Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

В естественных условиях ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) внутрисосудистого молекулярной визуализации воспалительных Зубной налет, мультимодальный подход к изображений атеросклероза

doi: 10.3791/2257 Published: August 4, 2011

Summary

Мы подробно нового ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) катетер для 2-мерных внутрисосудистого молекулярной визуализации налета биологии

Protocol

В модели животных онлайне: Поколение экспериментальной Атеросклероз аортоподвздошный

1) Базовый Ангиография и воздушных шаров Денудация

  1. До получения базовых ангиографии и воздушный шар денудации, Новой Зеландии белый кролик питается высокий уровень холестерина (1%) диета в течение 1 недели. Это животное используется для поступательного отношение, как 1) аорто-iliacs судов в кролики же калибра, как человеческие коронарных артерий (2,5 3,5 мм) и 2) гиперлипидемией, воздушный шар травмы модель порождает воспаленной атеросклероза подшипников аналогичного воспалительных клеток (макрофагов ) и молекул (катепсины), как в человека атеросклероза.
  2. После холестерина кормления животных под наркозом с пропофола и кетамина. Один дюйм вентральный вырез шеи средней линии осуществляется с помощью использования размера 15-лезвие скальпеля. Использование методов тупой диссекции, мышц под фасции на правой стороне трахеи подвергается. Левая мышца sternocephalicus отделяется вдоль ее соединительной ткани соединения, а правой общей сонной артерии подвергается. Артерии отделяется от блуждающего нерва. Проксимального и дистального петли шва располагаются на артерии, чтобы обеспечить опровержение и окклюзии. От 1 до 2 мм скошенные arteriotomy производится через который 5 французских (наружный диаметр 1.67mm) сосудистой оболочки вставляется и гепарин (1000μ/mL, ~ 150units/kg) вводят внутри-arterially через оболочку.
  3. Контрастность красителя (Ультравист) затем вводят (от 1 до 2 мл) в течение 2 Второй период для получения контроля ангиограмма дистальной аорты и оба подвздошных артерий.
  4. Iliofemoral артерий и аорты, затем ранения в результате денудации эндотелия. Используя стандартные методы рентгеноскопии, 3FR катетер Фогарти эмболэктомия помещается в дистальной iliofemoral артерии и надуваются от 0,3 до 0,5 мл контраста (50% contrast/50% раствора) или по воздуху. Катетер затем отозвано проксимально в наполненном состоянии расстояние вдоль правой подвздошной и дистальной аорты до взлета левой почечной артерии. После шар денудации, ангиография повторяется в документе судна проходимости. После ангиографии, все катетеры и оболочки удаляются и проксимальных правой общей сонной артерии лигируют, мышцы и фасции зашивается с 4 / 0 рассасывающиеся нити, а разрез кожи закрыты с 4 / 0, не рассасывающиеся нити.
  5. Животное затем позволили восстановить с администрацией одну дозу антибиотиков (Cephazolin, 0,5 г IM). Боль лекарства в том числе 0,01 мг / кг бупренорфина IM (два раза в день по мере необходимости). Животные затем продолжил на 1% холестерина в течение 4 недель после шар денудации. На неделе 5, животные перешли на 0,3% холестерина диету.

Комплексная мультимодальных изображений Кролика Atheromata

2) Маркировка протеолитически активной воспаленными доска использованием инъекционного наносенсор, ангиография, внутрисосудистое ультразвуковое исследование (ВСУЗИ), и в естественных условиях внутрисосудистого NIRF изображений Кролик атеромы

  1. Восемь недель после травмы воздушный шар, и за 24 часа до обработки изображений, кролика вводят внутривенно 500 нмоль / кг Prosense/VM110 (PerkinElmer) через ухо вены.
  2. Двадцать четыре часа после инъекции, животных под наркозом и артериальной доступ получен с помощью левой общей сонной артерии (см. шаг 1.2). Внутриартериального гепарин вводят (150 ЕД / кг). Базовый ангиографии получается, что и выше.
  3. ВСУЗИ катетер загружается на клинические коронарной артерии способны 0,014 дюйм проволоки и вставляется в ножны. Использование флуороскопа, рентгеноконтрастный кончик провода расположены дистально в правой подвздошной артерии. ВСУЗИ катетер затем продвинулся в проксимальных подвздошной артерии с использованием стандартной техники клинических монорельсовая дорога.
  4. 100 мм откат по инициативе и изображения записываются. Продольные реконструкция судна получается и просвета доска выявлено.
  5. Катетер NIRF 11,12 загружается на 0,014 дюйм проволоки (монорельсовые системы), и катетер осторожно вставляется в ножны и обработки изображений головка располагается дистально в правой подвздошной артерии.
  6. Несколько автоматизированных откатах (1 мм / с продольными откат, 30 выстрелов в минуту) выполняются и флуоресценции сигналов в пределах зоны атеросклероза отмечаются. Изображения записываются и дальнейшей обработки с соответствующим масштабированием и оконной на основе спектра сигнала достигается.

