膜片钳和灌注技术研究离子通道的表达爪蟾卵母细胞
Summary
BK通道的离子电流是利用膜片钳技术记录。 BK通道均以<em>爪蟾卵母细胞</em注射信使RNA。在膜片钳记录细胞内的解决方案是由灌注系统控制。
Abstract
这里介绍的协议，旨在研究激活大电导，电压和通道的Ca 2 +激活的K +（BK）。该协议也可以用于研究等离子通道和神经递质受体1的结构与功能的关系。 BK通道广泛表达在不同组织中，并已在许多生理功能，包括调节平滑肌收缩，内毛细胞的频率调整和调节神经递质的释放 2-6牵连。 BK通道被激活细胞膜去极化和细胞内Ca 2 +，Mg 2 +的6-9。因此，该协议的目的是控制膜电压和细胞内的解决方案。在这个协议中，BK通道的信使RNA是注入爪蟾卵母细胞由2-5天的潜伏期，在18 ° C 10-13（第五和第六阶段）。膜补丁包含单个或多个BK渠道切除与内配置使用膜片钳技术10-13。灌注所需的解决方案，以便在录制过程中，可以研究不同条件下的通道激活细胞内的补丁。总结，BK通道的mRNA 注入非洲爪蟾卵母细胞表达的卵母细胞质膜上的通道蛋白;膜片钳技术是用来记录电流流经控制电压和细胞内的解决方案下的渠道。
Protocol
1。注射到卵母细胞的mRNA 注入0.05 – 50吴爪蟾卵母细胞，使用Nanoject II自动纳升进样器（德拉蒙德科学公司，模型3-000-204）（第五和第六阶段 ），在体外转录成信使RNA。重复上的每一个基因12个卵母细胞的注射。 冲洗两次使用注入卵母细胞ND – 96解决方案（96毫米氯化钠（NaCl，议员58.44克/摩尔），2毫米氯化钾（KCl，议员，74.56克/摩尔），1.8毫米氯化钙（ 氯化钙 2?…
Discussion
卵母细胞表达系统是由于相对较低的内源性途径背景电压依赖性离子通道的电生理特性的理想选择。此外，因为它是一个瞬时表达系统，它提供了一个有效的方法执行这些渠道的诱变研究。然而，应该指出的是，卵母细胞表达系统在哺乳动物细胞中是不同的，从而有可能在翻译后修饰和与不同的亚基协会的差异。此外，血脂浓度可能会有所不同，两者之间的细胞这可能会影响通道的功能特性。 </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由国家卫生赠款R01 – HL70393和R01 – NS060706到JCJC研究院支持，斯宾塞吨奥林基金会是一个生物医学工程教授。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
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Tags
Patch ClampPerfusion TechniquesIon ChannelsXenopus OocytesBK ChannelsActivationStructure-function RelationshipNeurotransmitter ReceptorsSmooth Muscle ContractionHair Cell Frequency TuningNeurotransmitter ReleaseMembrane DepolarizationIntracellular Ca2+ And Mg2+Messenger RNA InjectionIncubationInside-out ConfigurationSingle Or Multiple ChannelsRecording CurrentsControlled Voltage
Cite This Article
Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269, doi:10.3791/2269 (2011).