Summary
Наш протокол описывает, как препарировать крысу брюшной молочной железы и, как готовить молочную железу тотальных. В нем также описывается, как анализировать молочной железы морфологии с помощью трех конечных точек (число почки терминального конца, эпителиальные удлинения и дифференцировки) и использовать эти результаты для прогнозирования риска развития рака молочной у крыс, которые подвергались диетических изменений
Abstract
Исследования грызунов моделях рака молочной показать рака, воздействия диетические / гормональных факторов в течение внутриутробного и пубертатном периодах, когда молочная железа претерпевает обширные моделирования и повторное моделирование, изменяют восприимчивость к канцерогенным вызванных опухолей молочной железы. Аналогичные результаты были описаны у человека: например, высокий вес при рождении увеличивает позже риск развития рака молочной железы, и диетического потребления соевого в детстве снижает риск рака молочной железы. Считается, что эти предродовой и послеродовой диетические изменения вызывают стойкие морфологические изменения в молочной железе, что, в свою очередь изменить риск рака молочной железы в будущем. Эти морфологические изменения вероятно, отражают эпигенетические модификации, такие как изменения в метилирование ДНК, гистонов и микроРНК выражение, то влиять на транскрипцию генов. В этой статье мы расскажем, как изменения в молочной железе морфологии может предсказать риск развития рака молочной у крыс. Наш протокол специально описывает, как вскрыть и удалить крысы брюшной молочной железы и, как готовить молочную железу тотальных. В нем также описывается, как анализировать молочной железы морфологии в соответствии с тремя концами (число почки терминального конца, эпителиальные удлинения и дифференцировки) и использовать эти данные для прогнозирования риска развития рака молочной железы.
Protocol
1. Удаление молочной железы брюшной и подготовка полного горе
- Эвтаназии животных в соответствии с IACUC руководящих принципов. Pin животного на спине с ногами с иглами, или ленту ноги на поверхность доски, и протрите кожу мокрым от этанола (этанол). Поднимите кожу немного пинцетом и с острыми ножницами делают разрез в средней линии кожу, начиная от пары № 5 соски и сократить к шее. Сделать перевернутый разрез Y от средней линии на задних ногах. Если грудные молочные железы, которые также будут собираться, чтобы также разрез Y от средней линии между парой № 2 соски к передней ноги.
- Рассекают кожу открытых ножницами с одной стороны перевернутого разрез Y подвергать брюшной # 4 молочной железы; молочные железы прикрепляются к коже. Контакт кожи с помощью игл на поверхности доски, чтобы полностью разоблачить железы. Работа одной стороны и железа в то время.
- Рассеките молочной железы свободными от кожи либо с помощью острых ножниц и / или скальпель, начиная с проксимальных районе, недалеко от соска и принимать меры к дистального конца железы по направлению к позвоночнику животного. (Это может занять несколько минут, особенно в старших крысу.)
- Сразу распространение отдельные железы на соответствующей маркировкой стекло (используйте правильный постоянный маркер и / или «перо алмаз»), и распространение железы тщательно соответствующие первоначальному размеру и форме на месте. Стекло должно быть больше, чем железа. После распространения железы на слайде, пусть он сидит на столе, на некоторое время, так что железы палочки на слайде, но не дайте ему высохнуть.
- Положите слайд в сосуде фиксатором Карнуа (75% ледяной уксусной кислоты, 25% абсолютного этанола = этанола), дайте ему фиксированный при комнатной температуре (RT) в вытяжном шкафу в течение 2 дней или дольше. Слайды также могут быть оставлены в фиксатор на более длительный период времени.
- Вымойте слайдов в 70% этаноле в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть в дистиллированной воде в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Пятно в Квасцы Кармине пятно *) в течение 2 дней или дольше (пока вы не видите, что лимфатические узлы запятнал через, посмотрите на обратную сторону слайд).
