Summary
復職の手続きとして知られている再発の動物モデルは、薬物探索に再発のストレスの役割を研究するために広く使用されている。ここで、我々は、穏やかな、断続的な電気フットショックへの急性曝露を経由して実験用ラットに求めてコカインの回復を誘導する方法で報告する。
Abstract
薬物中毒の最も狡猾な側面は、再発の高傾向です。復職の手続きとして知られている再発の動物モデルは、薬物使用への再発の神経生物学と現象学を研究するために広く使用されている。手続き型のバリエーションは、過去数十年間に浮上しているものの、ほとんどの従来の復職の手続きは、薬物自己投与（SA）モデルに基づいています。このモデルでは、動物は、薬物を得るためにオペラント反応を行うために訓練される。その後、動作は、源泉徴収応答偶発補強によって消滅されています。薬剤のシークの復活は、そのような訓練の薬剤、薬物関連のキューへの再暴露、またはストレッサー1〜露出の注入などの個別のイベントによってトリガされます。
復職の手続きは、もともとラットとサル1、2の薬物探索を回復するためのトレーニングの薬剤への急性非偶発的な露出の能力を研究するために開発された。復職の手続きは以来、1、3、4を求めている薬剤の再発で、薬物関連手がかりとストレスの様々な形態への暴露を含む環境からの刺激、の役割を研究するように変更されています。
過去15年間、復職の文学の主要な焦点は、薬物の再発におけるストレスの役割になっている。この関係を研究するためのストレスの最も一般的に使用される形態の1つは、穏やかな、断続的、電気footshocksに急性曝露です。薬物探索の回復を誘導するためにフットショックストレスの能力は、もともと静脈ヘロインSA 5の歴史を持つラットでシャハムら（1995）によって実証された。その後、効果は静脈内コカイン、メタンフェタミン、およびニコチンSAだけでなく、経口エタノールSA 3、6の歴史を持つラットへの一般化だ。
薬剤のシークのフットショック誘発性回復が確実にかつ確実に達成することができますが、それは特定のパラメトリックの変数に敏感になる傾向にある効果です。これらは、絶滅と回復のテストセッションの配置、フットショックストレスの強度と持続時間、及び絶滅と回復のためのテスト中に薬物関連手がかりの存在が含まれています。ここで我々が求めているストレスとコカインの間の関係を研究するために一貫した成功を収めて使用されていることを求めてコカインのフットショック誘発性回復のためのプロトコルを提示する。
Protocol
1。動物の住宅と環境に順応する手順
- ビバリウムの到着の時に300〜325グラムの重さと男のロングエバンスラットは、、水のボトルや食品を収容するためにワイヤグリッドふたで、再生紙ペレットの寝具を含む標準的なプラスチック製ケージに個別に収容されています。
- ラットは、温度および湿度調整ビバリウムで、逆明暗スケジュール（19:00〜午前7時00点灯）に維持されます。
- 食料と水は実験を通してホームケージ内を自由に摂取可能です。
- ラットは手術前に一週間のためのビバリウムと住宅の条件に順応するために許可されています。この期間中ラットは定期洗浄、給餌、と体重のモニタリングを除いて、邪魔されずに残されています。
2。静脈内カテーテル手術
- イソフルランガス麻酔下で、そして標準的な無菌手術法を用いて、ラットを右頸静脈にシラスティックカテーテルを用いて調製されています。頭蓋骨の表面で修正されたカニューレ（プラスチックOne）、そしてカニューレにカテーテルの出口は、宝石商"ネジと歯科用セメントで頭蓋骨にマウントされています。外科的処置の詳細については、、8 7を参照してください。
- 手術の終了時に、カテーテルは、50％のヘパリン（1000 IU）と50％のデキストロース（25 g/50 mL）を含む溶液の約0.2 mLでフラッシュされます。プラスチック製のブロッカーは、外部の残骸からカテーテルを保護するために、そしてカテーテルの開存性を維持するために、カニューレの開口部に配置されます。
- 手術の時に、そして再び手術の翌日に、ラットを鎮痛剤ケトプロフェンの5 mg / kgを、SCを、投与されています。
- ラットは、少なくとも7日前に、実験前に手術から回復するために許可されています。この時間の間に、ラットを体重および一般的な健康の清掃と給餌ルーチン、および日々の監視の例外を除いて、ホームケージに静置されています。回復期間の最終日に、カテーテルは、カテーテルの開存性を検証するためにヘパリン/デキストロース溶液（2.2節）でフラッシュされます。
3。行動手順
