Summary
Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.
Abstract
Een van de belangrijkste doelstellingen in de neurowetenschappen is het begrijpen van de moleculaire signalen dat de vroege stadia van synapsvorming instrueren. Als zodanig is noodzakelijk geworden om objectieve benaderingen te ontwikkelen voor veranderingen in de synaptische verbindingen te kwantificeren. Vanaf monster fixatie, dit protocol beschreven hoe u synaps aantal kwantificeren, zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers. Het aantal van deze colocalizations wordt gekwantificeerd met behulp van een plug in Puncta Analyzer (geschreven door Bary Wark, beschikbaar op aanvraag, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) onder de ImageJ analyse software platform. De synaps assay beschreven in dit protocol kan worden toegepast op alle neurale weefsel of de bereiding waarvoor u selectief pre-en postsynaptische markers. Dit synaps test is een waardevol instrument dat op grote schaal kan worden gebruikt in de studie van synaptische ontwikkeling.
Protocol
Oplossingen voor te bereiden:
- Antilichaam Buffer:
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat No:. BP152-5, 50 mm) - 1,21 g
- 1% BSA (Sigma, Cat No:. A2153, 1%) - 2,0 g
- 100 mM L-lysine (Sigma, Cat No:. L-1137, 100 mm) - 3,65 g
- Pas de pH tot 7,4
- 0,04% Azide
- Stel het volume tot 200 ml met gedestilleerd H 2 O.
- Filtreer door 0.22μm filter (Millipore, Cat No:. SCGPU02RE).
- PFA verdunningsmiddel:
- 168 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 (tweebasisch)
- 72 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 (monobasisch)
- 660 ml gedestilleerd H 2 O
- 4% PFA fixeermiddel voor gekweekte neuronen (oplossing # 2):
- 10 ml 16% PFA-oplossing (Electron Microscopy Sciences, Cat No:. 15711)
- 30 ml 4% PFA verdunningsmiddel (oplossing # 2)
- 4% PFA in PBS:
- 4 g PFA (Electron Microscropy Sciences, Cat No:. 19210)
- 100 ml PBS (Invitrogen, Cat No:. 20012-027)
- Verwarm tot 40 ° C, 's nachts roeren.
- Filtreer door een 0.22μm filter (Millipore, Cat No:. SCGPU02RE)
- Blokkerende buffer (Totaal volume (voor 24-putjes plaat) = (# dekglaasjes +1) x 200μl)
- 50% antilichaam buffer (oplossing # 1)
- 50% Normale geit serum (Gibco, Cat No:. 16210)
- 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, Cat No:. 9002-93-1)
- 30% Sucrose in PBS
- 30 g sucrose (MP Biomedicals, Inc, Cat No:. 821713)
- 70 ml PBS (Invitrogen, Cat No:. 20012-027)
- Meng met een stirbar tot sucrose is in oplossing.
- Breng het volume tot 100 ml met PBS
- Filtreer door een 0,22 um filter (Millipore, Cat No:. SCGPU02RE)
De voorbereiding van neuronale culturen:
Het protocol hier beschreven is van toepassing op alle primaire neuronale culturen gekweekt op 12 mm glas dekglaasjes (Karl Hecht, nr. O, Cat No:. 99.010) in 24-well platen (Falcon, 35-3047). Bijvoorbeeld, in ons laboratorium hebben we cultuur rat retinale ganglioncellen (RGC) gezuiverd van rat netvlies geoogst P5-7 dieren 1,2. Cellen worden gekweekt op glas coverslips bekleed met poly-D-lysine (Sigma, Cat No:. P6407) (. Cultrex, Cat No: 3400-010-01) en de muis laminine. Wij gebruiken deze cultuur voorbereiding in een paar verschillende manieren voor onze synaps test. Een manipulatie die wij uitvoeren gaat kweken RGC hetzij in de aanwezigheid of afwezigheid van de astrocyten afgescheiden synaptogenic factoren. Als alternatief hebben we ook gebruik van deze verschillende behandeling voorwaarden in experimenten waarbij RGC zijn getransfecteerd met een eiwit van interesse overexpressie. In het laatste geval hebben we co-transfecteren de cellen met een cel label (bijvoorbeeld GFP of tdTomato). Deze verschillende experimentele benaderingen invloed hebben op hoe een bepaalde stappen van een synaps test, die we hieronder verduidelijken uitvoert.
