Summary
Bizim protokol sıçan karın meme bezi nasıl incelemek ve meme bezi bütün bağlar hazırlamak için nasıl açıklamaktadır. Aynı zamanda üç uç noktaları (terminal sonuna tomurcukları sayısı, epitel uzama ve farklılaşma) kullanılarak meme bezi morfolojisi analiz etmek ve bu sonuçlar, diyet değişiklikleri maruz kalan farelerde meme kanseri riskini tahmin etmek için kullanmak nasıl açıklar
Abstract
Meme kanseri gösterisi kemirgen modellerinde yapılan çalışmalar sırasında utero ve pubertal dönem, diyet / hormonal faktörler maruziyet meme bezi kapsamlı modelleme ve yeniden modelleme uğrar, kanserojen bağlı meme tümörlerinde duyarlılık değiştirmek. Benzer bulgular insanlarda tarif edilmiştir: örneğin, yüksek doğum ağırlığı, daha sonra meme kanserine yakalanma riski artar, ve çocukluk döneminde soya besin alımı meme kanseri riskini azaltır. Bu doğum öncesi ve doğum sonrası diyet değişiklikleri, daha sonra da yaşamın meme kanseri riskini değiştirmek meme bezi kalıcı morfolojik değişikliklere neden olduğu düşünülmektedir. Bu morfolojik değişiklikler büyük olasılıkla DNA metilasyon değişiklikleri, histon ve sonra gen transkripsiyonunu etkileyen miRNA ifadesi gibi epigenetik modifikasyonlar yansıtmaktadır. Bu yazıda, meme bezi morfolojisi değişiklikler sıçanlarda meme kanseri riskini tahmin nasıl açıklar. Bizim protokol özellikle incelemek ve kaldırmak sıçan karın meme bezi ve meme bezi bütün bağlar nasıl hazırlamak için nasıl açıklamaktadır. Aynı zamanda üç uç noktaları (terminal uç tomurcukların sayısı, epitel uzama ve farklılaşma) ve meme kanseri gelişme riskini tahmin etmek için veri kullanmak göre meme bezi morfolojisi nasıl çözümleneceği anlatılmaktadır.
Protocol
1. Karın Meme Bezi kaldırılması ve Tüm Dağı hazırlanması
- IACUC kurallarına göre hayvan Euthanize. , Iğneler, veya bant bacakları ile yüzey tahta üzerine ayakları hayvan sırtında Pin, ve etanol (EtOH) ile ıslak cilde silin. Cilt forseps ile biraz kaldırın ve keskin bir makas, boyun doğru çift # 5 meme ve kesme arasında başlayan deri içine bir orta hat kesi ile. Arka ayakları doğru orta hatta ters bir Y kesi olun. Torasik meme bezlerinde toplanan de varsa, orta hat # 2 meme ön ayakları doğru çifti arasında da bir Y kesi olun.
- Cilt, karın # 4 meme bezi maruz ters Y kesi bir tarafta makas açık teşrih; meme bezlerinin cilde bağlı. Bezi tamamen açığa çıkarmak için, cilt yüzeyinde tahta üzerine iğne ile sabitleyin. Zamanda bir yan ve bez çalışın.
- Meme yakın proksimal alandan başlayan ve hayvan omurga doğru bezi distal sonuna doğru, keskin bir makas ve / veya bir neşter kullanılarak ya cilt ücretsiz meme bezi parçalara ayır. (Bu, özellikle eski bir sıçan birkaç dakika sürebilir.)
- Hemen uygun bir şekilde etiketli cam slayt (uygun bir kalıcı marker kalem ve / veya 'elmas kalem kullanın) üzerine müstakil bezi yayılır, ve in situ orijinal boyutu ve şekli dikkatle ilgili bezi yayılır. Cam slayt bezinin daha büyük olmalıdır. Slayt üzerine bezi yayıldıktan sonra, bezi slayt üzerine yapışır, böylece bir süre için masaya oturup, ancak kuru izin vermeyin.
- Slayt Carnoy Kullanıcı fiksatif (% 75 buzul asetik asit,% 25 mutlak etanol = EtOH) içeren bir kavanoza koyun, davlumbaz 2 gün veya daha uzun süre oda sıcaklığında (RT) sabit olsun izin verin. Slaytlar da daha uzun bir süre için fiksatif bırakılabilir.
- Oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 70 EtOH slaytlar yıkayın.
- RT 30 dakika distile su ile durulayın.
- 2 gün veya daha uzun bir süre için) * leke Carmine Şap Leke slayt arka yüzüne bakmak); (lenf düğümleri ile boyanmış olduğunu görene kadar.
- EtOH artan serisi, her biri 1 saat Yıkama:% 70 -% 95 ->% 100. Mutlak EtOH son yıkamadan sonra ksilen bezleri koydu. RT davlumbaz en az 2 gün bekletin. Bu son adım, meme yağ yastığı meme bezinin anlamı delipidation temizleme, ve şeffaflık sonraki artış. Yağlıdır bezinin uzun temizleme süresi gereklidir.
- Permount olarak montaj medya, kapak fişleri ile monte edin. Stereo mikroskop altında gözlemleyerek önce (birkaç gün) slayt kurumasını bekleyin.
* Carmine Şap Lekesi:
Place 1 g karmin (Sigma C1022) ve 20 dakika için 500 ml distile su ve kaynatın 2.5 g alüminyum potasyum sülfat (Sigma A7167). Son hacim 500 ml su ile ayarlayın. Filtre ve buzdolabına kaldırın. Çözüm, birkaç ay boyunca kullanılabilir. Renk zayıf hale geldiğinde atın.
2. Meme Bezi Tüm Dağı Morfoloji Analizi
Meme bezi bütün bağlar morfolojisi aşağıdaki uç noktaları ve meme kanseri riski ile ilişkili sonuçlar göre analiz edilir.
- Meme bezi PND 21, tüm montaj (pre-pubertal yaş):
- Epitelyal büyüme:
- Meme epitel ağacının sonuna kadar (milimetre) Uzaklık, bir cetvel kullanılarak ölçülen
- Potansiyel malign transformasyon:
- TEBS sayısı (terminal sonuna tomurcukları), bir ışık mikroskobu altında sayılır. TEBS sadece meme epitel ağacın distal ucunda bulunan büyük soğanlı yapılar
- Farklılaşma:
- AB1 (alveol tomurcuk) skoru (0-5). Alveoler tomurcukları epitel yayılmış.
- AB2 skoru (0-5)
Wholes bağlar ışık mikroskobu altında puan. AB1 ve AB2 puan değerleri, son bir farklılaşma skor için eklenir. - Epitelyal büyüme:
- Meme bezi tüm montaj toplanan PND 50 (post-pubertal yaş):
- Epitelyal büyüme:
- Lenf nodu epitel ağacının sonuna (milimetre) Mesafe, bir cetvel kullanılarak ölçüldü.
- Epitel ağacın ucundan yağ yastığı sonuna kadar olan mesafe bir cetvel kullanılarak ölçüldü.
- Potansiyel malign transformasyon:
- Işık mikroskobu altında sayılır TEBS sayısı,
- Farklılaşma:
- AB1 skoru (0-5)
- AB2 skoru (0-5)
- Lobülleri skoru (0-5)
Wholes bağlar ışık mikroskobu altında puan. Farklılaşma iki şekilde de değerlendiren olacaktır. İlk olarak, AB1, AB2 ve lobülleri puan değerleri nihai bir farklılaşma puan için eklenir. Buna ek olarak, lobülleri skoru arasındaki oran ve AB1 + AB2 puanı hesaplanacaktır. ABS lobüllere farklılaştırmak ve lobüller ve ABS arasındaki oranı daha yüksek, daha farklılaşmış bir salgı bezidir. - Epitelyal büyüme:
3. Palpasyon ve Sıçanlar ve Meme Bezi Morfoloji Korelasyon Meme Tümör Ölçüm
- Bu yordamı başlamak için, başın arkasında ve ters aksilla altında başparmak ve ikinci parmak ile işaret parmağı, arkasına avuç içi ile tüm vücut tutarak sıçan tutun. Onun posterior yalan böylece sıçan açın ve herhangi bir meme tümörleri tespit etmek için palpe palpe edilebilir tümörler "götürü" gibi hissediyorum.
- Sonraki kaliper, genişlik, uzunluk, ve yükseklik tümör ölçmek için kullanın. Elipsoid formül, Cilt = 1/6πabc, 'a' = genişlik, 'b' = uzunluk, ve 'c' = yükseklik kullanarak tümör hacmi hesaplayın
- El, haftalık bazda bir dizüstü tümörün yerini ve büyüklüğünü kaydeder. Bu veriler daha sonra bir elektronik tabloya aktarılacaktır.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Meme yağ yastığı ve wholemount işleme dikkatli diseksiyon meme bezinin kalkınmacı devlet değerlendirme sağlayacaktır. Her adımı doğru bir şekilde yapıldığında, tüm meme epitel ağacı yağ yastığı içinde açıkça görülebilir ve bu TEBS sayısı ve yoğunluğu alveoler tomurcukları ve lobülleri hesaplama kolay belirliyor. Hazırlanması wholemounts missteps tüm yağ yastığı, yetersiz sabitleme ve yetersiz takas incelemek için başarısızlık içerebilir.