すべての行動の手順は、メッドアソシエイツ株式会社（セントオールバンズ、バーモント州）によって供給される装置を用いて実施されています。専用の部屋に収容装置は、標準的なオペラントチャンバー、音減衰エンクロージャ内に含まれるそれぞれのセットが含まれています。各オペラントチャンバーは2つの格納式のレバー、ステンレス製の棒の床の上の両方上昇6.5センチメートルが装備されています。白色光がひとつレバーの上に置かれている刺激、およびそのレバー（いわゆる"アクティブ"レバー）輸液ポンプ（Razel科学機器の刺激光および活性化の同時照射の結果、セントオールバンズ、オン応答VT）。ポンプは、ちょうどオペラントチャンバーの外に棚の上にありながら、音減衰エンクロージャ内にされています。他のレバー（いわゆる"非アクティブ"レバーは）すべての実験手順を通してチャンバー内に延長残されており、このレバーに対応するには、結果なしです。最後に、各チャンバーは、鋼棒の床にスクランブラを通して定電流、断続的な、避けられない、電気フットショックを実施する能力を備えています。すべての実験条件（例えば、刺激のプレゼンテーション、薬剤注入、ショックの配信）、だけでなく、データの記録と統合は、試験室と中央のコンピュータのオペレーティングメッドアソシエイツソフトウェア（MED - IV）との間のインタフェースを通じて行われます。
実験5つのフェーズで行われる：1）馴化、2）コカインSA、3）薬物のない期間、4）絶滅、および5）復職のためのテスト。すべてのフェーズ（ドラッグフリーの期間を除く）で、ラットをオペラント試験室への収容室から毎日のセッションのために転送されます。動物は、小さなプラスチック容器に、個別に転送されます。食料と水は、オペラントチャンバーでは利用できません。
- 慣れ
- 第一コカインSAセッションを（3.2節を参照）の前の二十四時間は、ラットを、単一の2時間のセッション中にオペラントチャンバーに慣らすために許可されていますが、このセッション中にアクティブレバーが収納されています。
- コカインSAトレーニング
- それぞれの日常のトレーニングセッションの前に、ラットは、住宅のお部屋に秤量する。その後彼らはオペラントチャンバーに転送されます。
- オペラントチャンバー、スプリングとチューブアセンブリ（薬物注入ポンプから伸びる）に配置されている時には、頭蓋骨にマウントされたカニューレに接続されています。
- ラットは8-10日（いずれかを連続してまたはセッション5と6の間に2つの介在する"休日"を含む）の合計のために、毎日3時間のセッション中にコカイン塩酸を自己管理することが許可されます。
- 朝（9:00-12:00）と午後（13:00〜16:00）の間の代替のSAセッション。実験（すなわち絶滅とテスト）の後続フェーズの手順はtの両方で発生するため、SAのセッションのタイミングを交互さすべての動物のための一日のIMEを使用する（セクション3.4と3.5を参照）、従って、この配置は、その後の薬物探索行動の一日の時間のいずれかの交絡の影響を防ぐことができます。
- 各トレーニングセッションは、動物がアクティブレバー撤回とオペラントチャンバー内に配置される中、5分間馴化期間が付いています。
- トレーニングセッションの開始時に、アクティブレバーはチャンバー内に拡張され、刺激光が（アクティブレバーの上にある）で30秒間点灯します。さらに、家の光は、この時点で活性化され、セッションを通して点灯したままになります。一緒に、これらのイベントは、コカインの可用性を通知する。
- セッション中に、アクティブレバー上の応答は、補強の固定比率- 1のスケジュールでコカインの3 - S静注（0.23 mg/65μL、IV）によって補強されている。輸液ポンプと薬物送達の活性化と並行して、アクティブレバー上の刺激光の20のアクティベーションです。この20秒の光のプレゼンテーションでは、追加のアクティブレバーの応答が記録されたが補強されていない時に"タイムアウト"の期間に対応しています。
- 動物は、3時間のセッションごとに50注入の最大を許可されています。我々は日常的に我々の仕事でこの基準を課すと、我々の経験では、過量投与による死亡例の事件を排除できない場合には、大きく、減少させることを発見した。
- それぞれの日常のセッションの終わりに、ラットのカテーテルはヘパリン - デキストロース溶液を0.2から0.3 mLでフラッシュされます（セクション2.2を参照）し、ラットは、ホームケージに戻されます。
- 薬物のない期間
- 最終的なコカインSAセッションの後、ラットは、少なくとも7日分は自分のホームケージで（定期洗浄、給餌、と体重のモニタリングを除く）静置されています。
- コカイン訓練された行動の絶滅
- ラットは、絶滅の訓練のため09:00-10:00の間にオペラントチャンバーに転送されます。
- 春とチューブアセンブリは、頭蓋骨にマウントされたカニューレに接続されています。
- SAのトレーニングのための条件と一致し、絶滅の訓練の毎日は、動物がアクティブレバー撤回とオペラントチャンバー内に配置される中、5分間馴化期間が付いています。
