Agar-Block microcosmes pour la décomposition des tissus végétaux contrôlés par des champignons aérobie

Summary

Cette vidéo montre une approche pour étudier l'environnement contrôlé de dégradation des tissus des plantes lignocellulosiques par des champignons aérobies. La capacité de contrôler les sources de nutriments et d'humidité est un des principaux avantages de l'agar-bloc de microcosmes, mais l'approche donne souvent des résultats mitigés. Nous abordons les pièges critique pour le rendement reproductible, de faible variabilité des résultats.

Abstract

Les deux principales méthodes pour étudier la biodégradation fongique des tissus des plantes lignocellulosiques ont été développés pour les tests de préservation du bois (sol-bloc; agar-bloc). Il est bien admis que le sol du bloc des microcosmes de rendement des taux de décomposition plus élevé, les problèmes d'humidité moins, plus faible variabilité entre les études, et des seuils plus élevés de toxicité conservateur. Sol-bloc de test est donc la technique la plus utilisée et a été normalisé par l'American Society for Testing and Materials (ASTM) (méthode D 1413 à 1407). La conception du sol du bloc présente des inconvénients, cependant, en utilisant des sources du sol localement variable et à limiter le contrôle des nutriments externes (exogènes) pour les tissus en décomposition. Ces inconvénients sont apparus comme un problème dans l'application de cette méthode à d'autres, vise la recherche de plus en plus populaire. Ces objectifs comprennent modernes lignocellulosiques dégradant pour la recherche en bioénergie, des essais de bioremédiation des co-produits toxiques métabolisés, d'évaluer les mécanismes oxydatifs et le suivi des éléments transloqué le long des réseaux hyphes. Blocs de terre ne se prêtent pas suffisamment de contrôle dans ces applications. Un raffinement agar-bloc de l'approche est nécessaire.

Ici, nous utilisons la pourriture brune bois dégradants champignon Serpula lacrymans à dégrader le bois dans de l'agar-bloc de microcosmes, en utilisant des boîtes de Petri avec profondeur faible de calcium agar. Nous testons le rôle de facteurs exogènes sur la décomposition du gypse dans une série chronologique, afin de démontrer l'utilité et la variabilité attendue. Blocs d'un seul RIP bord (coupe longitudinale) sont conditionnés, pesé, autoclavés, et introduit aseptiquement sommet treillis de plastique. Inoculations fongiques sont à chaque face du bloc, avec le gypse exogènes ajoutés aux interfaces. Les récoltes sont aseptiques jusqu'à la récolte finale destructrice. Ces microcosmes sont conçus pour éviter tout contact avec des blocs d'agar ou les murs boîte de Pétri. La condensation est minimisée lors de la plaque se déverse et pendant l'incubation. Enfin, l'inoculum / plâtre / bois espacement est réduit au minimum, mais sans permettre de contact. Ces aspects moins techniques d'agar-bloc de la conception sont également les causes les plus fréquentes de l'échec et la principale source de variabilité entre les études. Publication de la vidéo est donc utile dans ce cas, et nous montrer faible variabilité, résultats de haute qualité.

Protocol

Ce protocole s'applique aux substrats ligneuses et non ligneuses, comme il est indiqué, ainsi que du matériel au four ou séché à l'air. Lisez le premier protocole, cependant, avant de set-up. Il ya plusieurs points soulevés qui peuvent s'appliquer à votre étude, et ces points (souligné) nécessitent une planification. Notez également qu'il ya deux publié agar-bloc de méthodes qui sont parfois utilisés, l'un des British Standard 838 et une autre suite d'un Groupe international de recherche sur la protection du bois (IRG-WP) document présenté par la bravoure (1978). Notre méthode ressemble à 838, avec les adaptations principalement dans la conception microcosme et le contrôle de la gélose, mais là encore, les deux approches sont souvent évités en raison de problèmes historiques contrôle de l'humidité dans les blocs de bois, provoquant l'anoxie et la variabilité. Une bonne critique de ces méthodes de test qui comprend des discussions sur l'agar-bloc de dessins, y compris la norme 838, peut être trouvée dans Nicholas (1973).