1. Bevestiging los Gezuiverd RGC
- Verwijder de cultuur media uit de RGC-bevattende putten en voeg 500 ul (voor een 24 wells plaat) 4% paraformaldehyde (PFA) voorverwarmd tot 37 ° C aan elk putje. Laat cellen om vast 7 minuten bij kamertemperatuur.
- Na fixatie spoelen cellen drie keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (Invitrogen, Cat No:. 20012-027). BELANGRIJK: Cellen mag nooit worden overgelaten zonder vloeistof in de putten, zodra een buffer wordt verwijderd uit een goed het moet onmiddellijk worden vervangen door de volgende buffer. Op dit punt, cellen zijn klaar voor immunokleuring.
2. Het blokkeren van aspecifieke bindingsplaatsen op het RGC
- Bereid het blokkeren van buffer die 50% normaal geit serum (NGS, Gibco, Cat No:. 16.210) en 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, Cat No:. 9002-93-1). Na het verwijderen van PBS uit elk putje, voeg 200 ul van de blokkerende buffer aan elk putje en blok voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de blokkering buffer en spoel 3 keer met PBS.
3. Het toepassen van primaire antistof Solution
- BELANGRIJK: Zorg ervoor dat de primaire antilichamen kiezen voor uw pre-en postsynaptische markers die zijn verkregen uit verschillende soorten.
- Bereid een primair antilichaam verdunning in 90% antilichaam buffer, 10% NGS oplossing die de pre-en postsynaptische antilichaam paar van uw keuze. Bijvoorbeeld konijnen anti-synapsin (presynaptische marker) (1:750, cytosolische domein, Synaptic Systems) en de muis anti-Homer (postsynaptische marker) (1:500, muis, Synaptic Systems). BELANGRIJK: Centrifuge primaire antilichaam verdunning gedurende 5 minuten op maximale snelheid in een bench top centrifuge aan een neergeslagen antilichaam te verwijderen.
- Voeg 200 ul primaire antilichaam-oplossing aan elke well.
- Incubeer overnacht bij 4 ° C. De plaat moeten worden geplaatst in een grotere container die is bevochtigd om uitdroging te voorkomen van de primaire oplossing. BREAK POINT: Cellen kunnen in het primair antilichaam mengsel voor verblijf voor maximaal 3 dagen de tijd om verder te gaan met het protocol.
- De volgende dag, verwijder primaire antilichaam uit elk putje en spoel putten drie keer met PBS.
4. Toepassing van secundair antilichaam Solution
- Bereid een secundair antilichaam oplossing die uw secundaire antilichamen verdund 1:1000 in antilichaam buffer met 10% NGS. BELANGRIJK: Centrifuge secundaire antilichaamverdunning gedurende 5 minuten op maximale snelheid in een bench top centrifuge om neergeslagen antilichaam te verwijderen. Het overslaan van deze stap resulteert in een hoge secundaire antilichaam achtergrond.
Ongetransfecteerde cellen: In afwezigheid van een cel label, gebruik van Alexa-594 en de Alexa-488 geconjugeerd secondaries voor het labelen van pre-en postsynaptische markers respectievelijk. Zo gebruiken we geit anti-konijn Alexa594 aan de anti-synapsin antilichaam en geit label anti-muis Alexa-488 geconjugeerd secundair aan de anti-homer antilichaam label. BELANGRIJK: Gebruik Alexa-488 geconjugeerd secondaries voor primaire antilichamen met een zwakkere signaal.