- ラットを30分間隔で区切られた、4 60分絶滅のセッションが与えられます。各60分間のセッションは、トレーニングセッションの開始時（すなわち、家の光のイルミネーション、アクティブレバーの延長、および30秒アクティブレバー上の刺激光の照度）で発生する同じイベントによって開始されます。セッションを通して、SAのトレーニング中に存在していたすべての条件は、そのアクティブレバーの応答を除いて、（すなわち、20秒と輸液ポンプの3 - Sの活性化のための刺激光の応答 - 偶発的な照明）が維持されるコカインの注入ではもはや強化です。各60分絶滅のセッションを分離、30分間隔の間、アクティブレバーが収納され、家の光が消滅する。
- 最後の60分間のセッションの終わりに、ラットは彼らのホームケージに戻されます。
- 手順3.4.1。 3.4.5へ。 3日間連続して繰り返されます。
- フットショックストレスによるコカイン訓練された行動の復権
- ラットは09:00-10:00の間にオペラントチャンバーに転送されます。
- オペラントチャンバー内に配置されている時には、春とチューブアセンブリは、頭蓋骨にマウントされたカニューレに接続されています。
- トレーニングと絶滅のための条件と一致し、5分間馴化期間は、ラットがアクティブレバーが収納されて、オペラントチャンバー内に配置される際に、提供されています。
- ラットは、絶滅の段階で与えられたものと同じ30分間隔で区切られた2つの60分の絶滅のセッションを（3.4.4を参照。）、与えられている。
- 第二の60分のセッションの後、以前にアクティブレバーの応答の合計数が15未満の場合、動物はさらに30分間隔の後に復職するためのテストを受けています。この30分間隔で、フットショックまたは偽フットショック（すなわち、フットショックは）（3.5.6を参照してください。）投与する。アクティブレバー15またはより少ない応答の基準は番目のセッション後に達成されていない場合は、追加の絶滅のセッション（s）は回復のための試験の前に与えられます。
- 第二60分絶滅のセッション（または15個以下の応答の絶滅の基準を確立するために必要な追加の60分絶滅のセッション（複数可）の後に）10分後には、動物は、断続的な電気フットショックストレスの20分（または偽にさらされているオペラントチャンバー内のフットショック）。フットショックは、アクティブレバーが取り消されると、家と刺激のライトが消灯している時に与えられます。フットショックを40秒（10から70の範囲）の平均間隔で可変タイムスケジュールに従って配信されます。それぞれのショックは、0.9 mAの強度で配信され、期間は0.5秒です。フットショックのこれらのパラメータは、大規模なパイロットの仕事に基づいています。フットショック曝露の最小強度と持続時間と、求めてコカインの信頼回復を確立するために私たちの研究室で実施。これらのパラメータの下で、動物は0.5秒衝撃に対する再帰ジャンプの応答を示し、そして時折簡単な発声を発する。動物はショック期間を通じて観測されていますが、衝撃の強さは、苦痛のより顕著兆しを誘導するのに十分な大きさではありません。
- すぐにフットショックセッションの終了に続いて、アクティブレバーが拡張され、ラットは、絶滅の条件の下でレバーを押しに許可されます（すなわち、応答はコカインで補強されていませんが、輸液ポンプの刺激光および活性化の照明に起因する継続か）。この期間は、復職のための試験として定義され、持続時間で、通常は1-3時間です。ほとんどの応答では、テストセッションの初めの部分（最初の30分、1時間）に発生し、続いてより多くの拡張テスト期間にわたって消灯。このように、1時間のテストは、効果のより完全な絶滅のプロファイルを提供する長いテスト期間で、復職の効果をキャプチャするだけで十分です。
- 反復測定のデザインが採用されている場合、それぞれのラットは、フットショックと偽フットショックの条件下でテストされています。手順3.5.1。 3.5.8に、後続のテストの日に繰り返される、と復職のための代替試験（フットショックまたは偽フットショック）を投与されています。
4。代表的な結果：
図1自己管理トレーニング、絶滅、そして復職のテスト中に、アクティブおよび非アクティブレバー上での活動と、スタイリッシュで応答プロファイル。
図1は、本明細書に記載の実験プロトコルのさまざまな段階で得られるものの典型的な、様式化されたオペラント反応のプロファイルを示す。
1。アクティブレバーの応答
- コカインSAトレーニング。図1（左パネル）は、点滴とアクティブレバーを押すの総数の数の両方を含む典型的なコカインSAトレーニング曲線を示しています。ラットは一般的に1から3のセッション内でコカインSAを取得し、動作が確立されると、以降のセッション上に薬物摂取の安定率（分散セッションの間に一般的に20％未満）を維持する。
