Summary
Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.
Abstract
Uno degli obiettivi più importanti nel campo delle neuroscienze è quello di capire i segnali molecolari che istruire prime fasi della formazione di sinapsi. Come tale, è diventato imperativo per sviluppare approcci obiettivo di quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. A partire dalla fissazione del campione, il presente protocollo come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori. Il numero di questi colocalizations è quantificati tramite un plug-in puncta Analyzer (scritto da Bary Wark, disponibile su richiesta, c.eroglu cellbio.duke.edu @) sotto la piattaforma software di analisi ImageJ. Il dosaggio sinapsi descritte in questo protocollo può essere applicato a qualsiasi preparazione del tessuto neurale o della cultura per cui si è selettivo marcatori pre-e post-sinaptici. Questo test sinapsi è uno strumento prezioso che può essere ampiamente utilizzato nello studio dello sviluppo sinaptico.
Protocol
Soluzioni da preparare:
- Anticorpi buffer:
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat. No:. BP152-5, 50 mm) - 1,21 g
- BSA 1% (Sigma, Cat. No:. A2153, 1%) - 2,0 g
- 100 mM di L-lisina (Sigma, Cat. No:. L-1137, 100 mm) - 3,65 g
- Regolare il pH a 7,4
- 0,04% azide
- Regolare il volume a 200 ml con acqua distillata H 2 O.
- Filtrare con filtro 0.22μm (Millipore, Cat. No:. SCGPU02RE).
- PFA Diluant:
- 168 ml di 0,5 M Na 2 HPO 4 (dibasico)
- 72 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 (monobasico)
- 660 ml di H 2 O distillata
- 4% PFA fissativo per i neuroni in coltura (soluzione # 2):
- 10 ml di soluzione al 16% PFA (Scienze della microscopia elettronica, Cat No:. 15.711)
- 30 ml 4% PFA diluant (soluzione # 2)
- PFA 4% in PBS:
- 4 g PFA (Electron Scienze Microscropy, Cat. No:. 19.210)
- 100 ml di PBS (Invitrogen, Cat. No:. 20012-027)
- Di calore a 40 ° C, mescolare durante la notte.
- Filtrare attraverso un filtro 0.22μm (Millipore, Cat. No:. SCGPU02RE)
- Tampone di bloccaggio (Volume totale (per il 24-pozzetti) = (# coprioggetto +1) x 200μl)
- Anticorpi tampone 50% (soluzione # 1)
- 50% di siero di capra normale (Gibco, Cat. No:. 16.210)
- 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics GmbH, Cat. No:. 9002-93-1)
- 30% di saccarosio in PBS
- 30 g di saccarosio (MP Biomedicals, Inc., Cat. No:. 821713)
- 70 ml di PBS (Invitrogen, Cat. No:. 20012-027)
- Mescolare con un stirbar fino saccarosio è in soluzione.
- Portare il volume fino a 100 ml con PBS
- Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron (Millipore, Cat. No:. SCGPU02RE)
Preparazione delle Culture neuronale:
Il protocollo qui descritto è applicabile a qualsiasi colture primarie neuronali coltivate su vetrini coprioggetto da 12 mm di vetro (Karl Hecht, No. O, Cat. No:. 99.010) in piastre da 24 pozzetti (Falcon, 35-3047). Per esempio, nel nostro laboratorio cultura cellule gangliari della retina di ratto (RGCs) purificato da retina di ratto raccolte da P5-7 1,2 animali. Le cellule sono coltivate su vetrini vetro rivestito con poli-d-lisina (Sigma, Cat. No:. P6407) (. Cultrex, Cat. No: 3400-010-01) e mouse laminina. Utilizziamo questa preparazione cultura in un paio di modi diversi per il nostro test sinapsi. Una manipolazione che eseguiamo coinvolge RGCs coltura sia in presenza o assenza di astrociti-secreti fattori synaptogenic. In alternativa, abbiamo anche impiegare queste condizioni di trattamento diverso in esperimenti in cui RGCs sono state transfettate iperespressione di una proteina di interesse. In quest'ultimo caso, abbiamo co-trasfezione delle cellule con una etichetta della cella (es. GFP o tdTomato). Questi diversi approcci sperimentali influenzano come si effettua alcuni passaggi di un test di sinapsi, che chiariamo qui di seguito.
