Summary
بروتوكول لدينا توضح كيفية تشريح الفئران الغدة الثديية في البطن وكيفية الاستعداد يتصاعد الغدة الثديية كلها. فهو يصف أيضا كيفية تحليل الغدة الثديية التشكل باستخدام ثلاث نقاط في نهاية (عدد البراعم نهاية طرفية ، استطالة الظهارية والتمايز) واستخدام هذه النتائج للتنبؤ خطر الاصابة بسرطان الثدي لدى الفئران التي تعرضت لتعديلات الغذائية
Abstract
دراسات في نماذج من القوارض تبين ان سرطان الثدي التعرض للعوامل الغذائية / الهرمونية في الرحم خلال فترة البلوغ وعندما الغدة الثديية يخضع النمذجة واسعة وإعادة النمذجة ، القابلية للتغيير مسرطنة بفعل أورام الثدي. وقد وصفت نتائج مماثلة على البشر : على سبيل المثال ، يزيد من خطر ارتفاع الوزن عند الولادة في وقت لاحق من الاصابة بسرطان الثدي ، والمدخول الغذائي من فول الصويا خلال الطفولة ينخفض خطر الاصابة بسرطان الثدي. ويعتقد أن هذه التعديلات قبل الولادة وبعدها تحدث تغييرات شكلية الغذائية المستمرة في الغدة الثديية التي بدورها تعديل احتمال الاصابة بسرطان الثدي لاحقا في الحياة. هذه التغيرات المورفولوجية تعكس على الأرجح مدى تعديلات جينية ، مثل التغيرات في الحامض النووي ، والتعبير histones ميرنا التي تؤثر ثم النسخ الجيني. نحن في هذه المقالة تصف كيف يمكن للتغييرات في مورفولوجية الغدة الثديية يمكن التنبؤ خطر الاصابة بسرطان الثدي لدى الفئران. بروتوكول يصف لنا على وجه التحديد كيفية تشريح الفئران وإزالة الغدة الثديية في البطن وكيفية الاستعداد يتصاعد الغدة الثديية كلها. فهو يصف أيضا كيفية تحليل الغدة الثديية التشكل وفقا لنقطة نهاية الثلاثة (عدد البراعم نهاية طرفية ، استطالة الظهارية وتمايز) ، واستخدام البيانات للتنبؤ لخطر الاصابة بسرطان الثدي.
Protocol
1. إزالة الغدة الثديية في البطن وإعداد جبل الجامعة
- الموت ببطء الحيوان وفقا لمبادئ توجيهية IACUC. دبوس الحيوان على ظهره من الساقين مع الإبر ، أو الشريط الساقين على سطح اللوحة ، ويمسح على الجلد الرطب مع الإيثانول (EtOH). رفع الجلد قليلا مع ملقط ومقص حاد مع إجراء شق خط الوسط في الجلد تبدأ بين الزوج # 5 الحلمات وقطع الرقبة نحو إجراء شق Y مقلوب من المنتصف باتجاه رجليه الخلفيتين. إذا الغدد الثديية الصدري كما سيتم جمعها ، وجعل أيضا من شق Y خط الوسط بين الزوج # 2 الحلمات نحو الأرجل الأمامية.
- تشريح الجلد مفتوحة مع مقص على جانب واحد من شق Y مقلوب لفضح الغدة الثديية # 4 في البطن ، ويتم إرفاق الغدد الثديية على الجلد. دبوس الجلد مع الإبر على سطح اللوحة ، لفضح تماما الغدة. جانب واحد وعمل الغدة في ذلك الوقت.
- تشريح الغدة الثديية خالية من الجلد إما باستخدام مقص حاد و / أو مشرط ، بدءا من المنطقة الأقرب على مقربة من الحلمة والعمل من أجل نهاية البعيدة للغدة نحو العمود الفقري من الحيوان. (يمكن أن يستغرق ذلك عدة دقائق ، وخاصة في كبار السن الفئران).
- انتشر على الفور الغدة منفصلة على شريحة زجاجية المسمى بشكل مناسب (استخدام القلم الصحيح علامة دائمة و / أو "قلم الماس') ، وانتشار الغدة المقابلة بعناية لحجمها وشكلها الأصلي في الموقع. يجب على شريحة زجاجية تكون أكبر من الغدة. بعد نشر غدة على الشريحة ، والسماح لها الجلوس على طاولة المفاوضات لفترة من الوقت ، بحيث الغدة العصي على الشريحة ، ولكن لا اتركها لتجف.
- وضع شريحة في وعاء يحتوي على مثبت في Carnoy (75 ٪ حامض الخليك الجليدي ، والإيثانول المطلقة 25 ٪ = EtOH) ، واسمحوا الحصول على أنها ثابتة في درجة حرارة الغرفة (RT) في غطاء الدخان لمدة 2 أيام أو أطول. ويمكن أيضا أن تترك الشرائح في تثبيتي لفترة أطول من الزمن.
- تغسل الشرائح في EtOH 70 ٪ لمدة 1 ساعة على RT.
