Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- _L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

Summary

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura com

Abstract

Há uma variedade de abordagens para reduzir a complexidade do proteoma com base na pequena molécula de proteína funcional de interações tais como cromatografia de afinidade ou de ^um perfil a atividade da proteína Baseado ^2. Compostos de Captura trifuncional (CCs, Figura 1A) ³ são a base para uma abordagem genérica, em que o equilíbrio inicial-driven interação entre uma sonda pequena molécula (a função de seletividade, aqui _{S-adenosil-L-homocisteína,} HAS, Figura 1A) e proteínas-alvo é irreversível fixos foto crosslinking entre uma função de reatividade independente foto-que podem ser activados (aqui um phenylazide) do CC e da superfície das proteínas-alvo. A função de triagem (aqui biotina) serve para isolar o CC - conjugados de proteínas do complexo misturas biológica com a ajuda de uma fase sólida (grânulos aqui estreptavidina magnética). Duas configurações dos experimentos são possíveis: "off-talão" ⁴ ou o momento descrito "on-talão" configuração (Figura 1B). A função de seletividade pode ser praticamente qualquer molécula pequena de interesse (substratos, inibidores, moléculas da droga).

_{S-adenosil-L-metionina} (SAM, Figura 1A) é, provavelmente, segundo a ATP, o co-fator mais utilizado na natureza ^{5, 6.} É usado como o principal doador de metila grupo em todos os organismos vivos com a reação química pode ser catalisada pela SAM-dependente metiltransferases (MTases), que metilato de DNA ^{7, 8} RNA, proteínas ^9, ou pequenas moléculas ^10. Dado o papel crucial das reações de metilação em diversos cenários fisiológicas (regulação de genes, a epigenética, o metabolismo), o perfil dos MTases se pode esperar para se tornar de importância similar em proteômica funcional como o perfil de quinases. Ferramentas analíticas para o seu perfil, no entanto, não estavam disponíveis. Recentemente, introduziu um CC com HAS como grupo seletividade para preencher esta lacuna tecnológica (Figura 1A).

HAS, o produto da SAM, após a transferência de metila, é um inibidor produto conhecido geral MTase ^11. Por esta razão e porque o natural cofactor SAM é usado pelas enzimas ainda a transferência de outras partes do cofator ou iniciar reações radicais, bem como devido à sua instabilidade química, ^{12 de} HAS é uma função ideal para uma seletividade como alvo MTases CC. Aqui, relatamos a utilidade da HAS-CC e CCMS por MTases profiling e outros HAS proteínas de ligação a partir do DH5α estirpe de Escherichia coli (E. coli), um dos melhores caracterizados os procariontes, que tem servido como o modelo preferido organismo em inúmeros estudos bioquímicos, biológicos e biotecnológicos. Foto-ativada reticulação aumenta a produtividade e sensibilidade do experimento, a especificidade e pode ser facilmente testada em experimentos de competição para usar um excesso de HAS livre.

