Summary
Jonströmmen av BK-kanaler spelas in med den teknik patch clamp. BK kanaler uttrycks i
Abstract
Protokollet som presenteras här är utformade för att studera aktivering av stora konduktans, spänning-och Ca 2 +-aktiverade K + (BK) kanaler. Protokollet kan också användas för att studera struktur och funktion relation till andra jonkanaler och receptorer signalsubstans 1. BK-kanaler är allmänt uttrycks i olika vävnader och har varit inblandade i många fysiologiska funktioner, inklusive reglering av glatt muskulatur kontraktion, frekvensinställning av inre hårceller och reglering av frisättningen av neurotransmittorer 2-6. BK-kanaler aktiveras av membran depolarisation och intracellulära Ca 2 + och Mg 2 + 6-9. Därför är det protokoll som utformats för att styra både membranet spänningen och den intracellulära lösningen. I detta protokoll, budbärar-RNA av BK-kanaler injiceras i Xenopus laevis oocyter (fas V-VI) följt av 2-5 dagars inkubation vid 18 ° C 10-13. Membran fläckar som innehåller ett eller flera BK kanaler exciderad med insidan ut konfigurering med hjälp av tekniker patch clamp 10-13. Den intracellulära sidan av plåstret är perfusion med önskade lösningar under inspelningen så att kanalen aktiveringen under olika förhållanden kan undersökas. Sammanfattningsvis är mRNA av BK-kanaler injiceras i Xenopus laevis oocyter att uttrycka kanal proteiner på äggcellen membranet, patch clamp teknik används för att spela in strömmar som flyter genom kanaler under kontrollerade spänning och intracellulära lösningar.
Protocol
1. Injektion av mRNA i oocyter
- Injicera 0,05 till 50 ng budbärar-RNA som transkriberas in vitro i Xenopus laevis oocyter (stadium V-VI) med hjälp av Nanoject II Auto-metod i nanoliter Injector (Drummond Scientific Company, modell 3-000-204). Upprepa injektionen på ett dussin ägg för varje mRNA.
- Skölj den injicerade ägg två gånger med ND-96-lösning (96 mM natriumklorid (NaCl, herr 58,44 g / mol), 2 mm kaliumklorid KCl (Herr 74,56 g / mol), 1,8 mm kalciumklorid (CaCl 2 • 2H 2 O Herr 147,02), 1 mM magnesiumklorid (MgCl 2 • 6H 2 O, herr 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES Herr 238,31 g / mol), 2,5 mm natrium pyruvat (Herr 110,04 g / mol), och 1x Penicillin-streptomycin. pH 7,6), sedan placera dem i en kultur plattan och inkubera vid 18 ° C under 2 + dagar.
2. Förbereda Perfusion System
Illustration av Automatisera ValveLink 16 perfusion system. Det perfusion Systemet använder trycksatt kvävgas för att driva perfusion lösningar ut ur lösningen reservoarer genom perfusion slangar och till perfusion penna och dricks. Flödet av varje ström av perfusionen lösning styrs av en reservoar ventil och en elektronisk ventil. I detta protokoll är en av de reservoarer inte trycksatta och fungerar som en insamlare samt en press-release mekanism. (Bild anpassat från säljarens webbsida http://www.autom8.com)
- Anslut slangar till perfusion penna. Slå på elektronisk ventil regulator och öppna elektronrör.
- Att säkerställa att slangar och perfusionen penna är fria från täppa och luftbubblor, tryck avjoniserat (DI) vatten genom varje slang med en spruta fylld med avjoniserat vatten.
- Anslut slangar till lösningen reservoarer och öppna ventilen på gasflaskan att tillämpa trycksatt kvävgas.
- Öppna behållaren ventilen för att fylla röret med reservoar lösning. Flick reservoaren ventilen för att ta bort bubblor i lösningen om det behövs. Stäng ventilen när slangen fylls med lösning.
- Fyll perfusionen spets med vatten och skruva den på perfusion penna. Var noga med att inte fälla några bubblor när du ansluter spetsen.
- Fäst perfusionen penna till badet scenen med hjälp av modellera. Se till att perfusionen spets är i badet rymden. Det perfusionen Systemet är nu inrättas.
