5-10 mm Ringe von Gewebe in OCT (Optimal Cutting Temperature) Medien eingebettet. Blöcke werden bei -80 C bis zum Schneiden aufbewahrt.
  2. Standard-Techniken für das Schneiden und immunhistochemische Analysen durchgeführt werden. Hämatoxylin und Eosin-Färbung, Ram-11 und Cathepsin B-Färbung durchgeführt werden.

Analysen und Integration von multi-modalen Images (Angiographie, IVUS, NIRF und FRI)

6) Die Verarbeitung von NIRF und FR Bilder

  1. DICOM-Dateien, die Bilddaten aus den NIRF und FR (aufgenommen am nahen Infrarot 780 nm-Kanal) Pullbacks verarbeitet mit MATLAB und OsiriX Software, bzw.. Proper Windowing zum gesamten Spektrum der Signalintensität Display erreicht ist. Abschließende Bilder werden als TIFF-Dateien exportiert.
  2. Die Dateien werden in Standard-Bildverarbeitungssoftware (Keynote verwendet werden kann) importiert. Die Bilder werden auf der Grundlage Bezugspunkte (dh Wirbel auf Angiogramm, iliakalen Bifurkation und Nierenarterie) ausgerichtet. Bereiche der normalen Schiff und Plaque identifiziert werden.
  3. Regions of Interest (ROI) werden manuell zurückgeführt (für normales Gewebe und Bereiche von Plaque) und mittlere Signalintensitäten erworben werden, mit OsiriX und MATLAB, jeweils für beide FR und NIRF Bilder. Als Orientierungshilfe für angemessene Rückverfolgung, ist die Längs-IVUS Bild des Schiffes verwendet wird und die Identifizierung der normalen Schiff und Plaque sind leicht zu identifizieren.
  4. Target-to Hintergrund (TBR) Verhältnisse sind für die Plaque-Zonen berechnet.

Repräsentative Ergebnisse:

Nach Abschluss der oben genannten Protokoll, können wir identifizieren und zu charakterisieren Bereichen Augmented Cathepsin Protease-Aktivität in entzündlichen Plaques in der Aorta und Iliakalgefäße. Die Injektion von einer aktivierbaren Nanosensor (Prosense/VM110) ermöglicht es uns, proteolytisch aktiven Plaque zu identifizieren. Diese erscheinen als helle oder Signal intensive Zonen, wenn aufgenommen mit FR im nahen Infrarot-Kanal (750 nm). Die NIRF Pullbacks korrelieren mit einer erhöhten Signalintensität durch FR und Ausrichtungen mit IVUS die anatomische Registrierung von NIRF-Signale ermöglichen. Berechnet Plaque TBR ist von FR und NIRF erhalten waren ähnlich (siehe Abbildung 3: Mittelwert NIRF TBR 4,2, bedeutet fr TBR 2,9). Immunhistochemische Analyse der hellen Plaque bestätigt intensive Präsenz von RAM-11 und Cathepsin B Aktivität in Bereichen von Plaque (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der 2D-NIRF Katheters an die klinische Potenzial eines 1D NIRF sensing Ansatz 6 erstrecken, konstruierten wir eine neuartige 2-D NIRF-Katheter zur intravaskulären Bildgebung. 11,12 Die custom-built-Katheter besteht aus einer optischen Faser (125 Mikron Durchmesser untergebracht in Polyethylen-Rohr: 2.9F), die leuchtet, mit einem 750 nm Laser Anregungsquelle. Laserlicht wird in einem 90 Grad Winkel zur Faserachse emittiert. Das System nutzt zwei automatisierte Motoren (Rotations-und Translationsenergie), um die gleichzeitige 360-Grad-Imaging-und Längs-Pullback zu ermöglichen, echte 2D-Bildgebung zu erhalten. Bilder mit Genehmigung aus Lit. 11 verwendet.

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische zeigt Protease-vermittelte Aktivierung des Nanosensor, Prosense/VM110. Bild mit Genehmigung aus Lit. 10 verwendet.