- Стирать в увеличении серии этанола, 1 час в каждом: 70% -> 95% -> 100%. После последнего мыть в абсолютном этаноле положить желез в ксилол. Пусть сидят в вытяжной шкаф в РТ по крайней мере в течение 2 дней. Этот последний шаг очистки молочной железы delipidation смысл молочной жировой ткани, а последующее увеличение прозрачности. Жирнее железа больше очистки требуется время.
- Горы с крышкой-скользит использованием монтажа носителей, таких как Permount. Пусть слайды хорошо высохнуть (несколько дней) до наблюдения под стерео микроскопом.
* Кармине Квасцы пятна:
Место 1 г кармина (Sigma C1022) и 2,5 г алюминия сульфат калия (Sigma A7167) в 500 мл дистиллированной воды и кипятят в течение 20 мин. Отрегулируйте конечный объем до 500 мл водой. Фильтр и поставить в холодильник. Решение может быть использовано в течение нескольких месяцев. Отменить, когда цвет становится слабым.
2. Анализ молочной железы Всего Морфология горе
Молочная железа тотальных морфологии анализируется в соответствии со следующими конечных точек и результаты коррелируют с риском развития рака молочной.
- Молочная железа целом монтажа на PND 21 (предварительно пубертатного возраста):
- Эпителиальные роста:
- Расстояние от соска к концу эпителиальных дерева (в миллиметрах), измеренный с помощью линейки
- Потенциал для злокачественной трансформации:
- Количество TEBS (почки терминального конца), учитываются в световой микроскоп. TEBS являются крупнейшими луковичных структур, расположенных только на дистальном конце молочной эпителиальных дерево
- Дифференциация:
- AB1 (альвеолярной бутон) оценка (0-5). Альвеолярные почки распределены по эпителия.
- AB2 оценка (0-5)
Целые крепления забил под световым микроскопом. Оценка значения из АВ1 и АВ2 добавляются окончательный счет дифференциации. - Эпителиальные роста:
- Молочная железа целом монтажа, собранные на PND 50 (после пубертатного возраста):
- Эпителиальные роста:
- Расстояние от лимфатических узлов до конца эпителиальных дерева (в миллиметрах), измеренный с помощью линейки.
- Расстояние от кончика эпителиальных дерева до конца жировой ткани, измеряется с помощью линейки.
- Потенциал для злокачественной трансформации:
- Количество TEBS, пересчитал под световым микроскопом
- Дифференциация:
- AB1 оценка (0-5)
- AB2 оценка (0-5)
- Дольки оценка (0-5)
Целые крепления забил под световым микроскопом. Дифференциация будет оценивает двояко. Во-первых, оценка значения от AB1, AB2 и дольки добавлен окончательный счет дифференциации. Кроме того, соотношение между дольками оценка и AB1 + АВ2 оценка будет рассчитана. ABs дифференцироваться в дольках, и чем выше соотношение между дольками и АБС, более дифференцированный железы. - Эпителиальные роста:
3. При пальпации молочной и измерения опухоли у крыс и Корреляция с молочной железы Морфология
- Чтобы начать эту процедуру, удерживая крыса, держа все тело ладонью по спине, с указательным пальцами за голову и большим и вторым пальцем в противоположном подмышечной впадины. Включите крыс, так что лежит на заднем, и ощупывать для обнаружения опухолей молочной железы, опухолей ощутимым должен чувствовать себя как «комок».
- Следующая использования суппорта для измерения ширины, длины и высоты опухоли. Рассчитать объем опухоли использованием эллипсоида формулу, Volume = 1/6πabc, где '' = ширина, длина = 'б', и 'с' = высоте.
- Ручная запись расположение и размер опухоли в ноутбук на еженедельной основе. Эти данные будут переданы в таблице ниже.
4. Представитель Результаты
Тщательное рассечение молочной жировой ткани и ее обработки wholemount позволит оценки развития состояние молочной железы. Когда каждый шаг сделан правильно, все молочные эпителиальных дерево хорошо видна в жировой ткани, что позволяет легко определять число TEBS и расчет плотности альвеолярной почек и дольками. Ошибок при подготовке wholemounts может включать в себя отказ препарировать целые жировой ткани, недостаточная фиксация, и неадекватная очистка.