1. Fissaggio dissociato RGCs purificata
- Togliere terreni di coltura dal RGC contenenti pozzi e aggiungere 500 microlitri (per un piatto ben 24) 4% paraformaldeide (PFA) preriscaldata a 37 ° C in ciascun pozzetto. Consentono alle cellule di fissare per 7 minuti a temperatura ambiente.
- Fissazione seguenti lavare le cellule 3 volte con tampone fosfato salino (PBS) (Invitrogen, Cat. No:. 20012-027). IMPORTANTE: Le cellule non devono mai essere lasciati senza liquido nei pozzetti, una volta che un buffer viene rimosso da un pozzo che deve essere tempestivamente sostituito dal buffer successivo. A questo punto, le cellule sono pronte per immunocolorazione.
2. Blocco aspecifica siti di legame RGCs
- Preparare il blocco tampone contenente 50% siero di capra normale (NGS, Gibco, Cat. No:. 16.210) e 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics GmbH, Cat. No:. 9002-93-1). Dopo aver rimosso PBS da ogni pozzetto, aggiungere 200 microlitri della tampone di bloccaggio in ogni pozzetto e bloccare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere un tampone di bloccaggio e risciacquare 3 volte con PBS.
3. Applicando Soluzione anticorpo primario
- IMPORTANTE: Assicuratevi di scegliere gli anticorpi primari per i marcatori pre e post-sinaptici che sono ottenuti da specie diverse.
- Preparare una diluizione degli anticorpi nel buffer di anticorpi 90%, soluzione al 10% NGS contiene la coppia di anticorpi pre e post-sinaptici di vostra scelta. Per esempio coniglio anti-synappeccato (marcatore presinaptico) (1:750, dominio citosolico, Sistemi Synaptic) e mouse anti-Omero (marcatore postsinaptica) (1:500, mouse, Sistemi Synaptic). IMPORTANTE: Centrifuga diluizione degli anticorpi per 5 minuti alla massima velocità in una centrifuga da banco per rimuovere ogni anticorpo precipitato.
- Aggiungere 200 ul di soluzione dell'anticorpo primario in ciascun pozzetto.
- Incubare per una notte a 4 ° C. La piastra deve essere posto in un contenitore più grande che viene umidificata per evitare l'essiccazione della soluzione primaria. BREAK POINT: Le cellule possono rimanere in miscela anticorpo primario per un massimo di 3 giorni prima di continuare con il protocollo.
- Il giorno seguente, rimuovere l'anticorpo primario di ogni bene e lavare i pozzetti tre volte con PBS.
4. L'applicazione di soluzione secondaria di anticorpi
- Preparare una soluzione di anticorpo secondario contenente il tuo anticorpi secondari diluiti 1:1000 in tampone contenente il 10% anticorpi NGS. IMPORTANTE: Centrifuga di diluizione secondaria anticorpi per 5 minuti alla massima velocità in una centrifuga da banco per rimuovere anticorpi precipitato. Saltare questo passo i risultati in alto sfondo anticorpo secondario.
Cellule Untransfected: In assenza di una etichetta cella, utilizzare Alexa-594 e Alexa-488 secondari coniugati per l'etichettatura marcatori pre e post-sinaptici, rispettivamente. Per esempio usiamo capra anti-coniglio Alexa594 per etichettare il anti-sinapsina anticorpi e di capra anti topo Alexa-488 secondario coniugato con l'etichetta anti-homer anticorpi. IMPORTANTE: Utilizzare Alexa-488 per gli anticorpi secondari coniugati primaria con segnale debole.