Protocol

1) Elaboração de E. coli lisado celular DH5α

1. Inocular uma cultura 2mL (media LB em um tubo de ensaio) com o E. coli DH5α tensão diretamente de um estoque de glicerol e incubar a 37 ° C e 250 rpm por 8 h. Use a mídia LB autoclavado (10 g / l Bacto-triptona, extrato de levedura 5 g / L, 10 g / L NaCl, pH 7,5).
2. Inocular 250 mL de mídia LB em um frasco de um shaker L com confusões com a cultura 2 mL e incubar durante a noite a 37 ° C e 166 rpm em uma incubadora com agitador orbital.
3. Inocular quatro frascos de 5 L shaker com defletores cada um contendo 2,5 L LB mídia com a cultura 250 mL (50 mL para cada frasco) e incubar as culturas a 37 ° C e 166 rpm até que um OD ₆₀₀ de 0,8 é atingido.
4. Colher as células por centrifugação a 4 ° C, 3000x g por 20 min. Executar o tratamento de mais de 0-4 ° C ou em gelo.
5. Re-suspender o material celular colhidas em água Milli-Q, combinam em um balde de centrífuga e centrifugar por um 30 min mais em 6000x g e 4 ° C.
6. Armazenar o material celular, resultando 20 g a -20 ° C ou -78 ° C.
7. Re-suspender as células em 100 mL de buffer abertura gelada célula (6,7 mM MES, 6,7 mM NaOAc, 6,7 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoetanol, 200 mM NaCl, pH 7,5, 10% (w / v) glicerol e 0,2 mM PMSF) e sonicate três vezes por 1 min em quatro porções 25 mL no gelo usando um sonifier (por exemplo, SONOPULS HD 2070 de BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, amplitude máxima, de saída contínua).
8. Centrifugar o lisado durante a noite com 2370x g e 2 ° C.
9. Concentre-se o sobrenadante a 14 mL por ultrafiltração (por exemplo, usando iCON concentradores, 7 mL/9K, de Pierce) a 2370x g e 2 ° C.
10. Empobrecem a concentrar viscoso a partir de moléculas pequenas, como SAM HAS ou por filtração gel a 2 ° C (por exemplo, Zeba Colunas Giro dessalinizar, 10 mL, de Pierce, quatro colunas; buffer de armazenamento removido a 1000x g por 2 min; quatro vezes equilíbrio com 5 mL tampão de gelo de abertura frio celular e tampão removido a 1000x g por 2 min, respectivamente, 3,5 mL de concentrado aplicado a cada coluna; 45 min de centrifugação em 24x g, duas vezes 2 min a 1000x g)
11. Complementar o lisado resultante mL 13 com 13 mL de glicerol gelo frio e mini Roche protease comprimidos cocktail inibidor, EDTA livre. Misturar e dissolver os comprimidos.
12. Armazenar o lisado a -20 ° C
13. Determinar a concentração de proteína total pelo ensaio de Bradford (21 mg / ml no caso presente). Reagente de Bradford: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 em 50 mL de etanol 95%, adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85% (w / v), diluir para 1 L quando o corante foi completamente dissolvido, e filtrar através de papel Whatman # 1 apenas antes do uso.

2) ensaio de captura (A), Controle de Concorrência (C), Pulldown (PD), Controle de Concorrência de Pulldown (CPD), e ensaio de captura Combinado mais Pulldown (PD A +)

1. Para os experimentos de captura, o caproKit HAS (caprotec Bioanalítica GmbH) foi usado, que inclui a HAS-CC, livre HAS como concorrente, estreptavidina revestida esferas magnéticas com um diâmetro mM (Dynabeads MyOne Estreptavidina C1, Invitrogen Dynal), buffer de captura 5X (CB 5X, contendo 100 mM HEPES, 250 mM de acetato de potássio, 50 mM de acetato de magnésio e glicerol 50%), e tampão 5X (WB 5X, contendo 250 mM Tris HCl, pH 7,5, EDTA 5 mM, NaCl 5 M, 42,5 M _{octil-β-D-glicopiranosídeo).}
2. Para diversas experiências paralelas, recomenda-se preparar uma mistura mestre de água, captação de buffer e E. lisado coli e para realizar reações em tubos diferentes de uma tira de tubo de 200 mL-PCR (recomendado 0,2 mL Thermo-Strip, Thermo Scientific, AB-1114). Aqui, as quantidades de um tubo de reação são dadas. Resultados para cinco diferentes experimentos serão apresentados, que são ensaio de captura (A), controle de concorrência (C), suspenso (PD), controle de concorrência de pulldown (CPD), e ensaio de captura combinada de mais pulldown (PD A +).
3. Para cada reação, prepare 1,5 mL 1X WB, adicionando 0,3 mL WB 5X para 1,2 mL de água Milli-Q.
4. Prepare HAS-CC carregado estreptavidina revestida esferas magnéticas (caproBeads) em 200 mL tubo de tiras de PCR. Portanto, misture 25 mL de 100 M HAS-CC com 50 mL de 10 mg / ml estreptavidina revestida esferas magnéticas para cada alíquota, agite vigorosamente o suspensões resultando em temperatura ambiente por 2 min para permitir a ligação da molécula de biotina da HAS- CC à estreptavidina na superfície magnética do talão, e recolher as contas usando um imã forte (por exemplo, as tampas das tiras do tubo PCR usando o dispositivo caproMagTM magnético, caprotec Bioanalítica GmbH). Descartar o sobrenadante, re-suspender a caproBeads resultando em 200 mL WB, magneticamente recolher o caproBeads (nas calotas das tiras do tubo PCR), e descartar a WB supernating. Tubos de perto para evitar a secagem das esferas.
5. Preparar alíquotas de E.coli todo DH5αlisado de células em tubos novo PCR no 0-4 ° C usando um mix master (ver 2.2). Para uma reação, suplemento de um volume de água Milli-Q para um volume final de reação mix de 100 mL com 20 mL CB 5X. Misturar, adicionar 0,26 mg E. coli lisado, e misture suavemente por inversão. Apenas para C e CPD, adicionar 20 mL de solução 10 mM concorrente HAS e misture delicadamente por inversão (adicionar água Milli-Q em vez de solução para HAS A PD, e PD A +). Extrair uma amostra 1 mL de A para análise posterior (ver abaixo).
6. Suspender a caproBeads no lisado respectivos e incubar por 3 horas a 4 ° C mantendo as contas em suspensão pela rotação para permitir a ligação reversível de proteínas HAS ligação com a função de seletividade HAS da HAS-CC.
7. Coloque as suspensões A, C e A + PD na caproBoxTM (dispositivo para irradiar amostras bioquímicas com luz UV e, simultaneamente, de resfriamento, caprotec Bioanalítica GmbH) e irradiar para um tempo total de 30 min nos tubos fechados entre 0-4 ° C para formar uma crosslink covalentes entre a função de reatividade do HAS-CC às proteínas de ligação HAS. Portanto, remova as suspensões após longos intervalos de irradiação de 2,5 min, respectivamente, a partir do caproBoxTM fresco, em água gelada para ~ 15 s (especialmente as tampas), misturar várias vezes por inversão, muito em breve (~ 2 s) centrífuga para anular a suspensão restantes na tampa e coloque de volta para o caproBoxTM para o intervalo de irradiação que vem.
8. Adicionar 20 mL de solução 10 mM HAS para A, ou 20 de água Milli-Q mL de C, PD, CPD, e A + PD e incubar a suspensão por 10 min a 4 ° C para deslocar, em A, proteínas HAS ligação não reticulada à HAS-CC. Mantenha as contas em suspensão por rotação ou pelo manual intermitente re-suspensão.
9. Recolher o caproBeads do suspensões usando um imã forte (por exemplo, o caproMagTM), descartar o sobrenadante e lavar as contas de seis vezes - pelo re-suspensão e coleta - com 200 mL 1X WB e uma vez com 200 de água Milli-Q mL.
10. As esferas podem ser armazenados em água Milli-Q por várias semanas a 4 ° C. Protocolos alternativos existem para posterior processamento das proteínas capturado e sua identificação (ver discussão).
11. Lave as contas três vezes com 200 mL de acetonitrila 60% (ACN) e liberação das proteínas dos grânulos capturado em 10 min de incubação à temperatura ambiente sob agitação vigorosa com 200 mL de 60% de ácido trifluoroacético ACN/0.2% (TFA) (prepare recentemente) . Use LC-MS-grade reagentes e água.
12. Magneticamente recolher as contas, em separado e evaporar o sobrenadante à secura através de um evaporador centrífugo (por exemplo, concentrador de DNA a partir de MiVac GeneVac, Inc., UK). Descartar as contas.