Оценка молочной железы морфологии будут предоставлять информацию о количестве настоящее время структуры, которые могут привести к опухоли молочной железы (TEBS), степени дифференцировки эпителиальных структурах (альвеолярной почек и дольки), а мера роста (удлинение протоков). Важно отделить TEBS на терминал концов, последние расположены на дистальном конце эпителия, подобно TEBS, но они меньше, чем TEBS и не приводят к злокачественным опухолям. Терминал концы также рассматривать в эпителиальных дерева.
Рисунок 1:. Представитель результате хорошо подготовленной молочной железы горе целого Все компоненты железы были должным образом расчленены и кармин окрашивания является оптимальным.
Рисунок 2:. Представитель результате плохо подготовленной молочной железы монтировать целые железы была должным образом расчлененные (дистальной части железы не хватает), не была должным образом растягивается и delipidation полностью не произошло.
Discussion
Оценка молочной железы морфологических конечных точек и рост эпителиальных дерево может быть использована для прогнозирования того раннего периода жизни диетические манипуляции, или других манипуляций, которые изменяют внутриутробно или препубертатном гормонального фона, изменять позже рак молочной железы и риск. Поскольку рак молочной железы у человека начинается в молочных структур (терминал протоков единиц очаговая, TDLUs), аналогичные TEBS у крыс, эта методика может быть использована для определения потенциального воздействия ранней жизни влияют на риск рака молочной железы. Далее, у женщин высокой маммографической плотности увеличивает риск рака молочной железы в 4-6 раза, а оценка роста молочных эпителиальных дерево может быть использован для определения факторов, которые определяют маммографической плотности и факторов, которые снижают этой плотности. Для получения этой информации, молочная железа должна полностью рассеченные, правильно растягивается на предметное стекло так, чтобы все его компоненты могут быть визуализированы под микроскопом. Кроме того, надлежащее окрашивания кармином и delipidation в ксилоле обеспечит тотальных, которые подходят для молочных оценки риска рака.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040-01), ACS (116602-PF-09-018-01-CNE)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Carnoy’s Fixative |
| Absolute ethanol | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Carnoy’s Fixative |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | Carmine solution |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A7167 | Carmine solution |
References
- Rasmussen, S. B., Young, L. J. T., Smith, G. H. Preparing mammary gland whole mounts form mice. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic / Plenum Publishers. New York. 75-85 (2000).
- Consensus statements from Mammary Gland Whole Mount Round Robin meeting. Oakland, CA, , (2009).
- Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R., Onojafe, I., Raygada, M., Cho, E., &, L. ippman, E, M. A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring. Proc Natl Acad Sci. 94, 9372-9377 (1997).
- Russo, I. H., Russo, J. Mammary gland neoplasia in long-term rodent studies. Environ. Health Perspect. 104 (9), 938-967 (1996).
- Hilakivi-Clarke, L., de Assis, S. Fetal origins of breast cancer. TRENDS in Endocrinol and Metabol. 17 (9), 340-348 (2006).
- Hilakivi-Clarke, L. Nutritional modulation of terminal end buds: its relevance to breast cancer prevention. Curr Cancer Drug Targets. 7 (4), 465-474 (2007).
- Silva Idos, S., De Stavola, B., Mccormack, V. Collaborative Group On Pre-Natal Risk Factors And Subsequent Risk Of Breast Cancer. Birth size and breast cancer risk: re-analysis of individual participant data from 32 studies. PloS Medicine. 5, e193-e193 (2008).
- Warri, A., Saarinen, N. M., Makela, S., Hilakivi-Clarke, L. The role of early life genistein exposures in modifying breast cancer risk. Br J Cancer. 98, 1485-1493 (2008).
- Russo, J., Hu, Y. F., Yang, X., Russo, I. H. Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. , 17-37 (2000).
- Oza, A. M., Boyd, N. F. Mammographic parenchymal patterns: A marker of breast cancer risk. Epidemiological Reviews. 15, 196-208 (1993).