Getransfecteerde cellen: Kies secundaire antilichamen die de excitatie-emissie spectrum van uw fluorescerende cel label tegemoet te komen. Bijvoorbeeld, wanneer we getransfecteerde cellen label met tdTomato we gebruik van Alexa-647 geconjugeerd geit anti-konijn naar de anti-synapsin antilichaam herkennen en Alexa-488 geconjugeerd geit anti-muis naar het anti-homer antilichaam te herkennen. Ook het gebruik van de NGS in dit protocol is het resultaat van onze keuze van secundaire antilichamen geproduceerd in geit. - Voeg 200 ul secundair antilichaam-oplossing aan elke well.
- Na incubatie gedurende twee uur bij kamertemperatuur in een donkere plaats, spoel 3 tot 4 keer met PBS.
5. Montage Dekglaasjes
- Mount coverslips in Vectashield montage medium met DAPI (Vector Laboratories Inc, Cat No:. H-1200) op glazen objectglaasjes (VWR wetenschappelijke, Cat No:. 48311-703).
- Voorzichtig toe te passen heldere nagellak rond de randen van het dekglaasje en laat minstens 30 minuten drogen in een droge, donkere plaats. BELANGRIJK: Vermijd duwtjes of verplaatsen van de dekglaasjes tijdens het aanbrengen van de nagellak, omdat dit zou resulteren in Sheering van de cellen.
6. Imaging
Voor de beeldvorming, een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een camera in staat om foto's op 4 verschillende kanalen is het noodzakelijk om te kunnen afbeelding zowel synaptische markers, je cel te vullen en kernen (DAPI / optioneel). De cellen moeten worden afgebeeld met behulp van een olie-immersie 63x doelstelling. We afbeelding met behulp van het Zeiss AxioImager fluorescentie microscoop met de Zeiss Plan-APOCHROMAT 63x/1.4 Oil DIC ∞ / 0,17 doelstelling.
- Selecteer de cellen die ten minste twee diameters cel verwijderd van de dichtstbijzijnde buren. Om te voorkomen dat vooroordelen en willekeur van de cel selectie als visualiseren ongetransfecteerde cellen, selecteert u cellen in de DAPI kanaal te verzekeren, neem foto's in alle kanalen. Als het visualiseren van getransfecteerde cellen cellen te selecteren in het kanaal die overeenkomt met de fluorescent label aan getransfecteerde cellen (bijv. tdTomato) te identificeren.
- Acquire uw afbeeldingen:
Ongetransfecteerde cellen: Voor elke geselecteerde cel, het verkrijgen van 8 bit afbeeldingen in de GFP en Texas Red kanalen. De bovenliggende pseudocolored afbeelding moet u uw pre-en postsynaptische markers in de kleuren rood en groen, respectievelijk.
Getransfecteerde cellen: Voor elke geselecteerde cel te verkrijgen 8 bits afbeeldingen in de GFP, Texas Red en Cy5 (of Cy5.5) kanalen. De bovenliggende pseudocolored afbeelding moet u uw pre-en postsynaptische markers in de kleuren rood en groen, respectievelijk. Pseudo kleur je cel te vullen in het blauw.
7. Beeldanalyse en Co-gelokaliseerde Puncta Kwantificering
- We maken gebruik van Puncta Analyzer-programma voor de kwantificering co-gelokaliseerde synaptische puncta. Puncta Analyzer plug-in is geschreven door Bary Wark, en is beschikbaar op aanvraag (c.eroglu @ cellbio.duke.edu). Puncta Analyzer loopt in ImageJ 1,26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/, nieuwere versies van ImageJ kan niet worden uitgevoerd de toepassing). Voor het installeren van Puncta Analyzer plaatst u de gedownloade toepassing map in de "Plugins" map in de ImageJ 1,26 directory.
- Open een van uw beelden met behulp van ImageJ. Gebruik een van de selectie-gereedschappen in het ImagEJ menu om de regio van belang (ROI) te bepalen. We maken regelmatig gebruik van de ronde selectiegereedschap om een gebied te selecteren ongeveer een cel met een diameter radiaal rond de soma van belang.
- Met uw region of interest (ROI) is geselecteerd, ga dan naar de plugins menu en selecteer "Puncta Analyzer".