Cellule transfettate: Scegli anticorpi secondari che ospitano l'eccitazione-emissione spettro della vostra etichetta della cella fluorescenti. Per esempio, quando si etichetta cellule transfettate con tdTomato usiamo Alexa-647 coniugato capra anti-coniglio di riconoscere l'anticorpo anti-sinapsina e Alexa-488 capra coniugato anti-topo di riconoscere l'anticorpo anti-homer. Inoltre, l'utilizzo di NGS in questo protocollo è il risultato della nostra scelta di anticorpi secondari prodotti in capra. - Aggiungere 200 ul di soluzione di anticorpi secondari in ciascun pozzetto.
- Dopo l'incubazione per due ore a temperatura ambiente in un ambiente buio, lavare 3 o 4 volte con PBS.
5. Coprivetrini montaggio
- Coprioggetto montare in Vectashield montaggio di medie dimensioni con DAPI (Vector Laboratories Inc., Cat. N:. H-1200) su vetrini (VWR scientifica, Cat. No:. 48311-703).
- Applicare delicatamente smalto trasparente per unghie intorno ai bordi del vetrino e lasciare asciugare per almeno 30 minuti in un luogo asciutto e buio. IMPORTANTE: Evitare spingendo o in movimento i coprioggetti durante l'applicazione del smalto poiché questo comporterebbe Sheering delle cellule.
6. Imaging
Per l'imaging, un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera capace di scattare foto a 4 canali diversi è necessario essere in grado di immagine sia marcatori sinaptica, il tuo cellulare riempimento e nuclei (DAPI / opzionale). Le cellule devono essere ripreso con un obiettivo ad immersione olio 63x. Noi immagine utilizzando il microscopio a fluorescenza Zeiss AxioImager con la Zeiss Plan-Apochromat 63x/1.4 DIC Olio ∞ / 0,17 oggettiva.
- Selezionare le celle che sono almeno due diametri cellulari lontano dalle loro vicini più prossimi. Al fine di evitare pregiudizi e garantire casualità della selezione cella se visualizzare le cellule untransfected, selezionare le celle nel canale DAPI, poi prendere le immagini in tutti i canali. Se visualizzare le cellule transfettate selezionare le celle nel canale corrispondente all'etichetta fluorescenti per identificare le cellule transfettate (ad esempio tdTomato).
- Acquisire le immagini:
Cellule Untransfected: per ogni cella selezionata, ottenere 8 immagini bit nella GFP e Texas canali Rosso. L'immagine sovrapposta pseudocolored dovrebbe avere i marcatori pre-e post-sinaptici in rosso e verde, rispettivamente.
Cellule transfettate: per ogni cella selezionata ottenere 8 immagini bit nella GFP, Texas Red e Cy5 (o Cy5.5) canali. L'immagine sovrapposta pseudocolored dovrebbe avere i marcatori pre-e post-sinaptici in rosso e verde, rispettivamente. Colore pseudo tuo cellulare compilare in blu.
7. Analisi dell'immagine e Co-localizzato Quantificazione puncta
- Noi usiamo programma Analyzer puncta per la quantificazione co-localizzate puncta sinaptica. Puncta spina nel Analyzer è stato scritto da Bary Wark, ed è disponibile su richiesta (c.eroglu cellbio.duke.edu @). Puncta Analyzer viene eseguito in ImageJ 1.26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/, versioni più recenti di ImageJ non può eseguire l'applicazione). Per installare puncta Analyzer è sufficiente posizionare la cartella applicazione scaricata nella cartella "Plugin" nella directory 1,26 ImageJ.
- Aprire una delle immagini usando ImageJ. Utilizzare uno degli strumenti di selezione del ImagEJ menu per determinare la regione di interesse (ROI). Abbiamo regolarmente utilizzare lo strumento circolare di selezione per selezionare una regione circa un diametro di cellule radialmente attorno al soma di interesse.