Tabelle 1 Abbildung 3. In vivo und ex vivo Plaque TBRs (target-to Hintergrund-Verhältnisse)

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Discussion

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Entzündete Hochrisiko-oder vulnerable Plaques sind wahrscheinlich verantwortlich für die Mehrzahl der Herzinfarkte. Die Identifikation solcher Plaques vor Auftreten der Symptome hat wichtige klinische Implikationen sowohl in Prognosen zu erstellen und Führung der medizinischen Therapie. Konventionelle koronararteriellen bildgebenden Verfahren wie Röntgen-Angiographie in der Regel auf die Charakterisierung der luminalen Verengungen als Beleuchtung der zugrunde liegenden biologischen Profilen mit hohem Risiko, in der Regel nicht stenotischen Läsionen zu konzentrieren. Intravaskuläre NIRF molekulare Bildgebung bietet eine Herzkatheterlabor übersetzbar Ansatz, der die Biologie der Plaque Entzündung enthält durch Ausnutzung Nanosensoren, dass aktive Makrophagen identifizieren innerhalb Plaque, ein zelluläres Merkmal eines entzündeten Plaque anfällig für Bruch. 9

Das folgende Protokoll skizzierten nutzt einen multimodalen integrativen Ansatz, der Angiographie, IVUS und NIRF Bildgebung entzündeten Plaque zu identifizieren. Diese neuartige 2D NIRF Katheter nutzt die günstigen optischen Eigenschaften der Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Bandbreite, um molekulare Signaturen durch Blut erkennen und ist eine vielversprechende in-vivo-Ansatz zur molekularen Bildgebung. Die Nanosensor Prosense/VM110 ist Fluorochrome fluroescence emittieren bei 780 nm und nutzen auto-Abschrecken in Abwesenheit der proteolytischen Spaltung oder Aktivierung durch das Enzym Cathepsin B (hoch in Makrophagen exprimiert) gekoppelt. Detektion von in vivo Fluoreszenz-Signal durch die NIRF Katheter ermöglicht die Identifizierung von Makrophagen-beladenen Plaque (TBR 2,9). Die Verwendung von ex vivo Fluoreszenz-Imaging-Reflexion (FRI) bestätigt das Vorhandensein von NIR Fluoreszenz-Signal in Bereichen von Plaque (TBR 4,2). Immunhistochemische Färbung von RAM-11 und Cathepsin im Bereich der Plaque bestätigen die intensive Infiltration von Cathepsin-B-positive Makrophagen (Daten nicht gezeigt).

Der Einbau von IVUS und NIRF Signal kann zur Karte Signalintensität innerhalb sichtbare Plaque entlang der Länge des Schiffes (Daten nicht gezeigt) fusioniert und bietet eine einzigartige Gelegenheit zur weiteren Erläuterung luminalen Plaquemorphologie und Makrophagen Inhalt. Aktuelle Einschränkungen der oben genannten Technik auch die Unfähigkeit, genau Co-Registrierung der IVUS und NIRF Pullbacks. Gleichzeitige Pullback über einen integrierten Dual-modal Katheter würde die Genauigkeit des Signals Lage und potentiell ermöglichen Auflösung des Standortes des Signals innerhalb Gefäßwand (dh die Tiefe des Signals innerhalb Lumen, Medien oder Adventitia). Dual-modal NIRF / IVUS oder NIRF / optische Kohärenztomographie (OCT) Fusion Katheter sind daher zur weiteren Abgrenzung der Signal liefern und integrieren Plaque-Architektur mit Biologie zu erwarten.

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Disclosures

FAJ - Der ehemalige Berater, VisEn Medical; Honorare, Boston Scientific

Acknowledgments

Unterstützung für diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschuss # R01 HL 108229, American Heart Association Scientist Development Grant # 0830352N, Howard Hughes Medical Institute Career Development Award, Broadview Ventures, Europäische Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013 unter dem Förderkennzeichen Vereinbarung # 235689) und die MGH William Schreyer Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prosense 750 Visen Medical VM110 500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium APP Pharmaceuticals 401586D
Cephazolin NovaPlus 46015683
Lidocaine HCL 2% Hospira Inc. NDC 0409-4277-01
Buprenorphine Bedford Laboratories NDC 55390-100-10
Ketamine Hospira Inc. NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1% Research Diets C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3% Research Diets C30255

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References

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<em>In vivo</em> Near Infrared Fluorescence (NIRF) intravaskuläre Molecular Imaging von entzündlichen Plaque, einen multimodalen Ansatz, um Imaging der Atherosklerose
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Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).More

Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).

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