- Tillsätt DI-vatten i badkaret. Se till att perfusionen tips är nedsänkt i vattnet.
- Testa att varje perfusion lösning kommer ut från perfusion spetsen korrekt. Stäng elektronisk ventil är ansluten till rör av insamlare och öppna ventilen för en perfusion lösning i taget (140 mM kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-hydroxietyl) -1 - piperazineethanesulfonic syra (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mm kaliumklorid (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mm Etylenglykol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacetic syra (EGTA, M r 380,35 g / mol) är pH justeras till 7,1-7,2 med methanesulfonic syra (MESO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + eller Mg2 + läggs till önskad koncentration när det behövs). Under mikroskop, iaktta strålen av perfusionen vätska som kommer ut ur perfusion spetsen. Stäng ventilen för perfusion lösning och öppna ventilen för insamlare. Den perfusion jet borde nästan försvinna. Upprepa samma test för alla perfusion lösningar.
- När du har kontrollerat att alla perfusionen lösningar flödet korrekt, byta DI-vatten i badkaret med bad-lösning (140 mM kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mm kaliumklorid (KCl, M r 74,56 g / mol) är pH justeras till 7,1-7,2 med methanesulfonic syra (MESO 3, M r 96,1 g / mol)).
3. Patch Fastspänning
- Övermålningsbar Ag inspelning elektrod med AgCl före varje patch fastspänning session. Först, ta bort elektroden kabeln från pipetten hållaren och dränka spetsen hälften av elektroden tråd i en injektionsflaska som innehåller färska blekmedel i minst 15 minuter. Detta insättningar ett lager av AgCl på tråd.
- Skölj elektroden tråd med avjoniserat vatten och torka med läskpapper. Installera sedan Ag / AgCl-elektrod tillbaka i pipetten hållaren.
- Anslut badet (referens) elektrod till headstage och placera den i badet. Detta förbereder elektroderna för inspelning.
- Nu förbereda för datainsamling. Starta datorn och sätt i hårdvaran nyckeln i skrivarporten på datorn. Hårdvaran nyckeln måste vara ansluten för att du ska använda datainsamling programvaran, som är Heka puls.
- Slå på förstärkaren (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) och starta Heka Pulse. Ladda protokollet filen och justera inställningar, till exempel Stimulus Scale. Målet för justering av inställningar är att säkerställa att testet potentialen är exakt lika med kommandot potential. Detta förbereder utrustningen datainsamling.
- Förbered oocyter. Sänk ner ägget i strippning lösning (200 mM N-metyl-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mm aspartat (ingen K +) (M R 133,1 g / mol), 2 mm kaliumklorid (KCl M r 74,56 g / mol), 10 mm Etylenglykol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacetic syra (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM magnesiumklorid (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mm 4 -, (2-hydroxietyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES, M r 238,31 g / mol) är pH justeras till 7,4 med natriumhydroxid (NaOH, M R 40,0 g / mol) för 5 -. 10 min strippa lösningen lösgör vitelline membranet från plasmamembranet som gör det möjligt att skala av vitelline membranet.
- Försiktigt skala vitelline membranet från äggcellen med hjälp av två par pincett. En devitellinized äggcell är extremt ömtåliga och bör därför flyttas så lite som behövs.
- Samtidigt som man undviker att utsätta devitellinized äggcellen till luft eller bubblor, använd en glaspipett fylld med tillräckligt med lösning för att överföra äggcellen till badet. Detta förbereder ägget för inspelning.
- Förbered patch pipetter. Dra glaspipetter när du har infogat ett glas kapillärrör (VWR International, Cat # 53.432-921) till en Sutter P-97 Flaming / Brown Mikropipett avdragare. Observera pipetter under mikroskop för att avgöra spetsen formen och öppna diameter. Öppningen diameter bör vara 2-4 mikrometer.
- För att minska kapacitiv ström under inspelningen och att säkerställa en smidig spets, päls spetsen med vax och sedan eld-polera den.
- Fyll pipettspetsen genom att placera toppen av pipetten inuti pipetten lösning (140 mM kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mm kaliumklorid KCl (M r 74,56 g / mol), 2 mM magnesiumklorid (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol) är pH justeras till 7,1-7,2 med methanesulfonic syra (MESO 3, M r 96,1 g / mol)) och dra ut kolven. Detta kissar spetsen.