- Con la vostra regione di interesse (ROI) selezionate, andare nel menu plugin e selezionare "puncta Analyzer".
- In "Analisi Opzioni" finestra che appare, selezionare "canale rosso", "canale verde", il primo "Sfondo Sottrarre" e "file Set risultati ...." Fare clic su "OK". Vi verrà chiesto di definire un percorso per salvare i risultati in questi risultati possono essere esportati in Excel per ulteriori analisi.
- Nella finestra che appare accanto, assicurarsi che il raggio di palla che rotola su 50 è selezionata e deselezionare la casella "sfondo bianco" opzione (questa modifica non è necessario ma è spesso preferito dagli utenti della richiesta di facilità di visualizzazione). Fare clic su "OK".
- Una nuova finestra apparirà accanto una maschera con l'immagine corrispondente canale rosso. Regolare la soglia fino a sentire che la maschera rossa corrisponde al meglio per il maggior numero puncta discrete individuali senza introdurre troppo rumore. Questo è uno dei passi più soggettivo di questo protocollo, quindi fare attenzione a sviluppare un approccio coerente. Fare clic su "Fine". Imposta la dimensione minima puncta a 4 pixel e modificare nient'altro. Fare clic su "OK".
- Ripetere il passaggio precedente, questa volta per il canale verde.
- Una volta completato il passaggio precedente, il plugin fornirà quantificazione corrispondente a puncta in ciascun canale separatamente e per puncta colocalized tra i due canali.
BRAIN SEZIONI:
Il test sinapsi può essere applicato a criosezioni dal cervello, di qualsiasi altro tessuto del sistema nervoso (come ad esempio midollo spinale o della retina), condizione che vi sia una coppia adatta marcatore pre-e post-sinaptici (con anticorpi che funzionano bene in sezioni) che possono essere utilizzato per identificare le sinapsi che si desidera quantificare. Il test sinapsi può rivelare la regolazione temporale della formazione di sinapsi in una determinata regione del cervello e in grado di quantificare gli effetti sulla connettività sinaptica in animali transgenici o in un campione che è stato manipolato in qualche altro modo.
1. Raccolta di tessuto cerebrale di topi
Tutte le procedure di animali deve essere fatto in accordo con i protocolli di animali IACUC.
- Euthanize topi per dissanguamento e perfusione con PBS. Perfusione con PBS è cruciale per la rimozione di sangue e di ridurre il segnale di fondo per le procedure di colorazione. IMPORTANTE: Non profumato con fissativi come ad esempio il 4% PFA. Ciò influenzerà negativamente i risultati della colorazione.
2. Fissazione
- Fissare l'intero cervello in PFA 4% in PBS a 4 ° C durante la notte. Il giorno dopo sciacquare il cervello 3 volte con PBS.
- Cryoprotect il cervello mettendoli in 30% di saccarosio in PBS. Il tessuto inizialmente galleggiante. Conservare a 4 ° C fino a quando il tessuto scende sul fondo. In questa fase il crioprotezione è completa.
3. Incorporare / criosezionamento
- Incorpora il cervello a orientamento desiderato per il sezionamento (ad esempio sagittale e coronale) in una soluzione 2:01 del 30% saccarosio: (. Tissue-Tek, Cat No: 4583) ottobre in PBS. Congelare il cervello incorporato su una superficie piana di ghiaccio secco. Congelato il cervello incorporati possono essere inseriti in sacchetti e conservati a -80 fino a un anno prima di sezionamento.
- Cryosection il tessuto in 12-16μm sezioni e il montaggio su vetrini (Sigma, Cat. No:. S4651). Le diapositive possono essere conservati fino a una settimana a -80 ° C prima della colorazione.
- Vetrini da colorare devono essere essiccati a 37 ° C per 30 minuti e risciacquate con PBS 1x per rimuovere residui di ottobre.
4. Sezioni blocco
- Blocca sezioni in siero di capra normale 20% (NGS) in PBS per un'ora a temperatura ambiente. IMPORTANTE: Non sono Triton X-100 in questa fase. Prima dell'aggiunta della soluzione di blocco, è possibile creare una barriera idrofobica intorno le sezioni nella diapositiva, usando la penna Elite PAP (DBS, Cat. No:. K039)
5. L'applicazione di anticorpi primari
- Diluire il tuo anticorpi primari in PBS con 0,3% Triton e il 10% NGS.
- Nelle sezioni del cervello usiamo PSD-95 (Zymed, Coniglio, 1:500) di etichettare glutammatergica comparti postsinaptico e VGlut1 o VGlut2 (Chemicon, cavia, 1:2500) di etichettare glutamatergica terminali presinaptici. Centrifuga prima diluizione degli anticorpi per 5 minuti alla massima velocità in una centrifuga da banco per rimuovere l'anticorpo precipitato se presente.
- Sezioni incubare in una soluzione dell'anticorpo primario per 36-60 ore a 4 ° C.
6. L'applicazione di anticorpi secondari
- Lavare l'anticorpo primario fuori immergendo i vetrini 3 volte in PBS per 15 minuti ciascuno. Dopo questo passo assicurarsi di proteggere le diapositive dalla luce diretta.
- Diluireanticorpi secondari alla diluizione di 1:200 nel buffer stesso come descritto per anticorpi primari. Ad esempio per VGlut/PSD95 colorazione usiamo capra anti cavia Alexa 488 (Vglut) e di capra anti coniglio Alexa 594 (PSD-95) (Invitrogen).
- Incubare le sezioni in soluzione di anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente al buio.
- Lavare gli anticorpi non legati secondario le diapositive immergendo i vetrini 4x in PBS per 15 minuti ciascuno.
7. Montaggio
- Aggiungere piccole gocce di Vectashield montaggio media con DAPI (Vector Laboratories Inc.) su vetrini (VWR scientifico) e quindi coprire i vetrini con coprioggetti (VWR Scientific, n. 1.5, 48393 241). Applicare lo smalto per inibire il movimento del coprioggetto.
8. Imaging
IMPORTANTE: Un microscopio confocale con almeno 3 canali è necessario per l'imaging descritti qui. Noi immagine su un SP5 Leica laser-scanning microscopio confocale utilizzando un obiettivo 63x immersione in olio.
- Regioni cerebrali Synaptic di interessi devono essere selezionati per la scansione in modo coerente tra le sezioni. Per esempio, nel nostro test sinapsi di sinapsi delle cellule gangliari della retina su neuroni collicular superiore, abbiamo l'immagine della regione esterna collicular superiore adiacente al collicolo inferiore, che comprende lo strato che riceve i terminali sinaptici retinocollicular 7,8,9. Noi immagine e quantificare le sinapsi in alto a 150 micron zona sinaptica del collicolo superiore, dove sono noti RGCs per stabilire contatti sinaptici 9.
- Per ogni sezione, sia la 488 e 594 canali, abbiamo sezioni dell'immagine seriale ottica a intervalli di 0,33 micron su una profondità totale di 5 micron per un totale di 15 sezioni ottiche. Almeno 3 sezioni per ogni animale deve essere ripreso e almeno 3 animali devono essere inclusi da una data condizione sperimentale.
- Proiezioni di massima intensità (MIP) sono generati da gruppi di 3 sezioni consecutive cedendo 5 MIP rappresentano 1μm di profondità ciascuno. Queste MIP sono quantificati.
9. Quantificazione immagine
- Possono essere eseguite esattamente come descritto per RGCs, tuttavia la forma e le dimensioni del ROI cambierà in funzione di quale regione delle immagini che si desidera quantificare.
Chiavi del successo:
Purificata RGCs:
- Prima di fissare RGCs purificato (o altri cultura dissociato) assicurarsi di pre-riscaldare il 4% PFA a bagnomaria insieme a 37 ° C per 20-25 minuti ~ (conservare a 4 ° C in tutti gli altri, non usare diluizioni PFA età superiore ai 7 giorni).