- In het 'Analysis Options "venster dat verschijnt, selecteer" Red Channel "," Green Channel ", de eerste" Aftrekken Background "en" Set resultaten file ...." Klik op "OK". U wordt gevraagd om een locatie te definiëren om je resultaten op te slaan inch Deze resultaten kunnen worden geëxporteerd naar Excel voor verdere analyse.
- In het venster dat verschijnt naast, zorg ervoor dat een rollende bal straal van 50 is geselecteerd en schakel de "Witte Achtergrond" optie (deze wijziging is niet verplicht, maar wordt vaak de voorkeur van gebruikers van de applicatie voor het gemak van visualisatie). Klik op "OK".
- Een nieuw venster zal verschijnen naast een masker overeenkomt met uw rode kanaal afbeelding. Pas de drempel totdat je voelt dat de rode masker komt zo goed mogelijk om zo veel discrete individuele puncta zonder dat er te veel lawaai. Dit is een van de meest subjectieve stappen van dit protocol, dus neem zorg voor een consistente aanpak te ontwikkelen. Klik op "Done". De minimale puncta grootte 4 pixels en anders niets veranderen. Klik op "OK".
- Herhaal de vorige stap, dit keer voor het groene kanaal.
- Zodra je de vorige stap, zal de plugin apart bieden kwantificering die overeenkomt met puncta in elk kanaal en om colocalized puncta tussen de twee kanalen.
BRAIN secties:
De synaps test kan worden toegepast op vriescoupes van de hersenen, en aan alle andere zenuwstelsel weefsel (zoals het ruggenmerg of retina) op voorwaarde dat er een geschikte pre-en postsynaptische marker paar (met antilichamen die goed werken in secties) die kunnen worden gebruikt om de synapsen die u wilt kwantificeren identificeren. De synaps assay kan onthullen de tijdelijke regeling de vorming van synapsen in de hersenen een bepaalde regio en kan kwantificeren effecten op de synaptische verbindingen in transgene dieren of in een monster dat is gemanipuleerd op een andere manier.
1. Oogsten hersenweefsel van muizen
Alle dierlijke procedures moet worden gedaan in overeenstemming met de IACUC dier protocollen.
- Euthanaseren muizen door verbloeding en perfusie met PBS. Perfusie met PBS is cruciaal voor het verwijderen van bloed en zal achtergrond signaal te verminderen voor de kleuring procedures. BELANGRIJK: Gebruik geen perfuseren met fixatieven zoals 4% PFA. Dit zal een negatieve invloed hebben op kleuringen.
2. Bevestiging
- Bevestig de hele brein in 4% PFA in PBS bij 4 ° C gedurende de nacht. De volgende dag spoelen de hersenen drie keer met PBS.
- Cryoprotect de hersenen door ze in 30% sucrose in PBS. Het weefsel zal in eerste instantie drijven. Bewaren bij 4 ° C tot het weefsel zinkt naar de bodem. In dat stadium van de cryoprotection is voltooid.
3. Inbedding / Cryosectioning
- Verankeren hersenen op de gewenste oriëntatie voor het snijden (bijv. sagittaal of coronaal) in een 2:1-oplossing van 30% sucrose: (. Tissue-Tek, Cat No: 4583) oktober in PBS. Freeze embedded hersenen op een vlak oppervlak van droogijs. Bevroren embedded hersenen kan worden geplaatst in diepvrieszakken en bewaard bij -80 tot een jaar voordat het snijden.
- Cryosection het weefsel in de 12-16μm secties en monteren op glasplaatjes (Sigma, Cat No:. S4651). Dia's kunnen worden opgeslagen tot een week bij -80 ° C voorafgaand aan de kleuring.
- Dia's te worden gemerkt moet worden gedroogd bij 37 ° C gedurende 30 minuten en 1x gespoeld met PBS om de resterende oktober te verwijderen.