1) Préparation de microcosmes

Microcosmes pour ces essais sont 1 cm plus haute (plus profond) que des boîtes de Petri typiques, ce qui augmente l'espace de tête au-dessus des blocs de bois. Ils sont remplis avec un montant modeste et exact de la gélose, afin de contrôler absolue quantités d'éléments nutritifs, en plus de leur concentration, et de garder les blocs de bois bien loin (> 3 mm) du couvercle. L'agar utilisé dans ce cas des tests de gypse est un type de calcium faible Une gélose; cependant, nous montrons des résultats représentatifs en utilisant le milieu Blakeslee, la moyenne ATCC recommandée pour le maintien de l'épreuve d'isoler des Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) Schroeter souche APEM 65 ( ATCC 32750).

Cette conception empêche les tissus végétaux loin de gélose de contact et à l'abri du couvercle plat et les murs. Mouillage variable des substrats lignocellulosiques est la principale source de variabilité dans l'agar-bloc de tests. Mouillage pour augmenter la teneur en humidité crée une anoxie et supprime ou même s'arrête aérobie biodégradation. Il crée également un problème pour quiconque étudie les mécanismes d'oxydation des champignons de la pourriture brune et blanche responsables de la décomposition du bois. La condensation sur les couvercles plaque est un problème si des gouttelettes d'eau sous forme libre et mouiller le substrat. De même, le bois et autres tissus seront «mèche» de l'eau rapidement à partir de la gélose au contact, conduisant à des teneurs en eau supérieures à 80% (en poids sec. Base) et l'arrêt de la dégradation aérobie. Les tissus doivent être éloignés de ces sources d'eau, permettant au champignon filamenteux à trouver, se connecter et contrôler l'humidité dans le substrat.

1. Faire suffisamment de gélose pour remplir le nombre souhaité de boîtes de Pétri avec 20 ml d'agar, chacun d'eux. Nous utilisons cinq répétitions (n ​​= 5) par traitement, déterminée par analyse de puissance en utilisant des résultats passés.
2. Pour en calcium et en fer-libres de type A agar, nous ajoutons 15 g d'agar dans une fiole de 500 ml contenant environ 400 ml d'eau déminéralisée modifié avec 1,0 g de NH ₄ NO _3, 1,0 g monobasique KH ₂ PO _4, 0,25 g MgSO ₄ x 7H ₂ O et 1,0 g de glucose. Pour le mélange, on utilise des solutions mères d'ajouter des micronutriments. Nous ajoutons 50 ul chacun de H ₃ BO ₄ (0,057 g / 100 ml) et ZnSO ₄ (0,031 g / 100 ml). Nous ajoutons 50 ul chacun de _MnCl2 (0,036 g / 100 ml), CuSO ₄ (0,039 g / 100 ml), et (NH _{4) 6} Mo ₇ O ₂₄ (0,018 g / 100 ml). Une fois que les nutriments sont ajoutés, remplir la fiole jaugée à la ligne de 500 ml.
3. Un ajout de calcium habituellement dans ce cas serait de 0,05 _g de CaCl2 x _{2 H 2} O / 500 ml. Dans notre cas, nous utilisons le calcium agar comme un traitement, avec une concentration de 5 mM final. Nous contrer l'augmentation en plus de force et chlorure ionique en ajoutant 5 mM de NaCl pour les microcosmes d'autres. De même, nous utilisons sans fer médias pour cette manifestation, mais dans le cas où le fer est inclus, on mélange 0,112 g de FeSO ₄ avec 2 ml d'eau déminéralisée et ajouter 50 ul de cette solution fraîche (pas de stock) immédiatement après vortex. Dans tous les médias où vous contrôlez les ajouts de nutriments, il est judicieux de tester le pH avant l'autoclavage. Ajouts acides ou basiques (par exemple FeCl ₃₎ aura une incidence sur la solidification.
4. Transfert des médias à un ballon et le milieu à l'autoclave à 121 ° C et 16 psi pendant 20 minutes. Nous ne dépassent pas 500 volumes ml (flacon pour 1000 ml), pour éviter d'avoir agar se solidifier avant de nous permettre de gérer l'ensemble de celui-ci sur les plaques d'essai.
   