- In particolare per i neuroni in coltura, si consiglia di non utilizzare un aspiratore a vuoto durante i lavaggi di tutti i passaggi di risciacquo. Dolce metodi come l'utilizzo di una pipetta Pasteur e un bulbo di aspirazione migliorare notevolmente la qualità della colorazione.
- Fare attenzione a non lasciare che le tue cellule asciugarsi durante il risciacquo passi.
- Evitare nudging o al movimento del coprioggetto durante l'applicazione di smalto in quanto ciò potrebbe comportare tosatura delle cellule sul vetrino.
- Spin down tutti gli anticorpi primari e secondari per eliminare eventuali anticorpi precipitato che un impatto negativo sulla colorazione.
- Assicurarsi di selezionare gli anticorpi primari per i marcatori di pre-e post-sinaptici cresciuto a specie diverse. In caso contrario si eliminerà la vostra capacità di discriminare tra i due segnali dopo l'applicazione di anticorpi secondari.
Cervello sezioni:
- Non profumato il vostro mouse con fissativi come il PFA.
- Non includere Triton-X 100 nella soluzione di bloccaggio per le sezioni del cervello. In questo modo danneggia la qualità della colorazione per i marcatori presinaptico, i marcatori particolarmente presinaptici che sono associati con vescicole sinaptiche.
- L'uso di un microscopio confocale per l'imaging è necessario per l'acquisizione di immagini che è di buona qualità sufficiente per eseguire un'analisi sinapsi.
Rappresentante dei risultati:
Il test sinapsi di cui sopra è stato progettato per catturare modifiche della connettività sinaptica in vitro e in vivo. Nel nostro laboratorio, utilizziamo il test sinapsi per determinare l'effetto delle due molecole singole o multiple astrociti-secreto sulla formazione di sinapsi. Noi comunemente eseguire questo test sinapsi su RGCs purificata che la cultura in vitro.
Un effetto ben descritto di applicazione cronica di astrociti condizionata media (ACM) in purificato culture RGC è un multiplo volte aumento del numero di sinapsi che si formano tra RGCs 3,4,5,6. Figure 1A e 1B mostrano immagini rappresentative di untransfected RGCs purificate trattati con terreni di coltura basale o con ACM. Dopo la colorazione per eccitatori marcatori pre e post-sinaptici, l'ACM aumento indotto in sformazione ynapse è qualitativamente evidente (Figura 1A, 1B). Infatti, questa scoperta è stata confermata da diversi studi che hanno utilizzato elettrofisiologia per dimostrare che ACM-indotta sinapsi sono funzionali e microscopia elettronica per dimostrare che le sinapsi sono ultrastrutturale normale 3,4,6. Altri lavori nel nostro laboratorio ha identificato le subunità del canale del calcio α2δ-1 come il recettore neuronale per una molecola fortemente synaptogenic astrociti-secreto, trombospondina 3. Qui ci sono i risultati di un esperimento in purificato RGCs che è stato eseguito per determinare se i livelli aumentati di α2δ-1 migliora ulteriormente ACM indotto la formazione di sinapsi (figura 3).
RGCs erano cotransfected sia con un vettore vuoto o con una codifica costruire α2δ-1 con una costruzione separata codifica tdTomato dopo 5 giorni in vitro (DIV5). In seguito a trattamento cronico con o ACM o GM, RGCs erano fissate e colorate su DIV 11. Immunomarcatura seguito dei marcatori pre e postsinaptica delle sinapsi eccitatorie che vediamo un aumento qualitativamente evidente nel numero di sinapsi in purificato RGCs che ha espresso un vettore vuoto (pcDNA3.1) o α2δ-1 (Fig. 1C, 1D). Noi quantificare l'effetto synaptogenic di ACM utilizzando puncta analizzatore di contare il numero delle sinapsi (Fig. 2) per almeno 15 i neuroni di ogni condizione. Un campione di queste dimensioni ci permette di calcolare il numero medio di sinapsi per neurone e trovare una differenza statisticamente significativa, circa 10 volte maggiore sinapsi formate da ACM trattati con i neuroni che esprimono un vettore vuoto (Figura 3, barre grigie). Inoltre, abbiamo dimostrato che l'iperespressione di α2δ-1 porta ad un potenziamento significativo della ACM indotta formazione di sinapsi (~ 20 volte. Fig. 3, barre nere).
