Summary
هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تحديد عدد المشبك في كل ثقافة العصبية وفصلها في أقسام المخ باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية. المقصورة الخاصة به الأضداد ، ونحن تسمية محطات قبل المشبكي وكذلك المواقع ذات التخصص بعد المشبكي. نحدد نقاط الاشتباك العصبي كنقاط colocalization بين الإشارات التي تولدها هذه العلامات.
Abstract
واحدة من أهم الأهداف في علم الأعصاب هو فهم الاشارات الجزيئية التي توعز المراحل الأولى من تشكيل المشبك. على هذا النحو أصبح من الضروري وضع نهج موضوعي لقياس التغييرات في اتصال متشابك. بدءا من تثبيت العينة ، وهذا البروتوكول تفاصيل كيفية تحديد عدد المشبك في كل ثقافة العصبية وفصلها في أقسام المخ باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية. المقصورة الخاصة به الأضداد ، ونحن تسمية محطات قبل المشبكي وكذلك المواقع ذات التخصص بعد المشبكي. نحدد نقاط الاشتباك العصبي كنقاط colocalization بين الإشارات التي تولدها هذه العلامات. وكميا في عدد من هذه colocalizations باستخدام المكونات في محلل نقاط و(كتبه ارك البارى ، متوفرة عند الطلب ، c.eroglu @ cellbio.duke.edu) في إطار برنامج ImageJ منصة التحليل. يمكن تطبيق مقايسة المشبك وصفها في هذا البروتوكول إلى أي تحضير الأنسجة العصبية أو الثقافة التي لديك علامات انتقائية قبل وبعد المشبكي. هذا الاختبار المشبك هو أداة قيمة التي يمكن استخدامها على نطاق واسع في دراسة التنمية متشابك.
Protocol
حلول لإعداد :
- الأضداد الاحتياطي :
- 150 مم كلوريد الصوديوم
- 50 ملي تريس للقاعدة (فيشر ، القط لا : BP152 - 5 ، 50 ملم) -- 1،21 ز
- 1 ٪ BSA (سيغما ، القط لا : A2153 ، 1 ٪) -- 2.0 ز
- 100 ملي L - يسين (سيغما ، القط لا : L - 1137 ، 100 ملم) -- 3،65 ز
- ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4
- 0.04 ٪ آزيد
- ضبط حجم 200 مل مع المقطر O. 2 H
- من خلال فلتر تصفية 0.22μm (ميليبور ، القط لا : SCGPU02RE).
- PFA Diluant :
- 168 مل 0.5 م 2 نا هبو 4 (ثنائي القاعدة)
- 72 مل نا 0.5M 2 هبو 4 (أحادي القاعدة)
- 660 مل المقطر H 2 O
- 4 ٪ PFA تثبيتي للمثقف الخلايا العصبية (الحل # 2) :
- 10 مل 16 ٪ PFA الحل (علوم المجهر الإلكتروني ، القط لا : 15711)
- 30 مل 4 ٪ PFA diluant (الحل # 2)
- 4 ٪ PFA في برنامج تلفزيوني :
- 4 ز PFA (الكترون Microscropy العلوم ، القط لا : 19210)
- 100 مل PBS (Invitrogen ، القط لا : 20012-027)
- الحرارة إلى 40 درجة مئوية ، ويحرك بين عشية وضحاها.
- التصفية من خلال مرشح 0.22μm (ميليبور ، القط لا : SCGPU02RE)
- حظر العازلة (الحجم الكلي (على 24 لوحة جيدا) = (# coverslips +1) س 200μl)
- 50 ٪ العازلة جسم (حل # 1)
- 50 ٪ مصل الماعز عادي (Gibco ، القط لا : 16210)
- 0.2 ٪ تريتون X - 100 (روش تشخيص GMBH ، القط لا : 9002-93-1)
- السكروز 30 ٪ في برنامج تلفزيوني
- 30 غرام السكروز (Biomedicals النائب ، وشركة ، القط لا : 821713)
- 70 مل PBS (Invitrogen ، القط لا : 20012-027)
- مزيج مع stirbar حتى السكروز في الحل.