- Fyll pipetten 1 / 3 full med pipett hjälp av en spruta och placera pipetten pipetten hållaren med Ag / AgCl-elektrod inuti och kontakt med pipetten lösningen. Detta förbereder plåstret pipetten.
- Punktskattepliktiga en inside-out patch från den färdiga äggcellen, hitta tydliga kanten av äggcellen under mikroskop. Flytta plåstret pipetten nära den äggcellen med hjälp av roboten. Anteckna serienumret motstånd pipett. Den idealiska serien motstånd av plåstret pipetten är mellan 1-1,5 Mohm när den är fylld med pipett lösning och nedsänkta i bad lösning.
- Tryck långsamt pipetten mot äggcellen tills motståndet ungefär fördubblas.
- Försiktigt sug att membranet via munnen genom ett sugrör som är ansluten till pipetten innehavaren förrän en Giga-ohm tätning erhålls. Stabilisera plåstret genom att hålla den på spänning -30 mV i ett par minuter.
- För att få en inside-out plåster, punktskatter korrigeringsfilen genom att snabbt trycka på pipetten längre in i äggcellen och sedan försiktigt dra ut den.
- Insidan ut plåster är nu redo för fastspänning. Flytta pipetten hålla ut och in patch till cirka 100 mikrometer bort från öppnandet av perfusion spetsen.
- Stäng elektronisk ventil för både uppsamling och öppna behållaren ventil för önskad perfusion lösningen
- Börja spela in strömmar över plåstret. Ändra spänning och perfusionen lösningar som önskat.
- När du är klar med inspelningen, rengör perfusion slangar, penna och dricks genom att driva igenom avjoniserat vatten för att undvika träskor.
4. Representativa resultat
Under utarbetandet av oocyter för patch clamp, skulle 5-10 min behandling av stripping lösning loss vitelline membranet från plasmamembranet, vilket gör det möjligt att strippa vitelline membranet.
Den idealiska serien motstånd av plåstret pipetten är mellan 1-1,5 Mohm när den är fylld med pipett lösning och nedsänkta i bad lösning.
Nedan följer ett representativt inspelning av vildtyp BK kanaler på en äggcell membran patch. Uppe till vänster, torget vågorna indikerar spänning appliceras på plåstret - det andra steget av spänning ökar från 50 mV till 200 mV med steg om 50 mV. Nedan är motsvarande nuvarande spår när perfusionen lösningen har nominella 0 Ca 2 + (gratis [Ca 2 +] är ca 0,5 nM). Den iökning med strömamplituden visar att den öppna sannolikheten för BK-kanaler ökar med spänning. På höger sida är samma plåster perfusion med 1,0 mikroM Ca 2 + när den tillämpas med samma spänning protokoll. Den nuvarande amplituden ökar mer under samma spänning, vilket visar att den öppna sannolikheten ökar med [Ca 2 +]. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Äggcellen Uttrycket Systemet är idealiskt för elektrofysiologiska karakterisering av spänningsberoende jonkanaler De relativt låga bakgrund av endogent kanaler. Eftersom det är ett övergående uttryck system, ger det en effektiv metod för att utföra mutagenes studie av dessa kanaler. Det bör dock noteras att äggcellen uttrycket systemet är annorlunda än i däggdjursceller, så det kan finnas skillnader i post-translationell modifiering och samverkan med olika subenheter. Dessutom kan lipid koncentration skiljer sig mellan de två celler som kan påverka kanalens funktionella egenskaper.
Den perfusion slangar, penna och dricks ska rengöras med DI-vatten efter varje försök att undvika att täppa igen. Använd alltid färska blekmedel för att behandla Ag elektroden ledningen se till att den är belagd med AgCl, annars inspelningen att bli felaktig. Justera konfigurationsinställningar för datainsamling så att testet potentialen är exakt lika med kommandot potential. Det vore bra för att hålla plåstret pipetterna rent så använd ett lock för att skydda dem från smuts och brand-polska dem bara före användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01-HL70393 och R01-NS060706 till JCJC är professor i medicinsk teknik på Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