Oltre ai neuroni colti, siamo in grado di quantificare la densità sinaptica in diverse regioni del cervello utilizzando questa tecnica. Il collicolo superiore è una struttura del cervello che riceve proiezioni retinocollicular, provenienti da RGCs nella retina 7,8,9. Nel corso dello sviluppo postnatale, il numero di sinapsi eccitatorie formata da RGCs sui loro obiettivi nel collicolo superiore aumenta notevolmente da P7 P21 a 7,8,9.
Utilizzando la nostra tecnica di quantificazione, ci mostrano che il numero di sinapsi retinocollicular formata nel aumenta collicolo superiore da P7 a P14. Per fare questo, abbiamo quantificato densità sinaptica a P7 e di nuovo a P14. Noi macchiare il collicolo superiore per PSD-95 (postsinaptico) e per VGlut2 (marcatore specifico per presinaptica sinapsi RGC nel collicolo superiore). La regione esterna sinaptica del collicolo superiore è stato ripreso (Fig. 4A) e co-localizzati VGlut2/PSD-95 sinapsi sono stati quantificati (Fig. 4B, 4C) di almeno 3 sezioni per ogni animale e di almeno 3 animali per punto temporale. Quantificazione dei dati risultanti dimostrano chiaramente un over triplice aumento significativo del numero di sinapsi tra P7 e P14. Questi risultati sono in accordo con i risultati precedentemente pubblicato utilizzando la microscopia elettronica (Fig. 4D) 9.
In conclusione, il metodo di quantificazione numero di sinapsi che descriviamo qui è uno strumento utile per determinare il numero delle sinapsi e la densità nella cultura e nei tessuti neurali, che ci permette di studiare gli effetti di manipolare la formazione di sinapsi in vitro o in vivo.
Figura 1: Rappresentante colorazione sinaptica in purificato RGCs. (A e B) 3 giorni in vitro (DIV) RGCs sono state coltivate sia in (A) terreni di coltura basale (GM) o in (B) pro-synaptogenic del mouse multimediali astrociti condizionata (ACM) per altri 6 giorni. Le cellule sono state poi etichettati per fagotto (presinaptico, rosso) e homer (postsinaptici, verde). Topo ACM stimola fortemente la formazione di sinapsi tra RGCs come determinato dalla crescita del numero di co-localizzati fagotto e homer puncta. (C e D) RGCs 5DIV sono state transfettate con un plasmide di iperespressione della subunità del canale del calcio α2δ-1. Cellule transfettate sono stati identificati con un riempimento delle cellule tdTomato (blu) e sono stati colorati per sinapsina marcatore presinaptica e postsinaptica homer marcatore. Le frecce indicano le sinapsi. Barra di scala rappresenta il 20 micron.
Figura 2:. Quantificazione del numero di sinapsi con puncta Analyzer Qui viene mostrato un esempio di (a) l'immagine originale di una purificazione delle cellule gangliari retiniche iperespressione del recettore trombospondina α2δ-1 ed è macchiato per sinapsina marcatore presinaptica e postsinaptica homer marcatore. (B) Le immagini corrispondenti alle maschere create in ogni canale quando si analizzano puncta in puncta Analyzer. (C) puncta Analzyer verrà creata un'immagine come quella mostrata qui puncta in cui sono indicate da piccoli punti neri (nel riquadro). Anche shown è (d) l'uscita numerica l'applicazione in cui vengono forniti il numero puncta insieme a diversi altri parametri in forma testuale / numerico (grassetto aggiunto per enfasi).