4. Het blokkeren van secties
- Blok secties in 20% normaal geit serum (NGS) in PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur. BELANGRIJK: Gebruik geen Triton X-100 in dit stadium. Voorafgaand aan de toevoeging van de blokkerende oplossing, dan kunt u een hydrofobe barrière rond de secties op de dia met behulp van een Elite PAP Pen (DBS, Cat No:. K039)
5. Het toepassen van Primaire antilichamen
- Verdun je primaire antilichamen in PBS met 0,3% Triton en 10% NGS.
- In de hersenen secties gebruiken we PSD-95 (Zymed, Konijn, 1:500) om glutamaat postsynaptische compartimenten en VGlut1 of VGlut2 (Chemicon, cavia, 1:2500) label aan glutamaat presynaptische terminals label. Centrifuge primaire antilichaam verdunning gedurende 5 minuten op maximale snelheid in een bench top centrifuge om neergeslagen antilichamen te verwijderen indien aanwezig.
- Incubeer secties in primaire antilichaam oplossing voor 36-60 uur bij 4 ° C.
6. Het toepassen van secundaire antilichamen
- Was het primaire antilichaam af door onderdompeling van de dia's 3x in PBS gedurende 15 minuten elk. Na deze stap zorg ervoor dat uw dia's te beschermen tegen direct licht.
- Verdunnensecundaire antilichamen bij een verdunning van 1:200 in dezelfde buffer als beschreven voor primaire antilichamen. Bijvoorbeeld voor VGlut/PSD95 kleuren die we gebruiken geit anti cavia Alexa 488 (Vglut) en de geit anti konijn Alexa 594 (PSD-95) (Invitrogen).
- Incubeer secties in tweede antilichaam oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de ongebonden secundaire antilichamen uit de dia's door onderdompeling van de dia's 4x in PBS gedurende 15 minuten elk.
7. Montage
- Voeg kleine druppels Vectashield montage medium met DAPI (Vector Laboratories Inc) op glas dia's (VWR wetenschappelijk) en vervolgens dekking van de dia's met dekglaasjes (VWR Scientific, nr. 1.5, 48393 241). Van toepassing nagellak om beweging van de dekglaasjes te remmen.
8. Imaging
BELANGRIJK: Een confocale microscoop met minimaal 3 kanalen nodig is voor de beeldvorming hier beschreven. We beeld op een Leica SP5 laser scanning confocale microscoop met behulp van een 63x olie-immersie objectief.
- Synaptic hersengebieden van belang moeten worden geselecteerd voor het scannen van consistent tussen de secties. Bijvoorbeeld, in onze synaps test van retinale ganglion cel synapsen op superieure collicular neuronen, hebben we het imago van de buitenste superieure collicular regio grenst aan de colliculus inferior die de synaptische laag die retinocollicular terminals 7,8,9 ontvangt omvat. We beeld en kwantificeren van de synapsen in de bovenste 150 micrometer synaptische zone van de superieure colliculus waar RGC is bekend om vast te stellen synaptische contacten 9.
- Voor elke sectie, zowel in de 488 en 594 kanalen, we image serie optische secties op 0,33 micrometer tussenpozen gedurende een totale diepte van 5 micrometer voor een totaal van 15 optische secties. Minstens 3 secties van elk dier moet worden afgebeeld en ten minste drie dieren moeten worden opgenomen van een bepaalde experimentele conditie.
- Maximale intensiteit projecties (MIP's) worden gegenereerd uit groepen van drie opeenvolgende secties waardoor 5 MIP's die 1 uM van diepte elk. Deze MIPs zijn gekwantificeerd.
9. Afbeelding Kwantificering
- Kan precies worden uitgevoerd zoals beschreven voor RGC, maar de vorm en grootte van de ROI zal veranderen in functie van welke regio van de beelden die u wenst te kwantificeren.
Sleutels tot succes:
Gezuiverd RGC:
- Alvorens gezuiverd RGC (of andere gedissocieerd cultuur) Zorg ervoor dat u vooraf warm 4% PFA in een waterbad tot 37 ° C voor ~ 20-25 minuten (bewaren bij 4 ° C bij alle andere tijden, geen gebruik maken van PFA verdunningen ouder dan 7 dagen).