- コカイン訓練された行動の絶滅。これは、絶滅の1日目に、応答が初めて非強化である場合、応答の合計数、アクティブレバーでは時よりも最初に高いことが図1（中央のパネル）で見ることができます。トレーニングフェーズの終わり（いわゆる"絶滅のバースト"に対応する）、徐々に、4つの絶滅のセッションにまたがって、減少して応答。 2日目および絶滅の3に、（前日の最後のセッション中に観察される相対的な）応答のいくつかの回復が観察されることがありますが、応答は一般的に、一般的に絶滅の前日の開始時よりも少ないです、そして絶滅その日のための4つのセッションをより急速に進行する。
- 求めてコカインの復職。これは、断続的なフットショックへの暴露の20分は、前述の絶滅のセッションの終了時に観察される相対的非強化アクティブレバーの応答の増加を、誘導すること（右パネル）を図1に見ることができます。フットショックはまた、偽のフットショックを投与される条件下で観察される相対的な応答の増加を誘発する。このように、フットショックストレスによって求めるコカインの復職は、以下のいずれかで表現することができます：1）絶滅のセッションの応答に対して相対的フットショックへの曝露後の非強化反応数の増加、フットショックまたは非強化の2）増加数の前に偽のフットショックにフットショックの相対的な後の応答。
2。非アクティブレバーの応答
それはすべての実験のフェーズを通して、非アクティブレバーに関連付けられている非常に低い応答のレベルが存在する、図1（赤線）で見ることができます。しかし、このレバーで応答の緩やかな増加が時々フットショックストレスへの暴露後に観察される。であっても応答がこのような増加が発生した場合には、応答のアクティブレバーの増加が比例してはるかに大きい傾向にある。
Discussion
過去数十年にわたり、SAの回復手順の3つのバリエーションは、実験用ラットとサルで薬物探索の復職を研究するために開発されている。手続き型のバリエーションを定義する違いは主に薬剤SA、絶滅、とのテストセッションは1と同じ日の内で、または別の日に発生するかどうかに関連している。薬剤SAが毎日絶滅し、テストセッションとは別のセッション（すなわち、間にセッションの方法で）が、絶滅の間に発生するため、我々はこのホワイトペーパーで説明した手順は、一般的に、セッションのバリエーション"内の間"と呼ばれていますとテストは同じ日に（すなわち、内、セッションの方法で）[例えば、7、9]で発生。また、"セッション間"いわゆる手順で、実験のすべてのフェーズでは、逐次的に発生SA、絶滅、およびテストのセッションが（すなわち、すべてのフェーズは、セッションの間にある）別の日に付与されていることなど[例えば、8、10、 11]。対照的に、"セッション内で"完全な手順で、SAのトレーニング、絶滅、そしてテストセッションは、すべて同じ日に[例えば、12]を生じる。
回復手順の異なるバリエーションを使用して薬物探索のフットショック誘発性回復の報告が公開されているが、我々は、絶滅とテストが同じで発生するときにthisストレッサーが（少なくともコカインSAの歴史を持つ動物で）最も効果的であることが判明している日（すなわち、"内 - の間で"セッションの方法で）。また、我々は、"セッション間"完全を使用してプロシージャを求めてコカインの信頼性の高いフットショック誘発性復職を得ると成功があったが、いるだけの動物が絶滅し、テスト中に、実験8、または少なくとも全体のSAチャンバ内に収容された条件の下で13。この間、セッションアプローチ、現在のプロトコルで説明されている以上の欠点は、それが訓練され、一度にテストすることができる科目の数を制限し、それによって、データ収集の効率を低下させることです。現在のプロトコルの条件下での動物の一グループが消滅することができ、所定の時間にテストされていますが、より大きなスループットが一週間のラットの二つのグループのためのSAのトレーニング段階の開始時間をずらすことによって達成することができます。番目のグループは、SAのトレーニング第2週に入るとこのシナリオでは、ラットの最初のグループは、薬物のない位相を入力することができます、と、番目のグループは、その薬剤にある間、その後、絶滅してテストが最初のグループで行うことができる無相。このアプローチは、リソースをより効率的に使用を許可しており、非常に効果的で信頼性の高いフットショック誘発性回復につながる一方、データ取得の速度を加速させます。
重要なことは、私たちの手順で、回復のための以前に薬物強化行動とテストの消滅は、薬物関連のキューの存在下で発生します。我々は薬物関連の手がかりのない状態で絶滅のトレーニングやテストを実施したことはないんですけど、それは（テストが消滅の手がかりのない状態で発生すると、ストレッサーが実際に復職を誘導するのにしない場合がありますので、個人的なコミュニケーションに基づいて、我々の理解です。少なくともコカインSAの歴史を持つ動物の場合）。この変数の体系的調査、およびそれがポーズを理論的な含意は、将来の研究にとって重要な問題です。