- جعل حجم ما يصل الى 100ML مع برنامج تلفزيوني
- التصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون (ميليبور ، القط لا : SCGPU02RE)
التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية :
بروتوكول الموصوفة هنا تنطبق على أي الثقافات الأولية نمت الخلايا العصبية في 12 coverslips الزجاج ملم (كارل هيشت ، رقم O ، القط لا : 99010) في لوحات - 24 كذلك (فالكون ، 35-3047). على سبيل المثال ، لدينا نحن في المختبر خلايا الفئران ثقافة عقدة شبكية العين (RGCs) المنقى من شبكية العين الفئران التي تحصد من 1،2 P5 - 7 الحيوانات. تزرع الخلايا على coverslips الزجاج المطلي مع بولي د يسين (سيغما ، القط لا : P6407) (. Cultrex ، القط رقم : 3400-010-01) والفأر laminin. علينا الاستفادة من هذه الثقافة في إعداد بضعة طرق مختلفة لمقايسة المشبك لدينا. واحد التلاعب الذي نقوم ينطوي RGCs زراعة سواء في وجود أو غياب نجمية ، يفرز عوامل synaptogenic. بدلا من ذلك ، كما قمنا بتوظيف هذه الشروط معاملة مختلفة في التجارب التي تم فيها transfected RGCs لoverexpress بروتين من الفائدة. في الحالة الأخيرة ، فقد شاركنا في transfect الخلايا مع تسمية الخلية (على سبيل المثال أو tdTomato GFP). هذه المناهج التجريبية المختلفة تؤثر على كيفية واحد ينفذ خطوات معينة لفحص المشبك ، الذي نوضح أدناه.
1. تحديد فصل RGCs منقى
- prewarmed بإزالة الوسائط الثقافة من الآبار التي تحتوي على RGC وإضافة 500 ميكرولتر (لوحة 24 أيضا) بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) إلى 37 درجة مئوية إلى كل بئر. يسمح للخلايا لعلاج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- التثبيت بعد شطف الخلايا 3 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (Invitrogen ، القط لا : 20012-027). هام : لا ينبغي أبدا أن تترك بدون خلايا السائل في الآبار ، وبمجرد إزالة حاجز من بئر وينبغي استبداله فورا من قبل العازلة المقبل. عند هذه النقطة ، وخلايا جاهزة للimmunostaining.
2. حجب مواقع الربط غير محددة على RGCs
- إعداد حظر العازلة التي تحتوي على 50 ٪ من مصل طبيعي الماعز (NGS ، Gibco ، القط لا : 16210) و 0.2 ٪ تريتون X - 100 (روش تشخيص GMBH ، القط لا : 9002-93-1). بعد إزالة برنامج تلفزيوني من كل جانب ، إضافة 200 ميكرولتر من المنطقة العازلة لمنع وعرقلة كل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحجب وشطف العازلة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
3. تطبيق الحل الأساسي جسم
- هام : تأكد من اختيار الأجسام المضادة الأولية للعلامات الخاصة بك قبل وبعد المشبكي التي يتم الحصول عليها من مختلف الأنواع.
- إعداد الأجسام المضادة الأولية في التخفيف العازلة الأضداد 90 ٪ ، 10 ٪ NGS محلول يحتوي على الزوج قبل وبعد المشبكي الضد من اختيارك. لأرنب سبيل المثال مكافحة synapالخطيئة (علامة قبل المشبكي) (1:750 ، مجال عصاري خلوي ، نظم متشابك) والفأر مكافحة هوميروس (علامة بعد المشبكي) (1:500 ، والماوس ، ونظم متشابك). هام : جهاز طرد مركزي الأساسي تخفيف الضد لمدة 5 دقائق على أقصى سرعة أجهزة الطرد المركزي في المقعد العلوي لإزالة أي جسم عجل.
- إضافة 200 ميكرولتر الحل الأساسي لكل الأجسام المضادة أيضا.
- يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يجب وضع لوحة في أكبر الحاويات التي يتم ترطيب لمنع جفاف من الحل الأساسي. BREAK POINT : خلايا يمكن ان يبقى في الخليط الضد الابتدائية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل الاستمرار في البروتوكول.
- في اليوم التالي ، وإزالة الأجسام المضادة الأولية من كل بئر وشطف الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
4. تطبيق الحل جسم الثانوية
- يعد حل الثانوية التي تحتوي على أجسام مضادة الضد الخاص الثانوي في المخفف 1:1000 العازلة التي تحتوي على الضد NGS 10 ٪. هام : جهاز طرد مركزي الثانوية تخفيف الضد لمدة 5 دقائق على أقصى سرعة أجهزة الطرد المركزي في المقعد العلوي لإزالة الأجسام المضادة عجل. تخطي هذه الخطوة نتائج عالية في الخلفية الضد الثانوية.