3) Эвтаназия и изоляции бывших естественных аорто-подвздошных ткани

  1. Эвтаназия осуществляется с 1cc эвтаназии агента (решение 390mg натрия фенобарбитала и фенитоина 50 мг натрия), внутривенно, одной инъекции.
  2. Артериального дерева озарен 0,9% физиологического раствора до нижней полой вены ясно крови. Атеросклеротических артерий аорты и подвздошных были выявлены и расчлененных свободным от окружающих тканей. Кроме того, малые 2 х 2 см куски Liверсии, почки, селезенка и сердце, также получены.
  3. Экс естественных изображений с NIRF внутрисосудистого катетера NIRF изображения можно сделать на данном этапе. Судно удлиненные и катетер NIRF повторно вставлен в проксимальной аорты до визуализации головка располагается в правой подвздошной артерии или бифуркации. Несколько автоматизированных откатах выполняются как указано выше (см. п. 2.6).

4) Ex естественных условиях флуоресцентного отражения Imaging (ПТ) расчлененного аорты и подвздошных артерий

  1. Расчлененный ткани помещают в 10-20 мл физиологического раствора и транспортируется для анализа ПТ (Kodak Image станции 4000мм Pro, Carestream Health, Inc.)
  2. Аорты, сосудов подвздошной вытянуты приблизить реального времени длины и изображения, полученные при разных длинах волн [белый свет, зеленый флуоресцентный канал (бывший 495 нм, ет 515 нм), Cy5 (бывший 565 нм, ет 670 нм) и Cy7 (экс 650 нм, ет 760 нм)] каналов. Серия экспозиций используются для каждой длины волны (0.1-30сек) и полученные изображения экспортируются как DICOM или 16-битных TIFF-файлах немасштабированный для дальнейшего анализа. Как положительный и отрицательный контроль, органы (печень, селезенка, почки и сердце) изображаются на аналогичных каналов и экспозиции.
  3. Районы повышенного сигнала в ближней ИК-каналу (780 +) отмечены в атеросклеротических артериях.

5) Ткань для вложения Секционирование и иммуногистохимического анализа

  1. Области нормального (не поврежденных тканей, т.е. левая подвздошной артерии) и области зубного налета были выявлены и небольшие кольца 5-10 мм тканей, внедренных в октябре (оптимальная температура резка) средства массовой информации. Блоки хранятся при температуре -80 С до секционирования.
  2. Стандартные методы секционирования и иммуногистохимического анализа выполняются. Гематоксилином и эозином пятно, Рам-11 и B Катепсин окрашивания выполняются.

Анализ и интеграция мультимодальных изображений (ангиография, ВСУЗИ, NIRF и ПТ)

6) Обработка NIRF и ПТ изображений

  1. DICOM-файлов, содержащих изображения данных из NIRF и ЛИИ (приняты на ближней инфракрасной области 780 нм канал) откатах, обрабатываются с использованием MATLAB и Osirix программного обеспечения, соответственно. Правильное окон для отображения полного спектра интенсивности сигнала достигается. Заключительные экспорта изображений в виде файлов TIFF.
  2. Файлы импортируются в стандартное программное обеспечение для обработки изображений (основной могут быть использованы). Изображения выравниваются на основе опорных точек (например, позвонки на ангиографию, подвздошных бифуркации, и почечной артерии). Области нормальной судна и доска определены.
  3. Регионы интереса (ROI) вручную прослеживается (для нормальной ткани и области зубного налета) и средняя интенсивность сигнала приобретаются использованием MATLAB Osirix и, соответственно, для ПТ и NIRF изображений. Для руководства соответствующих отслеживание, продольные ВСУЗИ образ судно используется и определение нормальной судна и доска легко идентифицируются.
  4. Target-на фон (TBR) нормативы рассчитаны на доску зон.

Представитель Результаты:

По завершении выше протокола, мы можем выявить и охарактеризовать областях расширенной деятельности протеазы катепсина при воспалительных доска в аорте и подвздошных сосудов. Инъекция активируемые наносенсор (Prosense/VM110) позволяет определить протеолитически активной бляшки. Они появляются в виде ярких или сигнал интенсивной зон при использовании ПТ отображаемого в ближнем инфракрасном канале (750 нм). NIRF откатах коррелируют с повышенной интенсивностью сигнала на ПТ и выравнивания с ВСУЗИ, которые позволяют анатомические регистрации сигналов NIRF. Расчетная доска TBR, полученные от ПТ и NIRF были сходными (см. Рисунок 3: среднее NIRF TBR 4.2, означает пт TBR 2.9). Иммуногистохимический анализ ярких доска подтверждает интенсивное присутствие RAM-11 и B Катепсин деятельности в области зубного налета (данные не приведены).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема Катетер 2D NIRF Для расширения клинического потенциала 1D NIRF зондирования подход 6, мы построили новый 2-D NIRF-катетер для внутрисосудистого изображений. 11,12 заказ катетер состоит из оптического волокна (125 мкм диаметром размещалась в полиэтиленовой трубы: 2.9F), который освещает использованием 750 нм лазерный источник возбуждения. Лазерный луч света под углом 90 градусов относительно оси волокна. Система использует два автоматизированных двигателей (вращательное и поступательное), чтобы дать сопутствующей 360 изображений степени и продольных откат получить истинное 2D-изображений. Изображения, используемые с разрешения ссылку 11.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема демонстрирует протеазы-опосредованной активации наносенсор, Prosense/VM110. Изображение используется с разрешения ссылки 10.