Meme bezi morfolojisi değerlendirilmesi meme tümörleri (TEBS), epitelyal yapılar (alveoler tomurcukları ve lobüller) farklılaşma derecesi ve büyüme ölçüsü (duktal uzama) ortaya çıkmasına neden olabilir yapılar mevcut sayısı hakkında bilgi verecektir. TEBS terminal ucuna ayrı önemlidir; ikincisi benzer TEBS epitel distal ucunda bulunan, ancak TEBS daha küçük ve habis tümörlere yol açmaz. Terminal uçları da epitel ağaç içinde görülür.
Şekil 1: iyi hazırlanmış meme bezi bütün montaj Temsilcisi sonucu bezinin tüm bileşenlerini düzgün bir şekilde diseke edilmiş ve karmin boyama en uygunudur.
Şekil 2: kötü hazırlanmış meme bezi bütün montaj Temsilcisi sonucu bezinin düzgün, (bezinin distal eksik) disseke olmuştur düzgün gerilmiş olmamıştır ve delipidation tamamen oluştu değil.
Discussion
Meme bezinin morfolojik son noktaları ve epitel ağacının büyüme değerlendirilmesi, erken yaşam diyet manipülasyonlar, ya da diğer manipülasyonlar utero veya prepubertal hormonal ortamda değiştiren, daha sonra meme kanseri riskini değişiklik olmadığını tahmin etmek için kullanılabilir. Insanlarda meme kanseri, sıçanlarda TEBS benzer meme yapıları (terminal duktal lobüler birimleri, TDLUs) başlatılan olduğundan, bu tekniğin, meme kanseri riskini etkilemez hayatın erken döneminde maruz kalma potansiyeli belirlemek için kullanılır. Ayrıca, kadınlarda mamografik yoğunluğu yüksek meme kanseri riski 4-6 kat artar, meme epitel ağacının büyüme değerlendirilmesi ve mamografik yoğunluğu ve bu yoğunluk azaltan faktörleri belirlemek faktörleri belirlemek için kullanılabilir. Bu bilgileri elde etmek için, meme bezi tamamen disseke düzgün bir cam slayt tüm bileşenleri bir mikroskop altında görüntülenir böylece gergin olmalıdır. Buna ek olarak, uygun karmin boyama ve ksilen içinde delipidation, meme kanseri risk değerlendirmesi için uygun olan bütün bağlar sağlayacaktır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040-01), ACS (116.602-PF-09-018-01-CNE)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Carnoy’s Fixative |
| Absolute ethanol | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Carnoy’s Fixative |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | Carmine solution |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A7167 | Carmine solution |
References
- Rasmussen, S. B., Young, L. J. T., Smith, G. H. Preparing mammary gland whole mounts form mice. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic / Plenum Publishers. New York. 75-85 (2000).
- Consensus statements from Mammary Gland Whole Mount Round Robin meeting. Oakland, CA, , (2009).
- Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R., Onojafe, I., Raygada, M., Cho, E., &, L. ippman, E, M. A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring. Proc Natl Acad Sci. 94, 9372-9377 (1997).
- Russo, I. H., Russo, J. Mammary gland neoplasia in long-term rodent studies. Environ. Health Perspect. 104 (9), 938-967 (1996).
- Hilakivi-Clarke, L., de Assis, S. Fetal origins of breast cancer. TRENDS in Endocrinol and Metabol. 17 (9), 340-348 (2006).
- Hilakivi-Clarke, L. Nutritional modulation of terminal end buds: its relevance to breast cancer prevention. Curr Cancer Drug Targets. 7 (4), 465-474 (2007).
- Silva Idos, S., De Stavola, B., Mccormack, V. Collaborative Group On Pre-Natal Risk Factors And Subsequent Risk Of Breast Cancer. Birth size and breast cancer risk: re-analysis of individual participant data from 32 studies. PloS Medicine. 5, e193-e193 (2008).
- Warri, A., Saarinen, N. M., Makela, S., Hilakivi-Clarke, L. The role of early life genistein exposures in modifying breast cancer risk. Br J Cancer. 98, 1485-1493 (2008).
- Russo, J., Hu, Y. F., Yang, X., Russo, I. H. Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. , 17-37 (2000).
- Oza, A. M., Boyd, N. F. Mammographic parenchymal patterns: A marker of breast cancer risk. Epidemiological Reviews. 15, 196-208 (1993).