خلايا Untransfected : في حالة عدم وجود خلية التسمية ، استخدم اليكسا - 594 - 488 واليكسا مترافق المرتبات الثانية لوضع العلامات علامات قبل وبعد المشبكي على التوالي. على سبيل المثال نستخدم الماعز المضادة للأرنب Alexa594 لتسمية الأضداد المضادة للsynapsin والماعز المضادة الماوس اليكسا - 488 مترافق الثانوية لتسمية الأضداد المضادة للهوميروس. IMPORTANT : استخدام اليكسا - 488 المرتبات الثانية مترافق عن الأجسام المضادة الأولية مع الإشارة الأضعف.
خلايا Transfected : اختيار الأضداد الثانوية التي تستوعب الطيف الإثارة الانبعاثات من تسمية الخلية الفلورسنت. على سبيل المثال ، عندما كنا تسمية الخلايا transfected مع tdTomato نستخدم اليكسا - 647 مترافق الماعز المضادة للأرنب الاعتراف الأضداد المضادة للsynapsin واليكسا - 488 مترافق. الماعز المضادة للماوس على التعرف على الأجسام المضادة للهوميروس أيضا ، استخدام NGS في هذا البروتوكول هو نتيجة خيارنا الأجسام المضادة الثانوية المنتجة في الماعز. - إضافة 200 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر.
- بعد حضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم ، وشطف 3 إلى 4 مرات مع برنامج تلفزيوني.
5. تصاعد Coverslips
- coverslips في جبل Vectashield المتوسطة مع تصاعد دابي (مختبرات شركة ناقلات ، القط لا : H - 1200) على الشرائح الزجاجية (VWR العلمية ، والقط لا : 48311-703).
- بلطف تطبيق طلاء الأظافر واضحة حول حواف ساترة ، والسماح لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل في مكان جاف ومظلم. هام : تجنب بايعاز أو نقل coverslips خلال تطبيق طلاء الأظافر لأن هذا من شأنه أن يؤدي في sheering الخلايا.
6. التصوير
التصوير ، ومضان المجهر مجهز بكاميرا قادرة على التقاط صور في 4 قنوات مختلفة من الضروري أن تكون قادرا على صورة كل من علامات متشابك ، صومعتك التعبئة والنوى (دابي / اختياري). ينبغي تصويرها باستخدام خلايا 63x الغمر الهدف النفط. نحن صورة باستخدام المجهر مضان AxioImager زايس مع زايس خطة مدينة دبي للإنترنت ، لامزيغ النفط 63x/1.4 ∞ / 0.17 الهدف.
- تحديد الخلايا التي يتم قطرها خلية اثنين على الأقل بعيدا عن أقرب جيرانهم. لتجنب التحيز وضمان عشوائية اختيار الخلية إذا تصور untransfected الخلايا ، حدد الخلايا في قناة دابي ، ثم أخذ الصور في جميع القنوات. إذا الخلايا transfected تصور تحديد الخلايا في القناة المقابلة لتسمية الفلورسنت لتحديد الخلايا transfected (مثل tdTomato).
- الحصول على الصور الخاصة بك :
خلايا Untransfected : لكل الخلية المحددة ، الحصول على صور 8 بت في GFP وقنوات تكساس الأحمر. ينبغي أن يكون صورة فرضه pseudocolored علامات الخاص قبل وبعد المشبكي في الحمراء والخضراء ، على التوالي.
خلايا Transfected : للحصول على كل خلية الحصول على صور مختارة 8 بت في GFP ، تكساس الأحمر وCy5 (أو Cy5.5) القنوات. ينبغي أن يكون صورة فرضه pseudocolored علامات الخاص قبل وبعد المشبكي في الحمراء والخضراء ، على التوالي. الألوان الزائفة صومعتك ملء باللون الأزرق.
7. تحليل الصورة والمشارك المترجمة نقاط والكمي
- نستخدم برنامج نقاط ومحلل للالكمي المشترك المترجمة نقاط ومتشابك. كتب محلل نقاط وتوصيل بواسطة ارك البارى ، ويتوفر عند الطلب (c.eroglu @ cellbio.duke.edu). نقاط ومحلل يعمل في ImageJ 1.26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/ ، أحدث إصدارات ImageJ لا يمكن تشغيل التطبيق). لتثبيت نقاط ومحلل ببساطة مكان مجلد التطبيق تحميلها في مجلد "ملحقات" في الدليل ImageJ 1.26.
- فتح واحدة من الصور الخاصة بك باستخدام ImageJ. استخدم إحدى أدوات التحديد في ايماجEJ القائمة لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI). نستخدم أداة التحديد المنتظم لتعميما لتحديد منطقة ما يقرب من خلية واحدة قطرها شعاعيا حول سوما من الفائدة.