3) SDS-PAGE das proteínas Capturado

1. Para SDS-PAGE, dissolver as proteínas capturados liberado do esferas magnéticas (evaporado ACN / TFA soluções a partir do passo 2,12) em 20 mL tampão de amostra SDS (50 mM Tris HCl, 320 mM β-mercaptoetanol, SDS 2,5%, 0,05% de azul de bromofenol , 10% de glicerol, pH 6,8). Misturar a amostra 1 mL extraídas A (veja o passo 2.5) com tampão de amostra de 19 mL SDS; usar 5 mL desta solução para análise de SDS-PAGE (0,25% do ensaio). Aqueça as amostras em tampão de amostra SDS min 10-95 ° C e deixar arrefecer à temperatura ambiente.
2. Analisar por SDS-PAGE (configuração genérica: OLS ® ProPage 40-20% Tris / glicina pré-cast géis; OLS OmniPage mini-sistema de eletroforese em gel; SDS tampão de corrida: 25 mM Tris base, glicina 200 mM, 0,1% SDS, pH 8,3 ; executar min de tempo de 90 a uma tensão constante de 180 V sob refrigeração de gelo do tampão de corrida SDS).
3. Prata manchar o gel utilizando um método de MS prata compatível mancha (por exemplo ProteoSilver Kit Prata Stain da Sigma). Um resultado representativo é mostrado na Figura 2.