- شطف في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة في RT.
- وصمة عار في الشبة كارمين صمة *) لمدة 2 يوم أو أكثر (حتى ترى أن الغدد الليمفاوية والملون من خلال ؛ نظرة على الجانب الخلفي من الشريحة).
- يغسل في سلسلة متزايدة من EtOH ، 1 في كل ساعة : 70 ٪ --> 95 ٪ --> 100 ٪. بعد غسل الماضي في EtOH المطلقة وضع الغدد في الزايلين. دعونا نجلس في غطاء الدخان في ما لا يقل عن RT 2 يوما. هذه الخطوة الأخيرة هي تطهير للإزالة الشحميات الغدة الثديية من معنى اللوحة الدهون الثديية ، وزيادة لاحقة في الشفافية. وfattier هو أطول وقت الغدة المقاصة هو مطلوب.
- جبل مع غطاء ينزلق به وسائل الإعلام المتصاعدة ، مثل Permount. السماح للشرائح الجافة جيدا (عدة أيام) قبل مراقبة تحت المجهر ستيريو.
* كارمن الشبة اللطخة :
1 ز مكان القرمز (سيغما C1022) و 2.5 غرام كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم (سيغما A7167) في الماء المقطر و500 مل يغلي لمدة 20 دقيقة. ضبط الحجم النهائي إلى 500 مليلتر من الماء. تصفية والثلاجة. ويمكن استخدام الحل لعدة أشهر. عندما يصبح لون تجاهل ضعيفة.
2. تحليل الغدة الثديية المورفولوجيا جبل الجامعة
ويتم تحليل الغدة الثديية مورفولوجيا يتصاعد كله وفقا للنقاط التالية النهائي والنتائج مرتبطة مع خطر الاصابة بسرطان الثدي.
- الغدة الثديية كاملة يشن الحزب الوطني الديمقراطي في 21 (سن ما قبل البلوغ) :
- طلائي النمو :
- المسافة من الحلمة إلى نهاية شجرة الظهارية (في ملليمتر) ، وتقاس باستخدام مسطرة
- احتمالات التحول الخبيث :
- عدد TEBs (براعم نهاية طرفية) ، تحسب تحت المجهر الخفيفة. TEBs هي أكبر الهياكل بصلي تقع فقط في نهاية البعيدة من شجرة الثدي الظهارية
- التمايز :
- AB1 (السنخية برعم) النتيجة (0-5). وتنتشر براعم السنخية عبر الظهارة.
- AB2 النتيجة (0-5)
وسجل يتصاعد أجمعين تحت المجهر الخفيفة. تضاف نقاط من القيم وAB1 AB2 لدرجة التمايز النهائي. - طلائي النمو :
- الغدة الثديية كلها تجمع على جبل PND 50 (سن البلوغ بعد) :
- طلائي النمو :
- المسافة من العقدة الليمفاوية في نهاية شجرة الظهارية (في ملليمتر) ، وتقاس باستخدام المسطرة.
- المسافة من رأس الشجرة الظهارية إلى نهاية منصة الدهون ، وتقاس باستخدام المسطرة.
- احتمالات التحول الخبيث :
- عدد TEBs ، محسوبة تحت المجهر ضوء
- التمايز :
- AB1 النتيجة (0-5)
- AB2 النتيجة (0-5)
- فصيصات النتيجة (0-5)
وسجل يتصاعد أجمعين تحت المجهر الخفيفة. وسوف يتم التفريق يقيم بطريقتين. الأولى ، هي إضافة القيم درجة من AB1 ، AB2 وفصيصات لدرجة التمايز النهائي. بالإضافة ، سيتم احتساب النسبة بين درجة والفصيصات AB1 درجة AB2 +. ABS التفريق لالفصيصات ، وارتفاع النسبة بين الفصيصات و(ABS) ، وأكثر تمايزا في الغدة. - طلائي النمو :
3. الجس والأورام الثديية في الفئران القياس والارتباط لالمورفولوجيا الغدة الثديية
- لبدء هذا الإجراء ، عقد الفئران التي تقبض على الجسم كله مع النخيل على الظهر ، مع السبابة وراء الرأس والابهام والاصبع الثاني تحت الإبطين المعاكس. بدوره الفأر بحيث يكون مستلقيا على خلفية لها ، وجس للكشف عن أية أورام الثدي ، أورام واضح وينبغي أن يشعر وكأنه "مقطوع".
- استخدام المقبل الفرجار لقياس عرض وطول وارتفاع الورم. حساب حجم الورم باستخدام الصيغة الإهليلجي ، المجلد = 1/6πabc ، حيث 'ا' = العرض ، 'ب' = الطول ، و 'ج' = الارتفاع.
- السجل يدويا موقع وحجم الورم في دفتر ملاحظات على أساس أسبوعي. وسيتم نقل هذه البيانات إلى جدول بيانات في وقت لاحق.
