Summary
Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in Ausdruck
Abstract
Das Protokoll hier vorgestellten soll die Aktivierung der großen Leitfähigkeit, Spannungs-und Ca 2 +-aktivierten K + (BK) Kanäle zu studieren. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um die Struktur-Funktions-Beziehung für andere Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren-1-Studie sein. BK-Kanäle sind weit verbreitet in verschiedenen Geweben exprimiert und haben in vielen physiologischen Funktionen, einschließlich der Regulierung der Kontraktion der glatten Muskulatur, Frequenzabstimmung von inneren Haarzellen und Regulierung der Freisetzung von Neurotransmittern 2-6 in Verbindung gebracht. BK-Kanäle werden durch Membran-Depolarisation und durch intrazelluläre Ca 2 + und Mg 2 + 6-9 aktiviert. Daher ist das Protokoll, mit dem sowohl die Membran-Spannung und die intrazelluläre Lösung zu kontrollieren. In diesem Protokoll wird Boten-RNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) von 2-5 Tagen Inkubation bei 18 ° C 10-13 gefolgt injiziert. Membrane Patches, die einzelne oder mehrere BK-Kanäle enthalten, werden mit der inside-out-Konfiguration mit Patch-Clamp-Techniken 10-13 herausgeschnitten. Die intrazellulären Seite der Patch mit der gewünschten Lösungen während der Aufnahme, so dass die Kanal-Aktivierung unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden kann perfundiert. Zusammenfassend ist die mRNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten injiziert, um Kanal-Proteine an der Eizelle Membran auszudrücken; Patch-Clamp-Techniken werden benutzt, um Ströme durch die Kanäle unter kontrollierten Spannung und intrazelluläre Lösungen aufnehmen.
Protocol
1. Die Injektion von mRNA in Oozyten
- Inject von 0,05 bis 50 ng Boten-RNA, die in vitro in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) mit Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (Drummond Scientific Company, Modell 3-000-204) transkribiert wurde. Wiederholen Sie die Injektion auf ein Dutzend Eizellen für jede mRNA.
- Spülen Sie den injizierten Oozyten zweimal mit ND-96-Lösung (96 mM Natriumchlorid (NaCl, Herr 58,44 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, Herr 74,56 g / mol), 1,8 mM Calciumchlorid (CaCl 2 • 2H 2 O Herr 147,02), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6H 2 O, Herr 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, Herr 238,31 g / mol), 2,5 mM Natriumpyruvat (Herr 110,04 g / mol) und 1x Penicillin-Streptomycin. pH 7,6), dann legen Sie sie in einer Kultur Platte und inkubieren bei 18 ° C für 2 + Tage.
2. Vorbereitung der Perfusion System
Illustration der Automatisierung ValveLink 16 Perfusion System. Die Perfusion System nutzt unter Druck Stickstoff zu Perfusionslösungen Push-out der Lösung Stauseen, durch die Infusionsschläuche, und die Durchblutung Bleistift und Trinkgeld. Der Durchfluss der einzelnen Streams von Perfusionslösung wird von einem Reservoir-Ventil und eine elektronische Ventil gesteuert. In diesem Protokoll ist eines der Reservoirs nicht unter Druck und fungiert als Abfallsammler sowie eine Druck-Auslösemechanismus. (Bild aus Hersteller-Website http://www.autom8.com angepasst)
- Verbinden Sie die Schläuche auf die Perfusion Bleistift. Schalten Sie das elektronische Ventilsteuerung und öffnen Sie die Elektronenröhren.
- Um sicherzustellen, dass die Schläuche und die Durchblutung Bleistift frei von Verstopfung und Luftblasen sind, drücken Sie deionisiertem Wasser (DI) durch jeden Schlauch mit einer Spritze mit deionisiertem Wasser gefüllt.
- Verbinden Sie die Schläuche auf die Lösung Stauseen und öffnen Sie das Ventil der Gasflasche unter Druck stehendem Stickstoff anzuwenden.
- Öffnen Sie das Reservoir-Ventil, um den Schlauch mit Reservoir-Lösung füllen. Flick das Reservoir-Ventil, um Luftblasen in der Lösung zu entfernen, wenn nötig. Schließen Sie das Ventil nach der Schlauch mit der Lösung gefüllt ist.
- Füllen Sie die Perfusion Spitze mit Wasser und schrauben Sie ihn auf die Perfusion Bleistift. Achten Sie darauf, keine Blasen-Falle beim Anschließen der Spitze.
- Fix die Perfusion mit Bleistift auf das Bad Stufe mit Knetmasse. Vergewissern Sie sich, die Durchblutung Spitze ist in der Badewanne Platz. Die Perfusion ist jetzt eingerichtet.