Figura 3:. Risultato Rappresentante per il saggio di sinapsi mostrato qui è l'effetto synaptogenic di trattamento cronico con RGCs astrociti condizionata media (ACM) in RGCs trasfettate che ha espresso vettore vuoto (pcDNA3.1, barre grigie) o del recettore trombospondina α2δ-1 . Barre di errore rappresentano la SEM. GM = crescita Media. ACM = (Rat) Media astrociti Contitioned.
Figura 4:. Quantificazione della densità sinaptica nel topo collicolo superiore (a) Per determinare i cambiamenti evolutivi del numero di sinapsi glutammatergica stabilito dalla RGCs sui suoi obiettivi collicular superiore nel cervello di roditori, abbiamo macchiato criosezioni dal cervello di topo con gli anticorpi contro il presinaptico marker VGlut2 (verde) e il marcatore postsinaptici, PSD-95, (rosso). Abbiamo ripreso l'esterno 150 x 150 micron regione del collicolo superiore del mouse (SC), corrispondente alla regione bersaglio sinaptica per RGCs utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. A z-stack per ogni sezione SC sono stati raccolti per una profondità totale di 5 micron (15 x 0,33 micron sezioni ottico). Proiezioni di immagini massima (MIP) sono state generate per gruppi di 3 sezioni consecutive ottica cedendo 5 MIP / sezione ognuno dei quali rappresenta 1 micron di profondità. Qui sotto è un prezzo minimo all'importazione rappresentative tratte dalla collicolo superiore del mouse P14 WT. Il marcatore presinaptico, VGlut2, è mostrato in verde e il marcatore postsinaptici, PSD-95, è mostrato in rosso. (C) Uscita numerica prodotta da Analyzer puncta. (D) Quantificazione delle analisi del numero di sinapsi per almeno 3 sezioni per ogni animale con 3 animali per punto temporale (le barre di errore rappresentano SEM). Barra di scala rappresenta 50 micron.
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Discussion
Il test sinapsi di cui sopra si basa nel contesto dei nostri obiettivi sperimentali, in cui ci si concentra in gran parte su proiezioni eccitatori di RGCs, sia in purificati cultura o nella sezione del cervello. Abbiamo fornito una tabella che elenca gli anticorpi di riferimento che funzionano bene per l'etichettatura sinapsi eccitatorie (Tabella 1).
Questo test sinapsi può essere adattata a quantificare il numero delle sinapsi neuronali di ogni popolazione o di qualsiasi altro sottotipo sinaptica per il quale esiste un marker selettivo pre-e post-sinaptici. Ad esempio, il saggio sinapsi qui descritti possono essere applicati allo studio delle sinapsi GABA-Ergic (al contrario di glutammatergica) utilizzando appropriati indicatori di pre-e post-sinaptici 10,11.
Questo test sinapsi è uno strumento importante per i laboratori indagando modifiche della connettività sinaptica tra i neuroni. Mentre è necessario per corroborare i risultati di questo test con il microscopio elettronico e elettrofisiologia, offre comunque un modo relativamente semplice per rispondere a domande importanti circa i segnali molecolari che modulano la capacità dei neuroni 'di formare sinapsi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Nel laboratorio di A. Ben Barres (Stanford University).: Puncta Plug-in per immagini è stata scritta da Barry J Wark (Consulting Physion attuale indirizzo) Analyzer
Finanziamento;
- Alfred P. Sloan Foundation
- A. Esther e Giuseppe Klingenstein Fund, Inc.
- Broad Fondazione per la Ricerca Biomedica
- Cura per la malattia di Huntington iniziativa s
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) | Mouse | Monoclonal |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined. | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| poly-d-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| l-lysine | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24-well culture plate | Falcon BD | 35-3047 | |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | --- | |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR international | 48393241 | |
| Glass slides | VWR international | 48311-703 | |
References
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- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
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- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
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