   (Note:.. Il est sage lors de l'utilisation des médias alternatifs, en particulier avec un minimum d'agar nutritif ajouté des sels de base, d'abord vérifier que votre champignon d'essai va croître sur elle des forces ioniques élevées peut inhiber la croissance ou même tuer votre test isoler)
5. Utiliser un portable pipette d'aide et 10 ml Pipettes stériles en polystyrène pour transférer aseptiquement agar dans une enceinte de sécurité biologique, les flacons une fois froid. Laisser refroidir à toucher les médias est ici important de minimiser la condensation. En outre, la pile des plaques haute comme ils sont versés, pour minimiser l'eau libre sur les couvercles. Alors que la condensation est une nuisance dans la culture de la normale, il représente ici un problème majeur si DROsous forme Plets et mouiller le bois. La teneur en humidité (MC) de plus de 80% (en poids sec) va créer une anoxie dans les tissus, dégradation de limiter par des champignons aérobies, et d'augmenter la variabilité. Calculer MC comme suit:
   
   MC * = [(poids frais x poids sec) / poids sec] x 100
   
   * (MC peut excéder 100% - cela peut sembler une étrange façon de calculer MC, mais est standard)
   1. Microcosmes Alternative: Si les tissus végétaux sont testés, qui doit être pré-broyé et tamisé (par exemple, le maïs tiges et les feuilles de canne, ensemble), il ya deux options vaisselle que nous utilisons. Divisé boîtes de Pétri sont disponibles avec 2 ou 4 sections, et d'agar peuvent être exclus de compartiments avec de la poudre. Agar solidifié peut aussi être coupé et une partie enlevée pour laisser place à la poudre, mais des précautions doivent être prises pour maintenir les volumes de gélose égaux restants si la disponibilité des nutriments doit être contrôlée.
6. Ajouter généreusement coupées grillages en plastique à la surface de la plaque, en utilisant soigneusement lavés et autoclavés grilles ajoute aseptiquement. Nous utilisons un produit, la Garde Gutter (35 x 50 mm, 2 mm d'épaisseur), pour notre maillage, et ont utilisé la microscopie électronique pour montrer une surface propre après lavage au savon et à l'eau et de montrer un manque de pénétration des champignons. Nous avons eu un succès mitigé avec des filtres en fibre de verre et avec des blocs pose directement sur le mycélium développé, tant en raison de problèmes mèche. Vous obtiendrez la carie, mais votre coefficient de variabilité (CV) sera élevé, ce qui rend les comparaisons de traitements statistiquement faible. Nous avons utilisé des tiges de verre précédemment, mais les blocs sont susceptibles de glisser hors de tiges lors bousculés, laissant les blocs en contact avec l'agar. Une bonne alternative consiste à découper des cercles complets pour répondre aux plaques, découpe un bord au large pour accueillir l'inoculum. En général, couper les grilles pour s'adapter à votre propre set-up, mais assurez-ils pondent complètement à plat dans les boîtes de Pétri.

2) Préparation de substrats 'Block'

Ces protocoles ont été développés pour le bois massif, mais sont adaptables pour d'autres tissus végétaux. La perte de masse est la mesure standard pour le progrès pourriture dans le bois dégradé par des champignons filamenteux. Ainsi, notre approche utilise anhydre poids pré-et post-carie pour déterminer la perte de masse. Toutefois, pour toute recherche sur la bioénergie, où l'accent est mis sur la chimie des tissus végétaux, beaucoup trouvent que l'air de séchage des tissus est préférable. Nous montrons ici des protocoles pour la préparation de votre agar-bloc de cultures à utiliser séché au four matériau de départ, mais donner l'information alternative à l'air sec et aussi à traiter la poudre au lieu de substrats solides.