ワラントのコメントは復帰でフットショックストレスの影響は、コンテキストの操作に非常に敏感であるように見えることであることを最終的な手続き上の要因。例えば、フットショックストレスは、それが薬剤SAと絶滅が発生する環境で投与されている場合、薬物探索の回復を誘導することでのみ有効です。つまり、フットショックは小説コンテキストでストレスへの曝露が発生した場合に薬物探索を回復していない、復職14日に、その効果でストレスや薬剤の環境との間の重要な相互作用を示唆している。
結論では、フットショックの回復手順は、このホワイトペーパーに記載されているような、ストレスや薬物の再発との関係を支配する基本的な行動と神経生物学的メカニズムを解明するためにかなりの成功とともに使用されています。実際、これらの手順は、特定の神経基質を標的とする薬理学的前処理や神経化学的操作に対応するために変更した際に、ストレスによる薬物探索に回復の神経生物学を特徴付けるための強力なツールとして使用できます。
Disclosures
動物実験は動物のケアと大学トロントの動物ケア委員会のカナダ人評議会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。このビデオの制作は、この記事で使用する楽器を生成メッドアソシエーツ社が主催した。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package |  Med Associates, Inc. |
MED-008-CT-B1 | ||
| Deep extra tall MDF sound attenuating cubicle | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
ENV-018MD | |
| Standard modular test chamber with drug infusion top and waste pan | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
ENV-008CT | |
| Stainless steel grid floor | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
ENV-005 | |
| House light, hooded, 28V | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
ENV-215M | |
| Stimulus light 1” white lens | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
ENV-221M | |
| Low profile retractable response lever | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
ENV-112CM | |
| SmartCtrl 8 Input/16 output package | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
DIG-716P2 | |
| Single speed syringe pump, 3.33 RPM | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
PHM-100 | |
| Rat self infusion package | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
PHM-119B-23-D | |
| Drug Delivery, Arm assembly | Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component | Med Associates, Inc. |
PHM-110-SAI | |
| Square wave aversive stimulator | Footshock Stress Component | Med Associates, Inc. |
ENV-414S | |
| Patented quick disconnect harness for stainless steel grid floor | Footshock Stress Component | Med Associates, Inc. |
ENV-005-QD | |
| Shock output cable | Footshock Stress Component | Med Associates, Inc. |
SG-219G-10 | |
| MED-PC IV Software | Software | Med Associates, Inc. |
SOF-735 |
References
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