4) Em Digest gel-tríptico de proteínas e peptídeos Extração de Bandas Gel

1. Lave o gel prata manchada pelo menos três vezes com 100 mL de água Milli-Q por 10 minutos após a prata solução de parada mancha foi removida.
2. Cortar as bandas de gel (por exemplo, usando um bisturi limpo e transferir para um tubo Eppendorf 0,5 mL) e armazenar a -20 ° C ou diretamente do processo. Lavar as bandas de gel por 15 min, respectivamente, com 100 mL de água, 100 mL de etanol 50%, 100 mL de água, 100 mL de etanol 50%, e por 5 minutos com etanol puro. Repita este procedimento de lavagem, mais uma vez.
3. Re-hidratar a banda gel com 10 mL de solução-gel a digestão (12,5 ng / mL de tripsina seqüenciamento grau em 50 mM de bicarbonato de amônio, prepare adicionando 7,5 mL 0,5 mg / mL solução de tripsina em HCl 1 mM para 292,5 mL de bicarbonato de amônio 50 mM ) por 45 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e substituir por 20 mL de bicarbonato de amônio 50 mM (sem tripsina), seguido de incubação a 37 ° C durante a noite agitando.
4. Recolher o sobrenadante. Para a extração de peptídeo, incubar a banda gel com 20 mL de ácido fórmico 5% (FA) por 15 min, agitando, adicione20 ACN mL e incubado por mais 15 minutos agitando. Combine o sobrenadante com o sobrenadante anterior e repita o procedimento de extração de peptídeo, mais uma vez.
5. Evaporar a combinação de três sobrenadantes à secura, dissolver em 10 mL FA 5% agitando e aplicação de ultra-som (banho ultra-som, por exemplo, Sonorex de Bandelin, Alemanha) e prosseguir com a dessalinização (passo 5.2 e mais).

5) Digest tríptico de Proteínas Capturado e Preparação de Peptídeos por LC-MS/MS

1. Dissolve as proteínas capturados liberado do esferas magnéticas (ACN evaporou / TFA soluções a partir do passo 2.12) em 10 mL de bicarbonato de amônio 50 mM utilizando um banho de ultra-som e vórtex, adicione 1 mL 0,5 mg / mL de tripsina em HCl 1 mM e incubar a solução a 37 ° C durante a noite.
2. Dessalinizar a solução contendo os peptídeos trípticos das proteínas capturados usando material de C18 (por exemplo, 2-10 StageTips mL, 20 mL ponta, Proxeon Biosystems A / S, Odense, na Dinamarca, o procedimento do fabricante: pré-condição, com 10 mL de metanol 50% / 5 FA%, se equilibram com 10 mL FA 5%, a carga com peptídeos de proteínas capturado, lave com 10 mL FA 5%, eluir duas vezes com 10 mL de metanol 50% / FA 5%).
3. Evaporar os peptídeos dessalinizada em metanol 50% / FA 5% à secura, dissolver em 5,5 mL FA 0,1% agitando e aplicar ultra-som (ultra-som de banho) e analisar a amostra por nanoLC-MS/MS.

6) Análise NanoLC-MS/MS

1. Transferência de amostra em placa de amostra e colocar a placa para a cromatografia líquida de nano-flow (nanoLC) sistema (por exemplo, NLC-Fácil sistema de cromatografia líquida; Proxeon Biosystems A / S, Dinamarca).
2. Use FA 0,1% em água como fase móvel A FA e 0,1% em ACN como fase móvel B. Só utilize solventes LC-MS grau.
3. Carga de 5 mL da solução de peptídeo diretamente em uma pré-coluna (Biosfera nanofluxo por exemplo, C18, 5 mm, 120 A, 20 x 0,1 mm; NanoSeparations, Países Baixos), acoplado a uma coluna de análise (da Biosfera nanofluxo por exemplo, C18, 5 mm, 120 Å , 100 x 0,075 milímetros; NanoSeparations, Países Baixos), utilizando 5% FA ACN/0.1%.
4. Durante LC, peptídeos eluir durante um gradiente de 80 min linear de 5% FA ACN/0.1% a 40% FA ACN/0.1%, seguido por um adicional de 2 min a 100% ACN/0.1% FA e permanecendo em 100% ACN/0.1% FA para outra 8 min com uma taxa de fluxo controlado de 400 nL / min.
5. Realizar análise de massa (MS) espectrometria de peptídeos eluídos em uma alta precisão state-of-the-art espectrômetro de massa (por exemplo, LTQ Orbitrap XL espectrômetro de massa; Thermo FisherScientific, Alemanha, equipado com uma fonte de íons nanoelectrospray de ionização electrospray (ESI); Proxeon Biosystems A / S, Dinamarca).
6. Realizar a análise de espectrometria de massa no modo de dados-dependentes para alternar automaticamente entre Orbitrap-MS (modo de perfil) e LTQ-MS/MS (modo centróide) de aquisição.
7. Controlar a massa ciclo espectrômetro, definindo o tempo de injeção controle automático de ganho.
8. Adquirir pesquisa full-scan MS espectros (de m / z 300-2000) na Orbitrap com resolução r = 60.000 em m / z 400 (após a acumulação de um valor-alvo de 500.000 cargas no ion trap linear).
9. Definir o instrumento para seqüencialmente isolar os íons mais intensa (até cinco, dependendo da intensidade do sinal) para a fragmentação no ion trap linear usando induzida por colisão de dissociação (CID) em um valor-alvo de 10.000 acusações. Os íons fragmento resultante são registradas no LTQ.
10. Para medições precisas em massa no modo de MS, use o cobrado individualmente polydimethylcyclosiloxane fundo ion (Si (CH _{3) 2} O) ₆ H ⁺ (m / z 445,120025) gerados durante o processo de electrospray de ar ambiente, a massa de bloqueio em tempo real para internos recalibração.
11. Dinamicamente excluir íons de destino já mass-selecionados para CID para a duração de 60 s.
12. Conjunto de triagem cobrar do Estado e da rejeição de íons com carga para a CID não atribuído.
13. Mais massa configurações espectrometria são as seguintes: set tensão spray para 1,6 kV temperatura conjunto de transferência aquecida capilar para 200 ° C, e energia de colisão normalizado é de 35% para MS ^2,. O sinal mínimo exigido para MS ² é de 500 contagens. Aplicar uma ativação q = 0,25 e um tempo de ativação de 30 ms para MS ² aquisições.
14. Para limpar o sistema LC, realizar uma corrida em branco entre duas medições consecutivas CCMS.