1. Pour cette démonstration, nous utilisons le pin des marais (SYP). SYP est un bois disponibles dans le commerce représente la grande majorité du bois utilisé dans le logement résidentiel aux Etats-Unis Il peut être l'une des quatre espèces de Pinus. Non-bois traité est utilisé et sans noeud blocs sont découpés à partir d'un seul RIP (coupe longitudinale) le long du grain (19 x 19 mm). Ceci minimise la variabilité chimiques dans le bois. Cette longueur est coupée en 19 mm ³ blocs. Nous utilisons cette taille pour le sol du bloc d'essais, et coupé de nombreux blocs en une seule session sur le banc de scie.
2. Le 19 mm ³ blocs pour être utilisés dans l'agar-bloc de microcosmes se subdivisent en deux le long du grain, en utilisant un burin et un marteau, pas une scie. Cela fait un bord bloc brut pour faire face vers le bas sur la maille en plastique, et un bord lisse supérieure à l'étiquette. Blocs étiquette avec un crayon. Si vous ne pouvez pas l'étiquette de votre substrats, assurez-vous de concevoir un système pour suivre les échantillons. Couper les blocs de quoi satisfaire vos traitements (à nouveau, nous utilisons n = 5 par traitement), ainsi que témoins non inoculés qui servira à la fois comme des moniteurs de contamination et que des échantillons de données de référence, conditionnés en parallèle.
3. Pour séché au four du matériel, des échantillons dans un four à convection à 100 ° C pendant 48 heures. Si séché à l'air du matériel est nécessaire, l'état des échantillons dans une chambre ou une chambre avec une humidité et température constantes. Nous utilisons 65% HR et 20 ° C, et nous comptent habituellement les 10-14 conditionné jours, selon le matériau.
4. Pré-peser vos échantillons pour déterminer initiales poids sec ou frais. Avec des échantillons du four, il suffit de transférer les échantillons dans un dessiccateur pour refroidir et les peser.
   1. Alternative séchage à l'air: Avec séché à l'air du matériel, prendre cinq échantillons (n ​​= 5; sacrificielles elles ne seront pas utilisés dans des microcosmes), peser les frais, séchés à l'étuve entre eux comme ci-dessus, et repeser après séchage. Calculer un facteur de correction d'humidité pour chacun des deux blocs comme suit:
      
      Facteur de correction MC = poids sec / poids frais
      
      Exemple: 2,46 g (à sec) / 2,68 g (frais) = 0,918; ainsi, un bloc de 3,0 g frais est de 2,75 g séché au four
      
      Moyenne des cinq échantillons pour obtenir le facteur de correction moyen. Puis, pesez tous vos séché à l'air des blocs. Multipliez chaque poids par le facteur de correction moyenne de MC pour déterminer initiales poids sec à l'étuve.
5. Autoclave des échantillons marqués à 121 ° C et 16 psi pendant 1 heure ou plus avec des échantillons plus grands. Étroitement feuille de minimiser mouillage.
   1. Alternatila stérilisation ve: Le rayonnement gamma peut être utilisé pour stériliser, si disponible. Nous avons testé l'épinette et le bois de hêtre précédemment pour les effets de la température sur la perte de l'hémicellulose, et n'en trouva pas, avec aucune perte de force ou de changer de couleur. Toutefois, cela peut varier entre substrats et de vos préférences / besoins, et le rayonnement gamma est une solution éprouvée.
6. Pour cette démonstration, nous testons le rôle de gypse solide (pur versus 1% FeSO ₄₎ sur la dégradation de nos pins (SYP) échantillons. Ces disques sont faits avec des surfaces et des volumes exacts, à nouveau pour le contrôle de leur disponibilité, en plus de leur concentration. Ce sont autoclavées séparément et ajoutée pendant l'étape de l'inoculation. Nous avons besoin d'un disque pour chaque bloc, et nous ajoutons deux blocs par boîte de Pétri pour permettre à deux récoltes.

3) Inoculation & Étiquetage

Inoculation agar-bloc de microcosmes est plus de temps que l'inoculation du sol bloc-pots. Pour nous, nous comptons sur chaque inoculation de prendre 3 min. Pour boîtes de Pétri contenant l'agar, c'est le point d'addition pour les treillis, en bois, tout en nutriments des sources exogènes (ici, des pastilles de plâtre), et le champignon. Il ya augmenté les chances de contamination en raison de la quantité de temps que le couvercle est ouvert et le nombre de visites à l'intérieur. Il ya également plusieurs erreurs clés qui sont couramment faites à ce stade, et ce sont les meilleurs couverte par le couplage vidéo avec du texte. Regardez la vidéo.