- Vooral voor gekweekte neuronen, is het raadzaam om een vacuüm aspirator niet gebruiken tijdens wasbeurten voor alle spoelen stappen. Zachtere methoden zoals het gebruik van een Pasteur pipet en een zuigkracht gloeilamp merkbaar verbeteren van de kwaliteit van uw vlekken.
- Zorg ervoor dat u laat uw cellen uitdrogen tijdens je spoelen stappen.
- Vermijd nudgen of het verplaatsen van uw dekglaasjes tijdens het aanbrengen van nagellak dit te doen kan leiden tot afschuiving van de cellen van uw dekglaasje aan.
- Spin down alle primaire en secundaire antilichamen aan een neergeslagen antilichamen die negatief zal doorwerken vlekken te elimineren.
- Zorg ervoor dat de primaire antilichamen te selecteren voor uw pre-en postsynaptische markers opgegroeid in verschillende soorten. Als dit niet gebeurt zal elimineren je vermogen om onderscheid te maken tussen de twee signalen na toepassing van secundaire antilichamen.
Brain secties:
- Niet perfuseren je muizen met fixatieven, zoals PFA.
- Gebruik geen Triton-X 100 in uw blokkeren oplossing voor de hersenen secties. Daarmee schaadt de kwaliteit van de kleuring voor presynaptische markers, in het bijzonder presynaptische markers die geassocieerd worden met synaptische blaasjes.
- Het gebruik van een confocale microscoop voor beeldvorming is vereist voor beeldacquisitie dat is van voldoende kwaliteit om een synaps analyse uit te voeren.
Representatieve resultaten:
De synaps assay hierboven beschreven is ontworpen om veranderingen in de synaptische verbindingen vast te leggen in vitro en in vivo. In ons lab hebben we gebruik maken van de synaps test om het effect van individuele of meerdere astrocyten afgescheiden moleculen op synapsvorming te bepalen. We gewoonlijk het uitvoeren van deze test synaps op gezuiverd RGC dat we de cultuur in vitro.
Een goed beschreven effect van chronische toepassing van de astrocyten-geconditioneerde media (ACM) in gezuiverde RGC culturen is een multiple-voudige toename van het aantal synapsen die gevormd worden tussen RGC 3,4,5,6. Figuur 1A en 1B tonen representatieve beelden van de ongetransfecteerde gezuiverd RGC die behandeld werden met basale groei media of met ACM. Na de kleuring voor prikkelende pre-en postsynaptische markers, de ACM-geïnduceerde stijging van de synapse formatie is kwalitatief duidelijk (Figuur 1A, 1B). Inderdaad, deze bevinding is bevestigd door verschillende studies die gebruik hebben gemaakt van de elektrofysiologie om aan te tonen dat de ACM-geïnduceerde synapsen zijn functioneel en elektronenmicroscopie aan te tonen dat de synapsen zijn ultrastructurally normaal 3,4,6. Ander werk in ons laboratorium heeft gewezen op de calciumantagonisten subunit α2δ-1 als de neuronale receptor voor een sterk synaptogenic astrocyten afgescheiden molecule, thrombospondine 3. Hier hebben we de resultaten van een experiment in gezuiverde RGC, dat werd uitgevoerd om te bepalen of de verhoogde niveaus van α2δ-1 verder ACM-geïnduceerde synapsvorming (figuur 3) verbetert.