7) Identificação de peptídeos e proteínas através da Pesquisa de Automated Sequence Banco de Dados

1. Use um algoritmo de identificação de proteínas para analisar os dados MS / MS (no presente caso, armazenados em arquivos raw), por exemplo, SEQUEST implementado em BioworksBrowser 3.3.1 SP1 (Thermo FisherScientific, Alemanha) e Tandem X! (A Organização Mundial da máquina Proteome; versão 2007.01.01.1) implementado no Scaffold software 3 (versão Scaffold_3_00_03, Proteome Software Inc., EUA).
2. Executar banco de dados automatizado busca contra o UniProtKB mais recentes / suíços-Prot www.expasy.org lançamento do banco de dados do organismo investigado (banco de dados usado para estudo: Escherichia coli, cepa K12, solte 57-11).
3. Use as seguintes configurações de banco de dados automatizado procurar dentro SEQUEST: 5 tolerância precursor ppm, 1 amu tolerância íon fragmento, e especificidade de tripsina completo, permitindo que até duas clivagens perdida. Permitem modificações como fosforilação variável em serina, treonina e tirosina; oxidação de methionines; desamidação em asparaginas e glutamina; acetilação em lisina e serina; formylation em lisina, e metilação em arginina, lisina, serina, treonina e asparagina. Não use modificações fixa na busca de banco de dados.
4. Carga srf ou dta e fora arquivos gerados pelo SEQUEST no andaime 3, que realiza avaliação de probabilidade de atribuições de peptídeos e proteínas identificações através da combinação SEQUEST e buscas de banco de dados X! Tandem. Scaffold é útil para comparar e visualizar facilmente listas de proteínas de várias amostras (no caso vertente, A, C, PD, CPD, e PD A +).
5. Definir os parâmetros dentro dos três Scaffold software a considerar peptídeos apenas com ≥ 95% de probabilidade, conforme especificado pelo algoritmo Profeta Peptide (ref.13). Conjunto de probabilidades identificação de proteínas para as atribuições de peptídeos múltiplos ≥ 95% de acordo com o Profeta algoritmo de proteínas ^13. Para identificação única proteína peptídeo, arbitrariamente definir probabilidade de proteína para ≥ 50% e manualmente inspecionar o peptídeo correspondente espectros MS / MS. Proteínas que compõem os peptídeos semelhantes e não podiam ser diferenciados com base em MS / MS a análise só são agrupadas pelo software para satisfazer os princípios da parcimônia. A taxa de descoberta de identificações falsas estimado peptídeo pode ser determinada usando a abordagem de banco de dados revertido proteínas e devem ser <1%.
6. Resultados representativos de experimentos CCMS são dadas nas Tabelas 1, 2 e Tabela Suplementar S1 (mente que o banco de dados de proteínas não é up-to-date para algumas proteínas, por exemplo, PrmB (aka YfcB) ou RsmH (aka MraW)), bem como na Figura 3.