1. Dans une armoire stériles biosécurité, assembler vos plats d'agar vide, une plaque source pour votre inoculum fongique (nous utilisons deux cultures semaine), maille, substrat végétal (bois), des matériaux exogènes, un Sharpie, bandes parafilm, et des outils de transfert. Nous flammes stériliser en utilisant 70% d'éthanol, et nous utilisons un outil de transfert de l'inoculum et des pinces pour les blocs et la maille. Parafilm doit être coupé avec un rasoir pour éviter toute entailles sur les bords. Nicks de parafilm conduire à des ruptures lors de la fermeture, et ce sera bousculent échantillons et exigent la rentrée.
2. Outils de transfert de flamme ou d'une pince avant d'ajouter les éléments suivants (dans cet ordre):
   1. Treillis en plastique.
   2. Substrat du bois. Pour notre démonstration, nous allons ajouter deux blocs de bois sur toute la longueur de la maille, à la fois dans le même bloc initial qui a été scindé afin que nous puissions paire de données à partir des récoltes précoces et tardives. Ces blocs sont ajoutés côte à côte, avec la fin de céréales (bois section transversale) face au point de la source d'inoculum fongique.
   3. Matériaux exogènes. Ici, nous testons le rôle de plâtre sur la décomposition par un champignon filamenteux. Par conséquent, nous voulons que le champignon à la rencontre de ces disques de plâtre avant d'atteindre le bois, et ainsi ajouter un disque de plâtre entre chaque point de l'inoculum et de bloquer le sommet de la maille. Cela signifie l'ajout de 2 disques par microcosme. Ne pas permettre le contact entre les disques et les bois, mais les garder près.
   4. Inoculum fongique. Nous utilisons un foreur # 4 liège avec 7 mm de diamètre pour faire les bouchons de 2-semaines cultures cultivées dans 20 ml d'agar. Cela aide à contrôler le volume d'inoculum. Pour témoins non inoculés, il est préférable d'ajouter un plug partir d'une plaque stérile. En général, nous ajouter ces fiches à l'agar-agar, et non pas sur le maillage. Ne pas permettre le contact entre l'inoculum et soit les substrats exogènes ou le bois, mais là encore, placez-les serrés. Il ya une prise d'inoculum par bloc.
      
      Remarque: Il est sage d'assembler ces contenus dans un plat de gélose avant de commencer à s'assurer qu'il n'y aura au moins 3 mm d'espace de tête, qu'il y aura au moins 3 mm de distance entre les blocs de bois et les murs couvercle, et que votre filet de plastique dimensions seront facilement accueillir vos substrats.
3. Parafilm plats pour les sceller, en gardant une flamme d'alcool et de prêts avec des pinces. Tenez plaques horizontales et envelopper dans un mouvement de parafilm continue lisse. S'il ya bris de parafilm ou si le contenu se bousculent, retirez parafilm, ré-entrer et monter le contenu, et essayez de nouveau.
4. Étiqueter les couvercles plat en utilisant un marqueur résistant à l'alcool, l'étiquetage numéros de blocs directement sur le dessus de substrats respectifs. Nous avons également dessiner des cercles sur les disques de gypse. Comme bois pourrit, vous perdrez probablement la capacité de lire l'étiquetage sur les substrats. Il est important de se tenir à la position de plat. Aussi, ne pas sous-estimer la capacité d'un champignon à se dégrader ou de coloniser myriade d'autres types de matériaux, y compris les métaux.
5. Si vous avez l'assemblage délicat sur votre mesh, le transfert de plaques attentivement l'incubateur. Nous avons, une seule fois, heurté le bac de plaques contre un bourrage de porte et a dû ré-assembler les plaques. Prenez votre temps, et tracer votre itinéraire. C'est une préoccupation unique, afin de prendre soin cette fois-ci.