RGC werden gecotransfecteerd met ofwel een lege vector of met een construct dat codeert voor α2δ-1 met een aparte construct dat codeert voor tdTomato na 5 dagen in vitro (DIV5). Na chronische behandeling met ofwel ACM of GM, werden RGC gefixeerd en gekleurd op DIV 11. Naar aanleiding van immunokleuring van pre-en postsynaptische markers van de prikkelende synapsen zien we een kwalitatief duidelijke toename in het aantal synaps in gezuiverde RGC dat zich een lege vector (pcDNA3.1) of α2δ-1 (afb. 1C, 1D). We kwantificeren de synaptogenic effect van ACM gebruiken Puncta analyzer te synaps nummer (afb. 2) tellen voor minstens 15 neuronen uit elke conditie. Een steekproef van deze grootte kunnen we het gemiddelde aantal synapsen per neuron te berekenen en een statistisch significante, ~ 10-voudige toename van synapsen gevormd door ACM-behandelde neuronen die hebben een lege vector (afb. 3, grijze balken) te vinden. Verder hebben we laten zien dat overexpressie van α2δ-1 leidt tot een aanzienlijke versterking van de ACM-geïnduceerde synapsvorming (~ 20-voudig. Figuur 3, zwarte balken).
In aanvulling op gekweekte neuronen, kunnen wij synaptische densiteit kwantificeren in verschillende gebieden van de hersenen met behulp van deze techniek. De superieure colliculus is een hersenstructuur die retinocollicular projecties ontvangt, afkomstig uit RGC in het netvlies 7,8,9. Meer dan postnatale ontwikkeling, het aantal prikkelende synapsen gevormd door RGC op hun doelen in de superieure colliculus stijgt dramatisch van P7 naar P21 7,8,9.
Met behulp van onze kwantificering techniek, laten we zien dat het aantal retinocollicular synapsen gevormd in de superieure colliculus stijgt van P7 naar P14. Om dit te doen, we gekwantificeerd synaptische densiteit bij P7 en weer op P14. We vlekken op de superieure colliculus voor de PSD-95 (postsynaptische) en voor VGlut2 (presynaptische marker die specifiek zijn voor RGC synapsen in de superieure colliculus). De buitenste synaptische regio van de superieure colliculus werd in beeld gebracht (afb. 4A) en co-gelokaliseerde VGlut2/PSD-95 synapsen werden gekwantificeerd (figuur 4B, 4C) van ten minste 3 secties per dier en van ten minste drie dieren per tijdstip. Kwantificering van de resulterende data toont duidelijk een meer dan drie-voudige significante toename van het aantal synapsen tussen P7 en P14. Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerder gepubliceerde bevindingen gebruik te maken van elektronenmicroscopie (afb. 4D) 9.
Kortom, de methode van synaps aantal kwantificering we hier beschrijven is een nuttig hulpmiddel om synaps aantal en de dichtheid in de cultuur en in het zenuwweefsel te bepalen, waardoor we de effecten van het manipuleren van synapsvorming in vitro of in vivo studie.
Figuur 1: Vertegenwoordiger synaptic kleuring in gezuiverde RGC. (A en B) drie dagen in vitro (DIV) RGC werden ofwel gekweekt in (A) basale groei media (GM) of in (B) pro-synaptogenic muis astrocyten geconditioneerde media (ACM) voor een extra 6 dagen. De cellen werden vervolgens gelabeld voor fagot (presynaptische, rood) en homer (postsynaptische, groen). Muis ACM stimuleert sterk synapsvorming tussen RGC zoals bepaald door de toename van het aantal co-gelokaliseerde fagot en homer puncta. (C en D) 5DIV RGC werden getransfecteerd met een plasmide van de calcium-kanaal subunit α2δ-1 overexpressie. Getransfecteerde cellen werden geïdentificeerd met een tdTomato cel te vullen (blauw) en zijn gekleurd voor presynaptische marker synapsin en postsynaptische marker Homerus. Pijlen geven synapsen. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 urn.
Figuur 2:. Kwantificering van synapsen nummer met Puncta Analyzer hier afgebeeld is een voorbeeld van (a) een origineel beeld van een gezuiverde retinale ganglion cel overexpressie van de thrombospondine receptor α2δ-1 en is gekleurd voor presynaptische marker synapsin en postsynaptische marker Homerus. (B) afbeeldingen die overeenkomt met de maskers die in elk kanaal bij de analyse van puncta in Puncta Analyzer. (C) Puncta Analzyer zal leiden tot een beeld, zoals de hier getoonde waarin puncta worden aangegeven door kleine zwarte puntjes (inzet). Ook shown is (d) de numerieke uitvoer van de applicatie waar puncta nummer samen met een aantal andere parameters worden gegeven in tekstuele / numerieke vorm (vette tekst toegevoegd voor de nadruk).