8) Resultados Representante

Tabela 1:

Proteína	ORF	MW kDa /	Descrição	Substrato	A	C	PD	CPD	A PD +
Dcm	b1961	53,5	DNA-citosina MTase	DNA (m5C)	1	0	0	0	1
RlmI	b0967	44,4	23S rRNA m5C1962 MTase	rRNA (m5C)	17	0	17	0	20
RlmL	b0948	78,9	23S rRNA m2G2445 MTase	rRNA (M2G)	12	0	0	0	10
TRMB	b2960	27,3	tRNA (guanina-N (7) -)-MTase	tRNA (M7G)	11	0	0	0	13
CmoA	b1870	27,8	tRNA (cmo5U34)-MTase	tRNA (mcmo5U)	7	0	0	0	4
RsmG	b3740	23,4	16S rRNA M7G MTase	rRNA (M7G)	6	0	1	0	5
RsmH	b0082	34,9	16S rRNA m4C1402 MTase	rRNA (m4C)	5	0	0	0	7
Rsmd	b3465	21,7	16S rRNA m2G966 MTase	rRNA (M2G)	2	0	0	0	2
RSMB	b3289	48,3	16S rRNA m5C967 MTase	rRNA (m5C)	1	0	0	0	0
MnmC	b2324	74,4	Proteína bifuncional inclui tRNA (mnm (5) s (2) U34)-MTase	tRNA (mnm5s2U)	1	0	0	0	0
PrmB	b2330	35,0	Proteína ribossomal 50S L3 Gln150 MTase	proteína (Gln)	13	0	0	0	15
Cher	b1884	32,8	Quimiotaxia MTase proteína	proteína (Glu)	0	0	0	0	1
Cfa	b1661	44,9	Ciclopropano-graxos de fosfolipídios-acil-sintase	pequena molécula	15	0	0	0	14
Tam	b1519	29,0	Trans-aconitate 2-MTase	pequena molécula	2	0	0	0	3
CysG	b3368	50,0	Sintase Siroheme inclui uroporfirinogênio III-C-MTase	pequena molécula	1	0	0	0	2
SMTA	b0921	29,8	Proteína SMTA	(? A)	7	1	0	0	8
MtnN	b0159	24,4	5'-Methylthioadenosine / HAS nucleosidase	b pequena molécula	36	0	0	0	39
GINA	b3870	51,9	Glutamina sintetase	pequena molécula de c	90	0	0	0	97
RplK	b3983	14,9	50S proteína ribossomal L11	de proteína MTase PRMA d	2	0	0	0	2

Não ^um (totalmente), caracterizada

^b Não metilação mas clivagem da ligação glicosídica de HAS

^c Não metilação mas vinculativo da HAS no site ATP de ligação, como mostrado por meio de experimentos com CCMS ATP como concorrente (dados não mostrados)

^d substrato da proteína ribossomal 50S L11 MTase PRMA; identificação específica reproduzível por CCMS (dados não mostrados)

Tabela 1: MTases e outras proteínas identificadas por experimentos selecionados CCMS. Os números dados denotam a contagem de peptídeo não ponderada espectral por proteína. Amostras são duplicatas dos analisados ​​por SDS-PAGE/silver mancha na Figura 2. MTases muito mais HAS e outras proteínas de ligação são identificados no ensaio CCMS (A) em comparação com o pulldown (PD) e especificidade HAS é mostrado pela ausência quase completa destas proteínas no controle da concorrência (C).

Tabela 2:

	A	C	PD	CPD	A PD +
A	111 (64)
C	65 (41)	107 (46)
PD	25 (15)	23 (13)	61 (17)
CPD	23 (13)	22 (12)	20 (14)	47 (14)
A PD +	87 (61)	64 (41)	23 (14)	22 (12)	124 (67)

Tabela 2: Número total de proteínas identificadas no corre CCMS e sobreposição de proteínas entre as corridas. O número de proteínas identificadas com pelo menos dois peptídeos são dadas entre parênteses. A alta reprodutibilidade do método pode ser inferida a partir da sobreposição de alta proteína (principalmente de proteínas inespecíficas) entre experimentos comparáveis ​​(A x C x A e, especialmente, A + PD, mas também PD vs CPD), especialmente com as proteínas identificadas com robustamente pelo menos, dois peptídeos. Ver também a Figura 3 para os diagramas de Venn e S1 Tabela Suplementar para uma lista de todas as proteínas identificadas.