4) L'incubation et la récolte

Les plaques peuvent être incubées en fonction de votre champignon, mais doivent être conservés dans un incubateur biologique si possible, pour éviter la condensation due aux fluctuations de température. Les séries temporelles sont des récoltes effectuée de façon aseptique, à l'exception de la dernière récolte. Si ces récoltes intermédiaires sont effectuées après croissance surles substrats est significatif, la manipulation des plaques est plus facile parce que les substrats hyphes lien croix.

1. Pour notre démonstration, nous incuber les plaques à 20 ° C et dans l'obscurité. A un point de récolte la semaine 5, on enlève la totalité du lot de traitement, de pulvérisation de chaque fond et le dessus avec de l'éthanol 70% et l'utilisation de pinces flambé pour éliminer les matières à l'intérieur du poste de sécurité microbiologique.
2. Prenez des photos avant de détruire les plaques d'agar, en se concentrant sur toute la morphologie ou mélanisation.
3. Retirez les blocs d'être traités comme vos besoins exigent. Utilisez votre doigt pour rouler hyphes excès (avec des gants en nitrile), mais attention à ne pas perdre tout matériel cariées. En général, nous four-sec des blocs en aluminium pèsent casseroles afin de déterminer la perte de masse, utilisant des poids frais et sec de contrôle pour surveiller mèche excessif. Nous avons également l'étiquette et de suivre tous les blocs de couleur brun foncé qui sont clairement gorgés d'eau, bien que cela devrait être minime en suivant cette approche. La perte de masse de données permet le progrès carie jauge, et il est important si les données les concentrations élémentaires doivent être calculés sur une base gram-poids, plus tard. Rappelez-vous également que les données en pourcentage doit être normalisé pour les statistiques. Nous calculons comme suit:
   
   La perte de masse% = [(poids initial poids final) / poids initial] x 100
   1. Alternative séchage à l'air: Si vous avez besoin séchage à l'air, avec votre objectif de traiter le matériel biologiquement plus loin, vous devriez utiliser le régime de conditionnement de la section 2.3 pour reconditionner. Si vous devez déterminer la perte de masse, il faudra une mesure de la teneur en humidité, une solution consiste à diviser les blocs (ou poudres) dans une portion petits et grands. Peser les deux, mais seulement séché au four la petite portion. Calculer le facteur de conversion le taux d'humidité, comme ci-dessus, et ensuite l'appliquer à la masse totale des frais de petits + grosses portions (poids total des blocs frais). Surtout si le prétraitement du matériel avec un champignon avant de saccharification ou d'autres procédés, la perte de masse va vous aider à déterminer plus tard, le bilan massique et des comptes pour les glucides consommé par le champignon.
4. Détruire les cultures dans des sacs autoclavables, mais enregistrer treillis support en plastique et tout autre composant qui peut être recyclé pour être utilisé dans des expériences futures.

5) Interprétation des résultats

Tissus lignocellulosique est généralement plus lent déclin de l'agar-bloc de dessins, mais à ce stade, vous devriez avoir une variabilité relativement faible, même à des niveaux modérés carie. Vous devez également avoir modérée (20-50%), l'humidité n'est pas élevée dans les tissus de contrôle.