- Add DI-Wasser in der Badewanne. Vergewissern Sie sich, die Durchblutung Spitze in das Wasser eingetaucht ist.
- Testen Sie, dass jeder Perfusionslösung kommt aus dem Perfusion Tipp richtig. Schließen Sie das elektronische Ventil verbunden, um den Schlauch der Abfallsammler und öffnen das Ventil für eine Perfusionslösung zu einer Zeit (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraessigsäure (EGTA, M r 380,35 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 eingestellt + oder Mg2 + ist es, gewünschten Konzentration zugegeben, wenn nötig). Unter dem Mikroskop beobachten, der Strahl der Perfusion Flüssigkeit aus der Perfusion Spitze. Schließen Sie das Ventil für die Perfusionslösung und öffnen das Ventil für die Abfallsammler. Die Perfusion Jet sollte fast verschwinden. Wiederholen Sie den gleichen Test für alle Perfusionslösungen.
- Wenn Sie, dass alle Perfusionslösungen flow korrekt überprüft, ersetzen DI-Wasser in der Wanne mit Bad-Lösung (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol)) eingestellt.
3. Patch-Clamp-
- Recoat der Ag Aufnahme-Elektrode mit AgCl vor jedem Patch-Clamp-Sitzung. Entfernen Sie zunächst die Drahtelektrode aus dem Pipettenhalter und tauchen die Spitze der Hälfte der Drahtelektrode in einem Fläschchen mit frischem Bleichmittel für mindestens 15 Minuten. Diese Ablagerungen einer Schicht von AgCl auf den Draht.
- Spülen Sie die Elektrode Draht mit deionisiertem Wasser und trocken tupfen. Installieren Sie dann die Ag / AgCl-Elektrode wieder in den Pipettenhalter.
- Schließen Sie das Bad (Bezugs-) Elektrode zur headstage und legen Sie sie in das Bad. Dieser bereitet die Elektroden für die Aufzeichnung.
- Jetzt für die Datenerfassung vorzubereiten. Schalten Sie den Computer und stecken Sie den Dongle in den Drucker-Port Ihres Computers. Die Hardware-Schlüssel muss gesteckt werden, damit Sie die Software zur Datenerfassung, die HEKA Impuls zu nutzen.
- Schalten Sie den Verstärker (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) und starten HEKA Pulse. Laden Sie die Protokoll-Datei und stellen Sie die Konfigurationseinstellungen, wie die Stimulus-Skala. Das Ziel für die Anpassung der Konfigurationseinstellungen ist, um sicherzustellen, dass der Test Potenzial genau gleich der Befehl Potenzial ist. Dies bereitet den Datenerfassungsgeräten.
- Bereiten Eizellen. Tauchen Sie die Eizelle in Stripping-Lösung (200 mM N-Methyl-D-glucamin (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartat (keine K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6 H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), ist pH auf 7,4 mit Natriumhydroxid eingestellt (NaOH, M r 40,0 g / mol) für 5 - 10 min. Das Strippen Lösung löst die Dotterhaut von der Plasmamembran, die es ermöglicht, die Dotterhaut Streifen macht.
- Gently Streifen die Dotterhaut von der Eizelle mit zwei Pinzetten. Ein devitellinized Eizelle ist äußerst fragil und sollte daher verschoben werden so wenig wie nötig.
- Die Pflege zu verhindern, daß die devitellinized Eizelle in die Luft oder Blasen, verwenden Sie eine Glaspipette mit genügend Lösung der Eizelle in das Bad übertragen gefüllt. Dieser bereitet die Eizelle für die Aufnahme.
- Bereiten Sie Patch-Pipetten. Ziehen Sie die Glaspipetten nach dem Einlegen einer Glaskapillare (VWR International, Cat # 53432-921) in eine Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipette Puller. Beachten Sie die Pipetten unter dem Mikroskop an der Spitze Form und Öffnung Durchmesser zu bestimmen. Der Öffnungsdurchmesser sollte 2-4 Mikrometer betragen.
- Um kapazitive Strom während der Aufnahme zu reduzieren und eine glatte Spitze, Fell der Spitze mit Wachs zu gewährleisten und dann Feuer-polieren.
- Füllen Sie die Pipettenspitze, indem Sie die Spitze der Pipette in die Pipette Lösung (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure eingestellt Säure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol)) und Zeichnung der Kolben. Diese benetzt die Spitze.
- Füllen Pipette 1 / 3 voll mit Pipette Lösung mit einer Spritze und setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter mit der Ag / AgCl-Elektrode im Inneren und Kontaktaufnahme mit der Pipette Lösung. Dies bereitet der Patch-Pipette.