Figura 1A: estrutura química do composto trifuncional Captura (CC). A função de seletividade é moldado com uma gota, a função de reatividade com uma estrela, ea função de classificação com uma meia-lua. O quimicamente estável _{S-adenosil-L-homocisteína} (HAS) é o produto cofactor de _{S-adenosil-L-metionina} (SAM), após a transferência de metila grupo por SAM-dependente MTases, para o qual HAS age como um inibidor do produto.

Figura 1B: CCMS "on-talão de fluxo de trabalho ". O CC é obrigado a esferas magnéticas pela sua função de triagem (a), o caproBeads assim formadas são incubadas com a mistura de proteínas complexas (b), onde um equilíbrio reversível binding (c) é estabelecida entre a função de seletividade de do CC e as proteínas-alvo. Upon a irradiação UV (d), a função de reatividade forma uma crosslink covalentes. Depois de lavar a esferas magnéticas tendo as proteínas capturados (e), clivagem da proteína reticulado CC-complexos de esferas magnéticas (f) e tríptica digerir (g), as proteínas capturados podem ser identificados por MS análise dos peptídeos trípticos.

Figura 2: SDS-PAGE/silver análise de manchas de proteínas capturado (depois f passo na Figura 1B). A descrição é dada lane em cima do gel (MW: marcador de peso molecular com os pesos correspondentes molecular das bandas marcador dado ao próprio direito; L: 0,25% da amostra tirada do E. coli DH5a lisado de células inteiras antes de adicionar o caproBeads na etapa b na Figura 1B; A: ensaio com adição de um excesso de HAS livre após irradiação UV d passo na Figura 1B, C: controle do ensaio, incluindo um excesso de HAS livre como concorrente durante as etapas c e d na Figura 1B (essencial para determinar quaisquer proteínas não especificamente capturado); PD: significado suspenso não passo d UV irradiação na Figura 1B e sem adição de livre HAS; CPD: controle de pulldown com HAS como concorrente; A PD +: teste combinado mais pulldown significado sem adição de HAS livre durante o fluxo de trabalho). Proteínas identificadas pelo MS a partir de cut-out bandas gel de proteínas, após um gel digerir tríptica são dadas aos leftt muito. É evidente que a foto-reticulação aumenta a produtividade e sensibilidade do experimento, a especificidade e pode ser facilmente testada em experimentos de competição para usar um excesso de HAS livre. Ver Tabela 1 para MTases e outras proteínas identificadas por experimentos selecionados CCMS de amostras duplicadas daqueles mostrado na figura presente.

Figura 3: diagramas de Venn explicando a sobreposição de proteínas identificadas em ensaio CCMS (A), controle de concorrência (C), e suspenso (PD). Esquerda: Número de MTases e nucleosidase HAS, apenas, referindo-se a Tabela 1. Direita: Número de todas as proteínas identificadas referindo-se a Tabela 2 e Tabela S1 Complementar. O número de proteínas identificadas com pelo menos dois peptídeos são dadas entre parênteses.

Discussion

As seguintes precauções e comentários podem ser úteis quando, seguindo o protocolo descrito: a) A vantagem principal de CCs reside na formação de uma ligação covalente entre o CC eo MTase, pois isso permite subseqüentes condições de lavagem rigorosa. A reticulação covalente é realizado por um fotorreação desencadeada pela luz UV (310 nm max.). Luz do teto normal contém apenas uma pequena fração dos raios UV, no entanto, proteger a HAS CC-de maior tempo de exposição à sobrecarga ou mesmo a luz sol a irradiação controlada e de refrigeração na caproBox. b) As amostras biológicas de que o MTases devem ser isolados podem conter proteínas propensas a desnaturação, conseqüentemente, é obrigatório manter as amostras legal e para evitar a formação de espuma em todos os momentos. c) O caproBox esfria as amostras para 0-4 ° C, as lâmpadas que emitem a luz UV, no entanto, também emitem calor. Portanto, é necessário fazer uma breve centrifugação os frascos antes da irradiação, de modo proteínas aderindo à tampas de frasco ou paredes não pode formar sementes precipitação. d) Se re-suspensão das esferas magnéticas (por exemplo, as soluções de lavagem) não é possível com a mão, logo aplicar ultra-som, colocando as amostras em banho de ultra-som. e) Freshly preparar a solução ACN 0,2% TFA/60%. Descobrimos que de outra forma as proteínas capturados não pode ser clivada dos grânulos. f) A análise final das proteínas capturado é realizado por LC-MS/MS. Espectrometria de massa é um método altamente sensível. É necessário o uso de reagentes exclusivamente LC-MS grau nas etapas finais (passo 2.11 e mais). Evitar a contaminação dos experimentos por fontes de proteína externa, por exemplo, a queratina provenientes de poeira ou do experimentador. Particularmente durante as etapas finais da digestão, recomenda-se a prestar atenção a um espaço de trabalho limpo, usar luvas e um casaco de laboratório e, possivelmente, uma rede de cabelo ou, idealmente, realizar as etapas finais em uma bancada limpa. Prepare a 50 mM tampão bicarbonato de amônio usado para digerir tríptica em água LC MS grau, filtrar através de 0,22 mM, armazenar alíquota de filtro, a -20 ° C, e usar apenas uma vez cada alíquota para evitar contaminações. A solução de tripsina (seqüenciamento grau, Roche, preparar um 0,5 mg / mL solução pela adição de 1 mM HCl para liofilizado tripsina) pode ser armazenado a 4 ° C por várias semanas. g) Para obter espectros de massa de confiança é essencial para ter um spray estável em análise ESI-MS/MS. h) Para outros sistemas LC-MS/MS do que o utilizado no presente estudo, parâmetros de medição e algoritmos de identificação de peptídeos devem ser ajustadas individualmente.