1. La teneur en humidité (sur la base du poids sec) dans le bois ne sont pas exposés aux champignons sont généralement modérés, autour de 40% dans cette démonstration. Ceci est au-dessus du point de saturation des fibres (FSP) du pin (normalement autour de 24%), ce qui signifie qu'il ya un peu d'eau libre dans l'excès de l'eau liée à l'intérieur de la paroi cellulaire secondaire lignocellulosique. Cela signifie aussi que certains mèche se produit probablement. Un HR de 100% devrait permet toujours pas de bois MC dépasser la FSP. Votre conception peut obtenir des résultats différents selon le support et la sélection de maillage. La clé est de garder la teneur en humidité inférieure à 85% ou plus, sur la base du poids sec.
2. La perte de masse% en bois dégradés dans ces microcosmes agar-bloc est généralement autour de 30% après 16 semaines pour la plupart des champignons. Pour les champignons de sélectionner, dans ce cas Serpula lacrymans, champignons permettra d'atteindre la dégradation complète en ce temps, la perte de masse> 60%. S. lacrymans est un champignon de la pourriture brune, supprimant de lignine peu, si la perte de masse de 62% dans ce procès signifie décomposition est presque terminé ou passées. Champignons de la pourriture blanche va supprimer la lignine, et la perte de masse dépend de l'espèce ainsi que substrat.
3. Prenez soin d'enregistrer la morphologie des hyphes. Dans cette démonstration, la morphologie des hyphes n'a pas intrinsèquement montrer le succès ou l'échec de tout traitement une, mais les couleurs mélanisation étaient importants. Il nous a permis de relier le rôle du fer comme impureté dans le plâtre d'études plus anciennes, comme Low et al. (2000), où des matériaux naturels ont été testés et où cette colorisation «rouille» a été observée. Le rôle du calcium et du fer ont été débattues dans le Low et al. (2000), et nous voyons ici la carie améliorée avec le fer, le calcium n'est pas, et ces mêmes couleur rouille hyphes.
4. Si vous voulez mesurer les concentrations de rien dans ce bois dégradés, il est préférable de normaliser la perte de masse. Si, par exemple, le calcium n'est ni importé ou exporté de bois pourri à 50%, sa concentration sur la base du poids apparaîtra à doubler à partir de zéro le temps de la récolte finale. C'est parce que 1 g de poudre représente désormais le double du volume de bois que l'a fait au temps zéro. Le champignon consommé 50% de la matrice, diminution de la densité. Normaliser une concentration donnée (par exemple mmol / g) pour compenser la perte de masse comme suit:
   
   Concentration normalisée = mmol / gx [1 - (perte de masse% / 100)]
   
   Exemple: 10 mmol / g Ca dans le bois dégradé de 20%, contre 7 mmol / g au temps zéro.
   
   Question: Avez augmentation de teneur en Ca pendant la décroissance?
   
   10 mmol / g est une apparente 3 mmol / g hausse, une hausse de 43%, mais ogramme NE de poudre de bois de faible densité avec des dégradés représente désormais un plus grand volume. La normalisation est nécessaire de comparer initiale et finale teneur en Ca des volumes de bois égale.
   
   10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol / g normalisée
   
   Réponse: Oui, Ca a augmenté, mais de 14%, et non pas 43%.
   
   (Les données peuvent aussi être exprimée par le volume de bois, mmol / cm ^3, en multipliant par la densité.

Figure 1. Agar-bloc de microcosme, comme mis en place dans cette démonstration, avant l'incubation.

Figure 2. Serpula lacrymans colonisant des blocs de bois de pin reposant sur ​​treillis de plastique pour élever les blocs au-dessus de l'agar-contact. Ce mycélium représente un lien important entre le bois et exogènes nutriments / élément de sources, et de contrôler ces sources matériel exogène dans la gélose ou en tant que matériaux solides est un des principaux avantages de l'agar-bloc de la conception, par rapport sol-bloc de conception.

Figure 3. Perte de poids moyenne%, comme mesure de l'étendue de la pourriture du bois par les Serpula lacrymans après 5 et 15 semaines d'incubation avec des pins dans l'agar-bloc de microcosmes. Traitement en avait pas (Ca-libres), 5 _mM de CaCl2 ajouté à la gélose (CaCl _2), pureté> 99% de gypse (CaSO _4), soit 1% de fer modifiée gypse. Protégé ANOVA signifie comparaisons ont été en utilisant des tests de Tukey, avec α = 0,05. Pour chaque récolte, des bars dans la même lettre ne sont pas significativement différentes. Les barres d'erreur = écart-type. Publié en Schilling (2010).

Figure 4. Photo aérienne (A) de tous les cinq répétitions à la semaine 15 de la carie par le même champignon pourriture brune de test, Serpula lacrymans, ainsi que les blocs (B) enlevé et séché au four. Notez l'absence de mélanisation à Ca-traitement gratuit, le jaunissement des traitements de calcium pur, et l'apparition de la rouille dans le fer-amendé traitement. Les traitements sont étiquetés comme dans la figure 3, avec le contrôle de blocs (B) étant non inoculés pour la comparaison.