- مع منطقة اهتمامك (ROI) المختارة ، اذهب إلى قائمة الإضافات وحدد "نقاط ومحلل".
- في إطار "تحليل الخيارات" التي تظهر ، حدد "القناة الحمراء" ، "قناة خضراء" ، الأول "خلفية طرح" و "تعيين ملف النتائج...." انقر على زر "موافق". وسوف يطلب منك تحديد موقع لحفظ نتائجك فيها يمكن تصدير هذه النتائج إلى Excel لمزيد من التحليل.
- في الإطار الذي يظهر المقبلة ، تأكد من تحديد دائرة نصف قطرها شعرة معاوية بين 50 و قم بإلغاء تحديد "خلفية بيضاء" الخيار (غير مطلوب ولكن هذا التعديل ويفضل كثير من الأحيان من قبل المستخدمين للتطبيق لسهولة التصور) انقر على زر "موافق".
- سوف تظهر نافذة جديدة جنبا إلى جنب مع قناع المقابلة مع قناة صورتك الحمراء. ضبط عتبة حتى تشعر بأن القناع الأحمر يقابل وكذلك من الممكن في كثير من نقاط والفردية المنفصلة دون إدخال الكثير من الضجيج. هذه هي واحدة من أكثر الخطوات ذاتية من هذا البروتوكول ، حتى تأخذ الرعاية لوضع نهج متسق. انقر على زر "تم". تعيين حجم الحد الأدنى للنقاط و4 بكسل وتعديل أي شيء آخر. انقر على زر "موافق".
- كرر الخطوة السابقة ، وهذه المرة للقناة خضراء.
- بمجرد الانتهاء من الخطوة السابقة ، سوف يوفر البرنامج المساعد الكمي نقاط وتقابل في كل قناة على حدة ، ونقاط وcolocalized بين القناتين.
BRAIN أقسام :
يمكن تطبيق مقايسة المشبك لcryosections من الدماغ ، وتقديمها إلى أي نوع من الأنسجة الأخرى في الجهاز العصبي (مثل الحبل الشوكي أو شبكية العين) أن هناك علامة مناسبة الزوج قبل وبعد المشبكي (مع الأجسام المضادة التي تعمل بشكل جيد في الفروع) التي يمكن تستخدم لتحديد نقاط الاشتباك العصبي التي تريد قياسها كميا. يمكن للمقايسة المشبك كشف التنظيم الزمني لتشكيل المشبك في منطقة الدماغ ، ويمكن إعطاء تقدير الآثار المترتبة على الربط بين الحيوانات المعدلة وراثيا متشابك أو في العينة التي تم التلاعب بها بطريقة أخرى.
1. حصاد أنسجة المخ من الفئران
يجب أن تتم جميع الإجراءات الحيوانية في التوافق مع بروتوكولات IACUC الحيوانية.
- الموت ببطء الفئران عن طريق استنزاف ونضح مع برنامج تلفزيوني. نضح مع برنامج تلفزيوني أمر حاسم لإزالة الدم ويقلل إشارة الخلفية للإجراءات تلطيخ. هام : لا يروي مع مثبتات مثل PFA 4 ٪. وسوف يؤثر هذا سلبا على نتائج تلوين.
2. تثبيت
- الإصلاح في الدماغ كله PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية خلال الليل. في اليوم التالي شطف أدمغة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- Cryoprotect العقول عن طريق وضعها في السكروز 30 ٪ في برنامج تلفزيوني. وسوف تطفو على الأنسجة في البداية. تبقي على 4 درجات مئوية حتى الأنسجة المصارف إلى أسفل. في تلك المرحلة cryoprotection كاملة.
3. تضمين / Cryosectioning
- تضمين العقول في التوجه المطلوب لsectioning (مثل سهمي أو الإكليلي) في محلول السكروز 02:01 من 30 ٪ : (تك الأنسجة ، القط رقم : 4583) أكتوبر في برنامج تلفزيوني. تجميد العقول جزءا لا يتجزأ من على سطح مستو من الثلج الجاف. يمكن وضعها في المجمدة أدمغة مضمن في أكياس والاحتفاظ بها في الثلاجة -80 تصل الى عام قبل sectioning.
- Cryosection النسيج في 12 - 16μm المقاطع وجبل على الشرائح الزجاجية (سيغما ، القط لا : S4651). ويمكن تخزين ما يصل إلى الشرائح في الأسبوع على -80 درجة مئوية قبل التلوين.
- وينبغي أن يكون المجفف شرائح ملون في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقائق ، وشطف مع 1X PBS لإزالة أكتوبر المتبقية.
4. حجب المقاطع
- كتلة المقاطع في 20 ٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. IMPORTANT : لا تتضمن تريتون X - 100 في هذه المرحلة. قبل إضافة محلول حظر ، قد خلق حاجز مسعور حول المقاطع على الشريحة باستخدام القلم PAP النخبة (DBS ، القط لا : K039)
5. تطبيق أجسام الابتدائية
- تمييع الأضداد الأساسي الخاص بك في برنامج تلفزيوني مع تريتون 0.3 ٪ وNGS 10 ٪.
- في أقسام الدماغ التي نستخدمها PSD - 95 (Zymed ، أرنب ، 1:500) لتسمية المقصورات وبعد المشبكي glutamatergic VGlut1 أو VGlut2 (Chemicon ، خنزير غينيا ، 1:2500) لتسمية المحطات glutamatergic قبل المشبكي. الطرد المركزي التخفيف الضد الابتدائية لمدة 5 دقائق على أقصى سرعة أجهزة الطرد المركزي في المقعد العلوي لإزالة الأجسام المضادة عجلت إذا كان موجودا.
- احتضان المقاطع في حل الضد الأولية عن 36-60 ساعة في 4 درجات مئوية.
6. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية
- غسل جسم الأولية قبالة بغمر الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة لكل منهما. بعد هذه الخطوة للتأكد من حماية الشرائح من الضوء المباشر.
- تمييعالأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1:200 في المخزن نفسه كما هو موضح عن الأجسام المضادة الأولية. على سبيل المثال لتلطيخ VGlut/PSD95 نستخدم الماعز مكافحة الخنازير الغينية اليكسا 488 (Vglut) الأرنب والماعز المضادة اليكسا 594 (PSD - 95) (Invitrogen).
- احتضان المقاطع في حل الضد الثانوية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- غسل الأجسام المضادة غير منضم الثانوية قبالة الشرائح بغمر الشرائح 4X في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
7. متزايد
- إضافة قطرات صغيرة من تصاعد Vectashield المتوسطة مع دابي (مختبرات شركة ناقلات) على الشرائح الزجاجية (VWR العلمي) ثم تغطية الشرائح مع coverslips (VWR العلمية ورقم 1.5 ، 48393 241). تطبيق طلاء الأظافر لمنع حركة coverslips.
8. التصوير
هام : مطلوب المجهر مبائر مع ما لا يقل عن 3 قنوات للتصوير الموصوفة هنا. ونحن على صورة مجهر المسح بالليزر لايكا SP5 مبائر باستخدام الغمر النفط 63x الهدف.
- يجب أن يتم تحديد مناطق الدماغ متشابك المصالح لمسح باستمرار بين المقاطع. على سبيل المثال ، لدينا تجربة في الشبكية المشبك من نقاط الاشتباك العصبي الخلية العصبية على العقدة أكيمي متفوقة ، ونحن الخارجي صورة متفوقة أكيمي المنطقة المتاخمة للأكيمة السفلي الذي يشمل طبقة متشابك المحطات التي تتلقى retinocollicular 7،8،9. نحن الصورة وتحديد نقاط التشابك العصبي في منطقة العلوية 150 ميكرومتر متشابك من أكيمة متفوقة حيث من المعروف أن RGCs لإقامة اتصالات متشابك 9.
- لكل مقطع ، سواء في قنوات 488 و 594 ، فإننا الصور الضوئية المقاطع في المسلسل أكثر من 0.33 ميكرون فترات عمق مجموعه 5 ميكرون أي ما مجموعه 15 المقاطع البصرية. يجب تصوير ما لا يقل عن 3 أجزاء من كل حيوان ، ويجب أن تدرج على الأقل 3 الحيوانات من شرط تجريبي معين.
- تتولد إسقاطات كثافة الأقصى (خطط تنفيذ البعثات) من مجموعات من 3 أقسام متتالية الغلة 5 خطط تنفيذ البعثات 1μm تمثل العمق لكل منهما. هذه هي الكمية MIPS.
9. صورة الكمي
- قد يكون أداؤها تماما كما وصفها لRGCs ، ومع ذلك فإن شكل وحجم العائد على الاستثمار تغيير بوصفها وظيفة من أي منطقة من الصور التي تريد قياسها كميا.
مفاتيح النجاح :
RGCs المنقى :
- قبل تحديد RGCs المنقى (أو فصل الثقافة الأخرى) للتأكد من قبل PFA الحارة 4 ٪ في حمام مائي تعيين إلى 37 درجة مئوية لمدة 20-25 دقيقة ~ (مخزن في 4 درجات مئوية في كل الأوقات الأخرى ، لا تستخدم التخفيفات PFA مضى عليها أكثر من 7 أيام).
- ولا سيما بالنسبة للمثقف الخلايا العصبية ، فإنه من المستحسن أن لا تستخدم الشافطة الفراغ خلال يغسل شطف لجميع الخطوات. ألطف الأساليب مثل استخدام ماصة باستور لمبة الشفط وتحسين ملحوظ في نوعية التلوين الخاص.
- الحرص على عدم السماح لخلايا الجسم تجف خلال الخطوات شطف الخاص بك.
- تجنب أو تتحرك بايعاز coverslips الخاص خلال تطبيق طلاء الأظافر لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى القص من الخلايا على ساترة الخاص.
- تدور أسفل كل الأجسام المضادة الأولية والثانوية للقضاء على أي أجسام مضادة عجلت التي ستؤثر سلبا على تلطيخ.
- تأكد من تحديد الأجسام المضادة الأولية للعلامات الخاصة بك قبل وبعد المشبكي التي أثيرت في الأنواع المختلفة. والفشل في القيام بذلك القضاء على قدرتك على التمييز بين الإشارات اثنين بعد تطبيق الأضداد الثانوية.
الدماغ الأقسام :
- لا يروي الفئران الخاص بك مع مثبتات مثل PFA.
- لا تشمل تريتون - X 100 في عرقلة الحل لأقسام الدماغ. بذلك الأضرار نوعية لتلطيخ قبل المشبكي علامات ، وعلامات قبل المشبكي خاصة المقترنة مع حويصلات متشابك.
- مطلوب استخدام المجهر مبائر للتصوير لاقتناء الصورة التي هو من نوعية جيدة بما يكفي لإجراء تحليل المشبك.
ممثل النتائج :
تم تصميم مقايسة المشبك المذكورة أعلاه لالتقاط التغيرات في اتصال متشابك في المختبر والمجراة. في المختبر ، ونحن الاستفادة من مقايسة المشبك لتحديد تأثير الجزيئات إما فردية أو متعددة نجمية ، يفرز في تشكيل المشبك. نقوم عادة هذا الاختبار على المشبك RGCs المنقى أننا الثقافة في المختبر.
وهناك تأثير وصفا جيدا للتطبيق المزمنة نجمية مكيفة وسائل الاعلام (ACM) في تنقية الثقافات RGC هو زيادة عدة مرات في عدد من نقاط الاشتباك العصبي التي تتشكل بين RGCs 3،4،5،6. الشكل 1A 1B وتظهر الصور ممثل untransfected RGCs المنقى تعامل مع أي من وسائط النمو القاعدية أو مع ACM. بعد تلطيخ مثير للعلامات قبل وبعد المشبكي ، والزيادة التي يسببها ACM في لياليynapse تشكيل هو واضح من حيث النوعية (الشكل 1A ، 1B). في الواقع ، كانت هذه الحقائق أكدها العديد من الدراسات التي استخدمت الكهربية لإظهار أن ACM بفعل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية والإلكترون المجهري تبين أن نقاط الاشتباك العصبي طبيعية ultrastructurally 3،4،6. وقد حددت الأعمال الأخرى في مختبرنا الوحيدات قناة الكالسيوم α2δ - 1 كما مستقبلات الخلايا العصبية لجزيء synaptogenic بقوة نجمية ، يفرز ، thrombospondin 3. هنا ندرج نتائج تجربة في تنقية RGCs التي تم تنفيذها لتحديد ما إذا كانت زيادة مستويات 1 - α2δ يعزز ACM التي يسببها تشكيل المشبك (الشكل 3).
وcotransfected RGCs مع ناقلات an إما فارغة أو مع ترميز بناء α2δ - 1 مع بناء منفصلة ترميز tdTomato بعد 5 أيام في المختبر (DIV5). بعد العلاج المزمن إما مع ACM أو المعدلة وراثيا ، وكانت ثابتة RGCs الملون على DIV 11. التالية immunolabeling علامات قبل وبعد المشبكي من نقاط الاشتباك العصبي مثير نرى الزيادة الواضحة في عدد المشبك نوعيا في التعبير عن تنقية RGCs إما ناقلات فارغة (pcDNA3.1) أو α2δ - 1 (الشكل 1C ، 1D). علينا تحديد كمي للأثر synaptogenic ACM به من نقاط ومحلل لحساب عدد المشبك (الشكل رقم 2) ما لا يقل عن 15 حالة من كل الخلايا العصبية. عينة من هذا الحجم يسمح لنا لحساب متوسط عدد نقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية وايجاد إحصائيا ، ~ 10 أضعاف الزيادة في نقاط الاشتباك العصبي التي شكلتها ACM معاملة الخلايا العصبية التي هي التعبير عن ناقلات فارغة (الشكل رقم 3 ، وخطوط رمادية). وعلاوة على ذلك ، وتبين لنا أن overexpression من α2δ - 1 يؤدي إلى التقوية كبيرة من تشكيل المشبك ACM المحرض (~ 20 أضعاف. الشكل رقم 3 ، أشرطة سوداء).
بالإضافة إلى الخلايا العصبية مثقف ، يمكننا قياس كثافة متشابك في مناطق الدماغ المختلفة باستخدام هذه التقنية. وأكيمة متفوقة هو بنية الدماغ الذي يتلقى التوقعات retinocollicular ، مصدرها RGCs في الشبكية 7،8،9. على التنمية ما بعد الولادة ، وعدد من نقاط الاشتباك العصبي مثير شكلتها RGCs على أهدافها في أكيمة متفوقة يزيد بشكل كبير من P7 لP21 7،8،9.
باستخدام تقنية القياس الكمي لدينا ، وتبين لنا أن عدد من نقاط الاشتباك العصبي retinocollicular تشكلت في الزيادات أكيمة متفوقة من P7 لP14. للقيام بذلك ، ونحن كميا كثافة متشابك في P7 ومرة أخرى في P14. نحن صمة أكيمة متفوقة لPSD - 95 (بعد المشبكي) وVGlut2 (علامة محددة لنقاط الاشتباك العصبي قبل المشبكي RGC في أكيمة متفوقة). كانت المنطقة الخارجي متشابك من أكيمة متفوقة المصورة (الشكل رقم 4A) وكانت شاركت في كميا المترجمة VGlut2/PSD-95 نقاط الاشتباك العصبي (الشكل رقم 4B ، 4C) ما لا يقل عن 3 أقسام ولكل حيوان من الحيوانات لا يقل عن 3 في نقطة زمنية. القياس الكمي لبيانات الناتج يدل بوضوح على مدى ثلاثة أضعاف زيادة كبيرة في عدد من نقاط الاشتباك العصبي بين وP7 P14. هذه النتائج تتفق مع نتائج الدراسة التي نشرت في وقت سابق باستخدام المجهر الإلكتروني (الشكل 4D) 9.
في الختام ، وطريقة تقدير عدد المشبك وصفنا هنا هو أداة مفيدة لتحديد عدد وكثافة المشبك في الثقافة والعصبية في الأنسجة ، مما يمكننا من دراسة آثار التلاعب تشكيل المشبك في المختبر او في الجسم الحي.
الشكل 1 : تلطيخ متشابك الممثل في تنقية RGCs. (A و B) ومثقف 3 أيام في RGCs (DIV) سواء في المختبر (A) وسائط النمو القاعدية (GM) أو في (B) الموالية للsynaptogenic الماوس نجمية وسائل الإعلام مكيفة (ACM) ليوم 6 إضافية. ثم وصفت الخلايا للالباسون (قبل المشبكي ، أحمر) وهوميروس (بعد المشبكي ، والأخضر). الماوس ACM يحفز بشدة تشكيل المشبك بين RGCs وفقا لما يحدده زيادة في عدد المشاركين المموضع الباسون ، ونقاط وهوميروس. (C و D) كانوا transfected RGCs 5DIV مع البلازميد overexpress الوحيدات لقناة الكالسيوم α2δ - 1. وقد تم تحديد الخلايا Transfected مع ملء الخلية tdTomato (الأزرق) ، وكانت ملطخة synapsin للعلامة قبل المشبكي وبعد المشبكي هوميروس علامة. تشير الأسهم نقاط الاشتباك العصبي. شريط الحجم يمثل 20 ميكرون.
الشكل 2 : الكمي لعدد المشبك باستخدام نقاط ومحلل المبين هنا هو مثال (أ) ملون صورة الأصلي لتنقية خلايا الشبكية العقدة overexpressing مستقبلات thrombospondin في α2δ - 1 وsynapsin علامة قبل المشبكي وبعد المشبكي هوميروس علامة. (ب) الصور المقابلة لخلق أقنعة في كل قناة في نقاط وعند تحليل نقاط ومحلل. (ج) نقاط وAnalzyer خلق صورة واحدة مثل التي تظهر هنا يشار إلى نقاط وبنقاط سوداء صغيرة (الشكل). كما SHOسفل هو (د) الإخراج العددية للتطبيق حيث يتم توفير عدد نقاط وجنبا إلى جنب مع العديد من المعالم الأخرى في شكل نصية / رقمية (نص جريء وأضاف للتأكيد).
الشكل 3 : نتيجة الممثل للمقايسة المشبك يظهر هنا هو تأثير synaptogenic من العلاج المزمن مع RGCs نجمية مكيفة وسائل الاعلام (ACM) في التعبير عن RGCs transfected إما ناقلات فارغة (pcDNA3.1 والحانات الرمادي) أو مستقبلات thrombospondin α2δ - 1 . أشرطة الخطأ تمثل SEM. جنرال موتورز وسائل الإعلام = النمو. ACM = (الجرذ) وسائل الاعلام Contitioned نجمية.
نحن ملون الكمي لكثافة متشابك في الماوس أكيمة متفوقة (أ) لتحديد التغييرات التنموية في عدد من نقاط الاشتباك العصبي التي أنشأها glutamatergic RGCs على أهدافها أكيمي متفوقة في الدماغ القوارض ، cryosections من مخ الفأر مع الأجسام المضادة ضد قبل المشبكي : الشكل 4. علامة VGlut2 (الأخضر) ، وعلامة بعد المشبكي ، PSD - 95 ، (الحمراء). نحن تصوير الخارجي 150 × 150 ميكرون المنطقة من أكيمة متفوقة الماوس (SC) المقابلة للمنطقة المستهدفة متشابك لRGCs باستخدام ليزر المسح المجهر مبائر. وقد جمعت ض المكدس لكل مقطع SC عن عمق مجموعه 5 ميكرومتر (15 × 0.33 ميكرومتر المقاطع البصرية). وقد تم توليد إسقاطات صورة الأقصى (خطط تنفيذ البعثات) لمجموعات من 3 أقسام متتالية البصرية خطط تنفيذ البعثات الغلة 5 / يمثل كل مقطع 1 ميكرومتر من العمق. المبينة أدناه هي MIP الممثلة المأخوذة من أكيمة متفوقة على الفأرة WT P14. يظهر علامة قبل المشبكي ، VGlut2 ، باللون الأخضر ويظهر علامة بعد المشبكي ، PSD - 95 ، باللون الأحمر. (ج) الناتج العددية التي تنتجها نقاط ومحلل. (د) من التحليل الكمي لعدد المشبك لا يقل عن 3 أجزاء للحيوان الواحد مع 3 الحيوانات في نقطة زمنية (أشرطة الخطأ تمثل SEM). شريط الحجم يمثل 50 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يستند مقايسة المشبك المذكورة أعلاه في سياق أهدافنا التجريبية ، حيث نركز بشكل كبير على توقعات مثير للRGCs ، سواء في الثقافة أو المنقى في القسم الدماغ. لقد قدمنا قائمة الأضداد مرجع الجدول الذي تعمل بشكل جيد لوضع العلامات نقاط الاشتباك العصبي مثير (الجدول 1).
ويمكن تكييف هذا الاختبار لتحديد عدد المشبك المشبك من أية مجموعة من السكان أو أي سلالة الخلايا العصبية الأخرى التي متشابك هناك علامة انتقائية قبل وبعد المشبكي. يمكن تطبيقها على سبيل المثال ، مقايسة المشبك وصفها هنا لدراسة نقاط الاشتباك العصبي GABA - ergic (مقابل glutamatergic) باستخدام علامات مناسبة قبل وبعد المشبكي 10،11.
هذا الاختبار المشبك هو أداة هامة للمختبرات التحقيق التغييرات في اتصال متشابك بين الخلايا العصبية. في حين أنه من الضروري أن تثبت نتائج هذا الفحص المجهري مع الإلكترون والكهربية ، ومع ذلك فإنه يوفر وسيلة سهلة نسبيا للرد على أسئلة هامة حول الاشارات الجزيئية التي تعدل قدرة الخلايا العصبية "لتشكل نقاط الاشتباك العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
في مختبر بن ألف Barres (جامعة ستانفورد) : نقاط والمكونات في صورة كانت مكتوبة من قبل J ارك باري (استشارات Physion العنوان الحالي) محلل
التمويل ؛
- ألفريد سلون مؤسسة P.
- ألف لاستير وجوزيف Klingenstein الصندوق ، وشركة
- مؤسسة بحوث الطبية الحيوية واسعة
- علاج لمرض هنتنغتون مبادرة ليالي
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) | Mouse | Monoclonal |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined. | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| poly-d-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| l-lysine | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24-well culture plate | Falcon BD | 35-3047 | |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | --- | |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR international | 48393241 | |
| Glass slides | VWR international | 48311-703 | |
References
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
- Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
- Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
- Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).