As seguintes modificações são possíveis com relação ao protocolo descrito: a) Como alternativa para liberar as proteínas dos grânulos em 60% TFA ACN/0.2% (passo 2.11), as proteínas podem ser diretamente tryptically digerida dentro de uma suspensão de esferas (volumes mesma no passo 5.1) ou, por SDS-PAGE, as proteínas podem ser liberados, suspendendo as contas de aquecimento e coletadas após a etapa 2,9-95 ° C por 10 min em tampão de amostra SDS (ambos, toda a suspensão ou apenas o sobrenadante pode ser carregado no bolso gel). Descobrimos que os grânulos liberam lentamente pequenas quantidades de polímeros em solução aquosa digerir tríptica durante on-bead digerir tríptica mesmo após várias etapas de lavagem aquosa. A contaminação interfere com polímero MS identificação de peptídeos e pode ser lavado as contas com 80% ACN (pelo menos três vezes). Após as etapas de lavagem de 80% ACN, as contas devem ser lavadas uma vez com água antes de on-bead digerir tríptica. b) Western blots utilizando estreptavidina-peroxidase e substrato horseraddish ECL também pode ser usado para visualizar crosslinking bem-sucedida do CC contendo biotina às proteínas. Portanto, ou o gel obtido após a etapa 3.2 pode ser apagado ou, porque a sensibilidade é cerca de 10 vezes maior do que a coloração de prata de géis, 10 amostras mL após a etapa 2,7 também podem ser analisados ​​por western blot. Lembre-se que neste último caso proteínas endogeneously biotinilado também será detectada além de proteínas artificialmente biotinilado pela HAS-CC. c) Descobrimos que depende do sistema especial (lisado, dirigida proteínas-alvo, seletividade e reatividade da função que ele CC), se o "off-talão" configuração, onde a reação de reticulação ocorre entre CC livre e proteínas em solução ⁴ ou o momento descrito "on-talão" configuração (Figura 1B) tem melhor desempenho.

Em geral, o método também deve ser compatível com qualquer estado-da-arte da proteína isótopo estável ou tecnologia rotulagem peptídeo, ou avaliação da amostra captura por eletroforese em gel 2D. No "off-talão" de configuração, também é possível capturar proteínas dentro das células inteiras (dados não publicados). Além disso, a droga ou site cofactor ligação de uma proteína pode ser delineado por determinar a posição de reticulação bem perto do CC dentro da seqüência de proteínas por MS seqüenciamento de peptídeos. O modo de ligação de uma pequena molécula de uma proteína pode ser explorado usando diferentes chemical posições de anexação na função de seletividade e comprimentos diferentes linker. Como mostrado no presente estudo, os parceiros também proteína de ligação das proteínas dirigida pela função de seletividade (RplK como substrato de PRMA) ou desconhecidas interações pequena molécula de proteína (HAS para GINA) podem ser identificados. Resumida, a característica adicional do CCs, a reatividade foto crosslinking, permite o isolamento e identificação de proteínas de baixo abundante ou famílias de proteínas funcionais a partir de misturas complexas de proteínas com alta sensibilidade e fornece aos cientistas uma ferramenta adicional para o estudo de moléculas pequenas - interações proteína .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SAH caproKit™	caprotec bioanalytics GmbH	1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)	Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer
caproBox™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)	For reproducible photo-activation while cooling the samples
caproMag™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5100-001	For easy handling of magnetic particles without pipetting