Figure 5. Photo aérienne d'un essai différentes en utilisant un moyen plus élevé de fer de concentration, de malt agar Blakeslee est. Notez la perte de mélanisation observée, par rapport à la figure 4. Blocs retiré et pesé n'a montré aucun effet du traitement sur la perte de poids. Ceci est présenté comme une démonstration de l'influence des composantes exogènes de ces essais bloc. Ces effets ne seraient pas vérifiables dans les conceptions pot de terre-bloc, où ces apports exogènes sont trop difficiles à contrôler.

Discussion

En utilisant notre agar-bloc de mise en place (Figure 1) Serpula lacrymans a grandi en contact direct avec les surfaces de plâtre et en blocs de bois (figure 2), conduisant à plus de 60% ​​perte de poids dans le contrôle de brun-pourri des blocs de pin (figure 3 ). Ce satisfait aisément l'objectif de la norme ASTM décomposition> 50%, et le coefficient moyen de variation (C _V) en décomposition a été à 0,055 à la semaine 16. Ces données sont publiées dans le Schilling ^7. Encore une fois, d'autres champignons, il faudra d'incubation plus longue dans l'agar-bloc que dans un sol-bloc. Pour référence, nous avons exécuté avec succès conceptions similaires dans plusieurs expériences passées avec une variété d'autres espèces de champignons, souvent en utilisant microscopie électronique à balayage d'électrons spectroscopie dispersive (MEB-EDS) et la spectroscopie à plasma inductif (ICP-OES) pour vérifier la connectivité avec les exogènes substrats et la translocation du calcium et d'autres éléments dans le bois ^8,9.

En plus d'une faible variabilité, il existe deux autres résultats que notre conception de l'agar-bloc révèle. D'abord, il y avait un effet du traitement (figure 3), où nos ajouts de calcium, qu'il s'agisse de l'agar comme CaCl ₂ ou du gypse pur, inhibé la carie par ce champignon. C'est un résultat utile, car d'autres ont théorisé le calcium améliore la carie basée sur des études avec le monde réel des matériaux comme le mortier et le plâtre. Au lieu de cela, nous voyons des taux de décomposition de rebond avec l'ajout de fer pour le gypse, suggérant de fer, pas de calcium, est la clé. Le deuxième résultat utile, cependant, n'est pas quantifié, mais est plutôt la couleur du mycélium (figure 4). Il existe des différences significatives mélanisation et évidente dans les hyphes externes entre les traitements, et les chercheurs ont déjà noté mélanisation «rouille» lorsqu'ils rencontrent ce champignon sur les matériaux de construction (par exemple Low et al. 2000). Dans nos études les plus récentes, nous avons constaté que ces effets sont perdus en utilisant un support de haute fer (figure 5). Collectivement, il suggère que ce champignon utilise le fer, le calcium n'est pas, dans ces matières et que des études antérieures, avec «rouillées» mycéliums signalés, étaient en observant l'effet du fer, pas d'effet du calcium.

Globalement, ces résultats et une absence d'effets du traitement à l'aide du fer à haute agar sont une démonstration très forte de la commande que la conception d'agar-bloc peut fournir au chercheur, surtout à la lumière de l'alternative du sol approche modulaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes	Nalge Nunc international	4014	25 x 150 mm
Agar, Type A	Sigma-Aldrich	A4550
Ammonium nitrate, NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
Potassium phosphate, KH2PO4	JT Baker	3246-01
Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Dextrose
Boric acid, H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O	JT Baker	2540-04
Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O	Sigma-Aldrich	209198
Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O	Sigma-Aldrich	431346
Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
Sodium chloride, NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
Pipet-aid	Drummond Scientific	4-000-110	Cordless EtOH the surface
10 ml sterile polystyrene pipette	BD Biosciences	357551
Gutter Guard	Thermwell Products Co.	VX620	Pre-scrubbed with soap Hardware store
Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O	Acros Organics	385355000
#4 cork borer	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM-996