- Verbrauchsteuerpflichtige Inside-out-Patch von der Eizelle vorbereitet, finden die klare Kante Eizelle unter dem Mikroskop. Bewegen Sie den Patch-Pipette in der Nähe der Eizelle mit Manipulator. Notieren Sie die Seriennummer Widerstand der Pipette. Die ideale Serie Widerstand der Patch-Pipette wird zwischen 1-1,5 MOhm, wenn sie mit Pipette gefüllt und unter Wasser in Bad-Lösung.
- Langsam schieben Sie die Pipette gegen die Eizelle, bis der Widerstand etwa verdoppelt.
- Bewerben sanfte Saugwirkung auf die Membran durch den Mund durch ein Saugrohr, die den Pipettenhalter verbunden ist, bis ein Giga-Ohm-Siegel erhalten. Stabilisieren Sie den Patch, indem Sie am Spannung -30 mV für ein paar Minuten.
- Um eine inside-out-Patch-, Verbrauchsteuer den Patch schnell drücken Sie die Pipette weiter in die Eizelle und dann vorsichtig herausziehen.
- Die inside-out-Patch ist nun bereit zum Spannen. Bewegen Sie die Pipette hält die inside-out patch bis etwa 100 Mikrometer weg von der Öffnung der Perfusion Spitze.
- Schließen Sie das elektronische Ventil für Abfälle sammeln und öffnen Sie das Reservoir-Ventil für die gewünschte Perfusionslösung
- Starten Sie die Aufnahme Ströme über das Pflaster. Ändern Sie den Spannungs-und Perfusionslösungen wie gewünscht.
- Wenn Sie die Aufnahme beendet ist, reinigen Sie die Infusionsschläuche, Bleistift und Spitze, indem Sie durch entionisiertes Wasser verstopft zu vermeiden.
4. Repräsentative Ergebnisse
Bei der Herstellung von Eizellen für die Patch-Clamp, würde die 5-10 min Behandlung von Abbeizlösung die Dotterhaut von der Plasmamembran, die es ermöglicht Abziehen der Dotterhaut zu lösen.
Die ideale Serie Widerstand der Patch-Pipette wird zwischen 1-1,5 MOhm, wenn sie mit Pipette gefüllt und unter Wasser in Bad-Lösung.
Nachfolgend finden Sie eine repräsentative Aufnahme von Wildtyp-BK-Kanäle auf eine Eizelle Membran-Patch. Auf der linken Seite oben, zeigen die quadratische Wellen der Spannung an den patch - der zweite Schritt mit steigender Spannung von 50 mV bis 200 mV mit Schrittweite von 50 mV. Nachfolgend finden Sie die entsprechenden aktuellen Spuren, wenn die Perfusionslösung nominal 0 Ca 2 + (frei [Ca 2 +] liegt bei etwa 0,5 nm). Die inAnstieg der Stromamplitude bedeutet, dass die offene Wahrscheinlichkeit BK-Kanäle mit steigender Spannung. Auf der rechten Seite ist der gleiche Patch mit 1,0 uM Ca 2 + perfundiert, wenn sie mit der gleichen Spannung Protokoll angewendet. Die Stromamplitude erhöht mehr unter der gleichen Spannung, was darauf hinweist, dass die offene Wahrscheinlichkeit, mit [Ca 2 +] erhöht. 
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Discussion
Die Eizelle Ausdruck System ist ideal für elektrophysiologische Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen aufgrund der relativ niedrigen Hintergrund der endogenen Kanäle. Darüber hinaus, da es sich um eine vorübergehende Expression System ist, bietet es eine effiziente Methode zur Durchführung Mutagenesestudie dieser Kanäle. Es ist jedoch zu beachten, dass die Eizelle Expressionssystem anders als in Säugerzellen ist, so kann es Unterschiede in post-translationale Modifikation und Verknüpfung mit verschiedenen Untereinheiten werden. Darüber hinaus kann die Lipid-Konzentration zwischen den beiden Zellen, die den Kanal der funktionalen Eigenschaften beeinflussen können abweichen.
Die Infusionsschläuche, Bleistift und Spitze sollte mit DI-Wasser gereinigt werden jedes Mal nach dem Experiment zu verstopfen vermeiden. Immer frische Bleiche, die Ag-Elektrode Draht zu behandeln, um sicherzustellen, dass es mit AgCl beschichtet ist, sonst die Aufnahme ungenau sein. Stellen Sie die Konfigurationseinstellungen für die Datenerfassung, so dass der Test Potenzial genau gleich der Befehl Potenzial ist. Es wäre hilfreich, damit der Patch-Pipetten sauber, so dass mit einem Deckel, um sie vor Schmutz und Feuer-polieren sie nur vor dem Gebrauch zu schützen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt R01-HL70393 und R01-NS060706 zu JCJC unterstützt ist Professor für Biomedizinische Technik an der Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
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