Figuur 3:. Vertegenwoordiger resultaat voor synaps test Hier is de synaptogenic effect van de chronische behandeling van de RGC met astrocyte-geconditioneerde media (ACM) in getransfecteerde RGC dat zich lege vector (pcDNA3.1, grijze balken) of de thrombospondine receptor α2δ-1 . Fout balken geven de SEM. GM = Groei Media. ACM = (Rat) astrocyten Contitioned Media.
Figuur 4:. Kwantificering van synaptische densiteit in muis superior colliculus (a) Om de ontwikkeling veranderingen in het aantal van glutamaat synapsen opgericht door RGC op zijn superieure collicular doelen in de knaagdieren hersenen vast te stellen, we vriescoupes van de hersenen van muizen gekleurd met antilichamen tegen de presynaptische marker VGlut2 (groen) en de postsynaptische marker, PSD-95, (rood). We afgebeeld de buitenste 150 x 150 micrometer gebied van de muis superior colliculus (SC) die overeenkomt met de synaptische doelgebied voor het RGC met behulp van een laser scanning confocale microscoop. Een z-stack voor elke SC sectie was verzameld voor een totale diepte van 5 micrometer (15 x 0,33 micrometer optische secties). Maximum image projecties (MIP's) werden gegenereerd voor groepen van 3 opeenvolgende optische secties waardoor 5 MIP / sectie die elk een urn van diepte. Hieronder vindt u een representatief MIP genomen uit een superieure colliculus van een P14 WT muis. De presynaptische marker, VGlut2, wordt weergegeven in groen en de postsynaptische marker, PSD-95, is weergegeven in het rood. (C) numerieke output geproduceerd door Puncta Analyzer. (D) Kwantificering van de analyse van de synaps nummer voor minstens 3 secties per dier met drie dieren per tijdstip (error bars geven SEM). Schaalbalk vertegenwoordigt 50 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De synaps assay hierboven beschreven is gevestigd in de context van onze experimentele doelen, waarin we vooral focussen op prikkelende projecties van RGC, hetzij in gezuiverde cultuur of in de hersenen sectie. We hebben een referentie tabel met antilichamen die goed werken voor etikettering excitatoire synapsen (tabel 1).
Dit synaps assay kan worden aangepast aan het aantal synaps van een neuronale populatie of een ander subtype synaptic waarvoor er een selectieve pre-en postsynaptische marker kwantificeren. Bijvoorbeeld, de synaps test hier beschreven kunnen worden toegepast op het bestuderen van GABA-erge (in tegenstelling tot glutamaat) synapsen met behulp van passende pre-en postsynaptische markers 10,11.
Dit synaps assay is een belangrijk instrument voor laboratoria onderzoeken van veranderingen in de synaptische verbindingen tussen neuronen. Hoewel het nodig is om bevestigen de bevindingen van deze test met elektronenmicroscopie en elektrofysiologie, het biedt toch een relatief eenvoudige manier om belangrijke vragen over de moleculaire signalen die een neuronen 'vermogen om te synapsen vormen moduleren beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Puncta Analyzer plug-in voor Image J werd door Barry Wark (huidig adres: Physion Consulting) geschreven in het lab van Ben A. Barres (Stanford University).
Financiering;
- Alfred P. Sloan Foundation
- De Esther A. en Joseph Klingenstein Fund, Inc
- Brede Biomedical Research Foundation
- Remedie voor de ziekte van Huntington s Initiatief
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) | Mouse | Monoclonal |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined. | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| poly-d-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| l-lysine | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24-well culture plate | Falcon BD | 35-3047 | |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | --- | |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR international | 48393241 | |
| Glass slides | VWR international | 48311-703 | |
References
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
- Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
- Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
- Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).