4. ممثل النتائج
سوف تشريح دقيق للوحة الدهون الثديية وتجهيز لwholemount تسمح بتقييم الدولة التنموية من الغدة الثديية. عندما يتم كل خطوة بشكل صحيح ، وكلها شجرة الثدي الظهارية مرئيا بوضوح داخل وسادة من الدهون ، وهذا يسمح بسهولة تحديد عدد TEBs وحساب كثافة براعم السنخية والفصيصات. قد عثرات في إعداد wholemounts تشمل عدم تشريح لوحة كاملة الدسم ، وتحديد غير كافية ، وتبادل المعلومات غير كافية.
وتقييم التشكل الغدة الثديية تقديم معلومات عن عدد من الهياكل الحالية التي يمكن أن تؤدي إلى أورام الثدي (TEBs) ، ودرجة التمايز لهياكل الظهارية (براعم السنخية والفصيصات) ، وقياس النمو (استطالة الأقنية). من المهم أن TEBs منفصلة لغايات المحطة ؛ وتقع هذه الأخيرة في نهاية البعيدة للظهارة ، على غرار TEBs ، لكنها أصغر من TEBs ولا تؤدي إلى أورام خبيثة. وينظر أيضا في تاريخ المحطة شجرة الظهارية.
الشكل 1 : نتيجة ممثل إعدادا جيدا الغدة الثديية جبل بأكمله وكانت كل مكونات تشريح الغدة بشكل صحيح والقرمز تلطيخ هو الأمثل.
الشكل 2 : نتيجة الممثل من غير مهيأة لشن الغدة الثديية كاملة الغدة تم تشريح بشكل صحيح (الجزء القاصي للغدة مفقود) ، لم تمتد بشكل صحيح وإزالة الشحميات لم يحدث تماما.
Discussion
ويمكن استخدام تقييم الغدة الثديية المورفولوجية النقاط النهائية ونمو الشجرة الظهارية التنبؤ بما اذا كانت المناورات في وقت مبكر الحياة الغذائية أو غيرها من المعالجات التي تغير في البيئة الرحم أو الهرمونية سابق للبلوغ ، وتعديل في وقت لاحق خطر الاصابة بسرطان الثدي. منذ يبدأ سرطان الثدي في البشر في الهياكل الثديية (وحدات محطة مفصص الأقنية ، TDLUs) مشابهة لTEBs في الفئران ، ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد احتمالات التعرض الحياة المبكرة تؤثر على خطر الاصابة بسرطان الثدي. كذلك ، في المرأة كثافة عالية mammographic يزيد من خطر الاصابة بسرطان الثدي بنسبة 4-6 أضعاف ، ويمكن استخدامها في تقييم نمو شجرة الثدي الظهارية للتعرف على العوامل التي تحدد كثافة mammographic والعوامل التي تحد من هذه الكثافة. للحصول على هذه المعلومات ، ينبغي تشريح الغدة الثديية بالكامل ، امتدت بشكل صحيح على شريحة زجاجية حتى يتسنى لجميع مكوناته يمكن تصور تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، سوف السليم القرمز تلطيخ وإزالة الشحميات في توفير الزيلين يتصاعد بأكملها التي هي مناسبة لسرطان الثدي تقييم المخاطر.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
NCI (U54 CA00100970) ، NCI (1 CA150040 R03 - 01) ، ACS (116602 - PF - 09 - 018 - 01 - CNE)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Carnoy’s Fixative |
| Absolute ethanol | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Carnoy’s Fixative |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | Carmine solution |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A7167 | Carmine solution |
References
- Rasmussen, S. B., Young, L. J. T., Smith, G. H. Preparing mammary gland whole mounts form mice. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic / Plenum Publishers. New York. 75-85 (2000).
- Consensus statements from Mammary Gland Whole Mount Round Robin meeting. Oakland, CA, , (2009).
- Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R., Onojafe, I., Raygada, M., Cho, E., &, L. ippman, E, M. A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring. Proc Natl Acad Sci. 94, 9372-9377 (1997).
- Russo, I. H., Russo, J. Mammary gland neoplasia in long-term rodent studies. Environ. Health Perspect. 104 (9), 938-967 (1996).
- Hilakivi-Clarke, L., de Assis, S.
- Hilakivi-Clarke, L. Nutritional modulation of terminal end buds: its relevance to breast cancer prevention. Curr Cancer Drug Targets. 7 (4), 465-474 (2007).
- Silva Idos, S., De Stavola, B., Mccormack, V. Collaborative Group On Pre-Natal Risk Factors And Subsequent Risk Of Breast Cancer. Birth size and breast cancer risk: re-analysis of individual participant data from 32 studies. PloS Medicine. 5, e193-e193 (2008).
- Warri, A., Saarinen, N. M., Makela, S., Hilakivi-Clarke, L. The role of early life genistein exposures in modifying breast cancer risk. Br J Cancer. 98, 1485-1493 (2008).
- Russo, J., Hu, Y. F., Yang, X., Russo, I. H. Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. , 17-37 (2000).
- Oza, A. M., Boyd, N. F. Mammographic parenchymal patterns: A marker of breast cancer risk. Epidemiological Reviews. 15, 196-208 (1993).