Таблица 1 Рисунок 3. В естественных условиях и бывших естественных Налет TBRs (цель-в фоновый коэффициентов)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Воспаление высокого риска и уязвимых бляшек, вероятно, ответственны за большинство инфарктов миокарда. Выявления таких бляшек до появления симптомов имеет важное клиническое значение как в прогнозировании исходов и руководящие медикаментозной терапии. Обычные коронарных артерий формы визуализации, такие как рентгеновская ангиография обычно сосредоточены на характеристике просвета сужения, а не освещает лежащих в основе биологического профилей с высокой степенью риска, как правило, без стенозирующего поражения. Внутрисосудистое NIRF молекулярной визуализации предлагает лаборатории катетеризации сердца переводимые подход, который включает в себя биологию налета воспаление за счет использования наносенсоров, которые определяют активные макрофаги в пределах зубного налета, сотовые признак воспаленных доска склонны к разрыву. 9

Следующий протокол описанных выше использует смешанные интегративный подход, сочетающий ангиографии и ВСУЗИ NIRF визуализации для выявления воспаленные бляшки. Этот роман 2D NIRF катетер капитализирует на благоприятные оптические свойства ближней инфракрасной флуоресценции пропускную способность обнаруживать молекулярные подписей через кровь, и является перспективным в естественных условиях подход к молекулярной визуализации. Наносенсор Prosense/VM110 связан с флуорохромами, которые испускают fluroescence при 780 нм и использовать автоматическое тушение при отсутствии протеолитического расщепления или активацию фермента катепсина (очень выраженное в резидент макрофагов). Обнаружение в естественных условиях флуоресцентного сигнала от катетеров NIRF позволяет идентифицировать макрофагов нагруженные налета (TBR 2.9). Использование бывших естественных флуоресценции отражательной томографии (ПТ) подтверждает наличие сигнала ИК флуоресценции в области зубного налета (TBR 4.2). Иммуногистохимическое окрашивание RAM-11 и катепсина в районах налета подтвердить интенсивной инфильтрации катепсина-B позитивных макрофагов (данные не приведены).

Включение ВСУЗИ и NIRF сигнала могут быть приварены к карте интенсивности сигнала в пределах видимого доски по длине судна (данные не приведены) и предлагает уникальную возможность для дальнейшего выяснения просвета морфологии зубного налета и макрофагов содержания. Текущие ограничения выше метода относятся невозможность точно совместно зарегистрировать ВСУЗИ и NIRF откатах. Одновременное откат с помощью интегрированного двойного модальных катетер бы повысить точность сигнала месте и, возможно, включить разрешение расположения сигнала в стенках сосудов (т.е. глубина сигнала в просвете, СМИ или адвентиции). Двойной модальных NIRF / ВСУЗИ или NIRF / оптической когерентной томографии (ОКТ) катетеры слияния, как ожидается, следовательно, обеспечить дальнейшее разграничение сигнала и включения доска архитектуры с биологией.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FAJ - Бывший консультант, медицинский VisEn; Гонорары, Boston Scientific

Acknowledgments

Поддержка эта работа была предоставлена ​​Национальным институтом здоровья грант R01 HL 108229, Американской ассоциации сердца Ученый развития грант № 0830352N, Медицинского института Говарда Хьюза развития карьеры Award, Бродвью Ventures, Седьмой рамочной программы Европейского сообщества (FP7/2007-2013 по гранту договор № 235689), и MGH Уильям Шрейер стипендий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prosense 750 Visen Medical VM110 500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium APP Pharmaceuticals 401586D
Cephazolin NovaPlus 46015683
Lidocaine HCL 2% Hospira Inc. NDC 0409-4277-01
Buprenorphine Bedford Laboratories NDC 55390-100-10
Ketamine Hospira Inc. NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1% Research Diets C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3% Research Diets C30255

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, J., Libby, P. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).
  2. Calfon, M. A., Vinegoni, C. Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques. Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).
  3. Chen, J., Tung, C. -H. In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis. Circulation. 105, 2766-2771 (2002).
  4. Jaffer, F. A., Libby, P. Molecular Imaging of Cardiovascular Disease. Circulation. 116, 1052-1061 (2007).
  5. Jaffer, F. A., Libby, P. Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).
  6. Jaffer, F. A., Vinegoni, C. Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis. Circulation. 118, 1802-1809 (2008).
  7. Kim, D. -E., Kim, J. -Y. Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).
  8. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
  9. Naghavi, M., Libby, P. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation. 108, 1664-1672 (2003).
  10. Weissleder, R., Tung, C. -H. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).
  11. Razansky, R. N., Rosenthal, A. Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo. Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).
  12. Jaffer, F. A., Calfon, M. A. Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury. Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).
<em>В естественных условиях</em> ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) внутрисосудистого молекулярной визуализации воспалительных Зубной налет, мультимодальный подход к изображений атеросклероза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).More

Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter