Summary
Это видео демонстрирует контролируемый подход среду для изучения деградации лигноцеллюлозных тканях растения аэробных грибов. Возможность контролировать источники питательных веществ и влаги является ключевым преимуществом агар-блок микрокосм, но подход часто приводит к переменным успехом. Мы обращаемся критических ошибок, чтобы выход воспроизводимых с низким уровнем изменчивости результатов.
Abstract
Два основных метода для изучения грибковых биодеградации лигноцеллюлозных растительных тканей были разработаны для консерванта древесины тестирования (почвенно-блок; агар-блока). Хорошо принято считать, что почвенно-блок микрокосмы дают более высокие скорости распада, меньше проблем влаги, снижение изменчивости в различных исследованиях, и выше порогов консервант токсичности. Почвенно-блок тестирования, таким образом, больше использовали технику и был стандартизован Американского общества по испытанию материалов (ASTM) (метод D 1413-07). Почвенно-блочная конструкция имеет свои недостатки, однако, использование местных источников переменного почве и в ограничении контроля питательных веществ внешние (экзогенные), чтобы распадающихся тканей. Эти недостатки возникли как проблемы в применении этого метода к другим, более популярным цели исследования. Эти современные цели включают унижающие lignocellulosics для производства биоэнергии исследований, испытаний биоремедиации совместно метаболизируется токсичных веществ, оценки окислительных механизмов, а также отслеживания транслоцируется элементов вдоль гиф сетей. Почва-блоки не поддаются достаточно контроля в этих приложениях. Изысканный агар-блок подход.
Здесь мы используем бурая гниль древесины, разрушающих грибов Serpula lacrymans деградировать древесины в агар-блок микрокосм, используя глубокие чашки Петри с низким содержанием кальция агара. Мы проверяем роли экзогенных гипса на распад временных рядов, чтобы продемонстрировать полезность и ожидалось изменчивости. Блоки из одной печатной плате рип (продольный разрез) обусловлены, взвешивают, в автоклаве, и представил асептически поверх пластиковой сетки. Грибковые прививки в каждом блоке лицо, с экзогенными гипса добавляют в интерфейсах. Урожаи асептических до последнего разрушительного урожая. Эти микрокосмы предназначены, чтобы избежать контакта с блоком агар или стены чашку Петри. Конденсация сводится к минимуму в течение пластины льет и во время инкубации. Наконец, посевной / гипс / дерево расстояния сводится к минимуму, но не допуская контакта. Эти менее технические аспекты агар-блочной конструкции также являются наиболее распространенными причинами выхода из строя и основной источник изменчивости в различных исследованиях. Видео публикации Поэтому полезно в этом случае, и мы демонстрируем низкой изменчивости, высококачественные результаты.
Protocol
Этот протокол применяется к древесной и недревесной субстратов, как указано, а также к материальным духовке или высушивают на воздухе. Прочитайте протокол первого, однако, прежде чем установки. Есть несколько вопросов, поднятых которые могут применяться к учебе, и эти точки (подчеркнуто) требует планирования. Кроме того, отметить, что Существуют два опубликованных агар-блок методы, которые иногда используются, один британский стандарт 838 и еще следующие Международной исследовательской группы по защите древесины (IRG-WP) документ, представленный Храбрость (1978). Наши напоминает метод 838, с изменениями, в первую очередь в дизайне микрокосма и контроль агар, но опять же, оба подхода часто избегают из-за исторических вопросах контроля влажности в деревянных блоков, что приводит к гипоксии и изменчивость. Хороший обзор этих методов тестирования, что включает в себя обсуждение агар-блок-схем, в том числе стандартных 838, можно найти у Николая (1973).
1) Подготовка Микрокосмы
Микрокосмы для этих испытаний 1 см выше (глубже), чем обычные чашки Петри, увеличивая пространство над головой деревянные блоки. Они наполнены скромным и точное количество агара, чтобы контролировать абсолютное число калорий, в дополнение к их концентрации, а также сохранить деревянные блоки на достаточном удалении (> 3 мм) с крышкой. Агар используется в данном случае гипса тестирование низкокальциевой Тип агар, однако, мы показываем представитель результаты, используя средний Blakeslee, в АТСС рекомендуется средство для поддержания тест изолята Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) Шретер штамм EMPA 65 ( АТСС 32750).
Эта конструкция держит растительных тканей от контакта агар и от крышки блюда и стен. Переменные увлажнения лигноцеллюлозных субстратов является ключом источник изменчивости агар-блок тестов. Смачивание увеличить влажность создает аноксии и подавляет или даже останавливает аэробной биодеградации. Это также создает проблемы для тех, кто изучения окислительных механизмов коричневые и белые грибы гнили ответственность за дерево декомпозиции. Конденсация на пластину крышки является проблемой, если свободной форме капель воды и мокрой поверхности. Кроме того, дерева и других тканей будет "Фитиль" вода быстро от агара при контакте, что приводит к влажности более 80% (сухого веса. Основе) и прекращение аэробной деградации. Ткани должны быть удалены от этих водных источников, что позволяет нитчатых грибов, чтобы найти, подключение и контроль влажности в пределах подложки.
- Сделайте достаточное количество агар СМИ, чтобы заполнить необходимое количество пластин Петри с 20 мл агара, каждый. Мы используем пять воспроизводит (п = 5) на лечение, определяется мощность анализ с использованием прошлых результатов.
- Для кальция и железа, свободной Тип агар, мы добавляем 15 г агара на 500 мл мерную колбу, содержащую приблизительно 400 мл деионизированной воды поправками с 1,0 г NH 4 NO 3, 1,0 г одноосновных KH 2 PO 4, 0,25 г MgSO 4 х 7H 2 O и 1,0 г глюкозы. К смеси, мы используем растворы добавлять микроэлементы. Мы добавили 50 мкл H 3 BO 4 (0,057 г / 100 мл) и ZnSO 4 (0,031 г / 100 мл). Мы добавили 50 мкл каждого из MnCl 2 (0,036 г / 100 мл), CuSO 4 (0,039 г / 100 мл) и (NH 4) 6 Mo 7 O 24 (0,018 г / 100 мл). Как только питательные вещества добавляются, заполнить мерную колбу на 500 мл линии.
- Помимо типичных кальция в этом случае было бы 0,05 г CaCl 2 х 2H 2 O / 500 мл. В нашем случае мы используем агар кальция, лечение, с 5 мМ конечной концентрации. Мы счетчик увеличение ионной Помимо прочности и хлорида добавлением 5 мМ NaCl в других микрокосм. Кроме того, мы используем железа свободных средств массовой информации для этой демонстрации, но в тех случаях, когда железо входит, мы смешиваем 0,112 г FeSO 4 с 2 мл деионизированной воды и добавить 50 мкл этого свежий раствор (не акции) сразу же после вортексе. В любом СМИ, где вы управляете дополнения питательных веществ, имеет смысл проверить рН перед автоклавированием. Кислотных или основных добавок (например, FeCl 3) будет влиять затвердевания.
- Передача информации к колбе и автоклава среде при 121 ° С и 16 МПа в течение 20 минут. Мы не превышает 500 мл объема (на 1000 мл колбу), чтобы избежать агар укрепить прежде чем мы сможем управлять и все это для тестовых пластин.
(Примечание:.. Это имеет смысл при использовании альтернативных средств массовой информации, особенно минимальным питательный агар с добавлением солей базальной, сначала убедитесь, что ваш тест гриб вырастет на нем высоких ионных силах может подавлять рост или даже убить вашего теста изоляции) - Использование портативных помощи пипетки и 10 мл стерильной пипетки полистирола для передачи агара асептически в кабинет биобезопасности, когда-то колбы прохладно. Сдача СМИ прохладный на ощупь Здесь важно, чтобы минимизировать конденсат. Кроме того, стек пластины высоко, как они льют, чтобы свести к минимуму свободной воды на веках. Хотя конденсация неприятность в нормальных культивирования, вот оно представляет собой серьезную проблему, если дроплеты форме и мокрым деревом. Влажности (MC) более чем на 80% (исходя из сухого веса) создаст гипоксия в тканях, ограничить распада аэробными грибки, и увеличение изменчивости. Рассчитать MC следующим образом:
MC * = [(свежие весом х сухой вес) / сухой вес] х 100
* (MC может превышать 100% - это может показаться странным образом рассчитать MC, но стандарт)- Альтернативные микрокосм: Если растительных тканей тестируются, которые должны быть предварительно измельченный и просеянный (например, кукурузы Стовер стеблей и листьев, вместе), Есть два варианта блюда мы используем. Разделенные Петри пластины поставляются с 2 или 4 секции и агара может быть исключен из отсеков с порошком. Затвердевший агар также могут быть снижены, а часть удаляется с оставлением места для порошка, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы сохранить равные объемы агар остальные, если наличие питательных веществ должно быть под контролем.
- Добавить щедро вырезать пластмассовыми решетками сетки к поверхности пластины, используя тщательно мыть и автоклавного сетки добавил асептически. Мы используем продукт, Желоб гвардии (35 х 50 мм, толщиной 2 мм), для нашей сетки, и использовали сканирующую электронную микроскопию, чтобы показать чистую поверхность после мытья мылом и водой и, чтобы показать отсутствие грибковой проникновения. Мы имели переменный успех с фильтрами из стекловолокна и с укладкой блоков непосредственно на развитых мицелия, как за счет влагу вопросов. Вы получите распада, но ваш коэффициент изменчивости (CV) будет высоким, что сделает лечение сравнения статистически слабой. Мы использовали стеклянные стержни и ранее, но блокирует восприимчивы к соскальзывания стержней, когда толкали, оставляя блоков в контакт с агара. Один хорошей альтернативой является сокращение полного круга, чтобы соответствовать пластин, резки один край от разместить посевной. В целом, сокращение сетки в соответствии со своими собственными настройками, но убедитесь, что они лежали полностью плоская в чашках Петри.
2) Подготовка субстратов "Блок"
Эти протоколы были разработаны для массивной древесины, но могут быть адаптированы для других тканях растений. Потеря массы является стандартным показателем для распада прогресса в лес, деградировавших в мицелиальных грибов. Таким образом, наш подход использует абсолютно сухой вес до и после распада для определения потери массы. Однако для любого биоэнергетики исследований, где акцент делается на химию тканей растений, многие считают, что воздушной сушки тканей является предпочтительным. Здесь мы показываем, протоколы для подготовки Вашего агар-блока культур использовать духовку высушенный исходный материал, но дать альтернативную информацию высохнуть на воздухе, а также для обработки порошок вместо твердых подложках.
- Для демонстрации, мы используем южная желтая сосна (SYP). ГМП является коммерчески доступные пиломатериалы представляющих подавляющее большинство пиломатериалов, используемых в жилье в США может быть любой из четырех видов сосны. Номера для обработанной древесины используется и без сучков блоки вырезались из одного рип (продольный разрез) вдоль волокон (19 х 19 мм). Это сводит к минимуму химической изменчивости в лес. Эта длина разрезается на 19 мм 3-х блоков. Мы используем этот размер почвенно-блока испытаний, и сократить количество блоков в течение одной сессии на столе увидел.
- 19 мм 3-х блоков, которые будут использоваться в агар-блок микрокосмы дополнительно разбиты пополам вдоль волокон, с помощью зубила и молотка, не видел. Это делает один грубый край блока лицом вниз на пластиковую сетку, и гладкой, чтобы верхний край этикетки. Этикетка блоков с карандашом. Если вы не можете этикетке вашего подложки, убедитесь, что разработать систему, чтобы идти в ногу с образцами. Вырезать достаточно блоки, чтобы удовлетворить ваши лечения (опять же, мы используем п = 5 на курс лечения), а также неправительственных организаций, прививку управления, которые будут служить как загрязнение мониторов и в качестве базовых данных образцов, обусловленной параллельно.
- Для абсолютно сухого материала, места образцов в конвекционной печи при температуре 100 ° С в течение 48 часов. Если воздушной сушки материала требуется, состояние образцов в камере или комнате с постоянной влажностью и температурой. Мы используем 65% относительной влажности и 20 ° С, и мы обычно рассчитываем на 10-14 кондиционирования дней, в зависимости от материала.
- Предварительно весят ваши образцы для определения начальных абсолютно сухой или свежей веса. С образцами из духовки, просто перенести образцы эксикатор для охлаждения и взвесьте.
- Альтернативные воздушной сушки: С воздушно-сухой материал, возьмите пять образцов (п = 5; жертвенного они не будут использоваться в микрокосм), взвесить их свежие, абсолютно сухой их, как выше, и повторное взвешивание после высыхания. Вычислить фактор влаги коррекции для каждого из двух блоков следующим образом:
MC поправочный коэффициент = сухого веса / сырого веса
Пример: 2,46 г (сухой) / 2,68 г (свежие) = 0,918, так что, 3,0 г свежих блок 2,75 г духовке высушенные
Средняя пять образцов для получения среднего коэффициента коррекции. Затем, взвесить все ваши воздушно-сухой блоками. Умножьте каждое весом средний коэффициент коррекции МС для определения начальных абсолютно сухого веса.
- Альтернативные воздушной сушки: С воздушно-сухой материал, возьмите пять образцов (п = 5; жертвенного они не будут использоваться в микрокосм), взвесить их свежие, абсолютно сухой их, как выше, и повторное взвешивание после высыхания. Вычислить фактор влаги коррекции для каждого из двух блоков следующим образом:
- Автоклав меченых образцов при 121 ° С и 16 МПа в течение 1 часа или дольше, с большими образцами. Плотно фольгой, чтобы минимизировать смачивания.
- Alternatiве стерилизации: Гамма-излучение может быть использовано для стерилизации, если это возможно. Мы протестировали ели и бука ранее для влияния температуры на гемицеллюлозы потери, и не нашел, а также без потери прочности или изменения цвета. Однако, это может различаются между субстратов и ваших предпочтений / потребности, и гамма-излучения является проверенной альтернативой.
- Для этой демонстрации, мы проводим тестирование роль твердого гипса (чистый по сравнению с 1% FeSO 4) на деградацию нашей сосны (SYP) образцов. Они сделаны в виде дисков с точным площадей и объемов, опять же контролировать их наличие в дополнение к их концентрации. Это автоклавного отдельно и добавляют во время прививки шаг. Нам нужно одном диске для каждого блока, и мы добавляем два блока в чашке Петри, чтобы два урожая.
3) прививании и маркировки
Прививании агар-блок микрокосмы более трудоемким, чем прививки почвенно-блок банки. Для нас, мы рассчитываем на каждой прививки с 3 мин. Для чашки Петри, содержащей агар, это точка дополнение для сетки, дерева, любых внешних источников питательных веществ (в данном случае, гипс гранулы), и грибок. Существует повышенный риск для загрязнения из-за количества времени открытой крышке и количество посещений внутри. Есть также несколько ключевых ошибок, которые обычно делаются на данном этапе, а это лучший покрыты связью видео с текстом. Смотреть видео.
- В стерильном кабинете биобезопасности, собирать пустые блюда агар, источник пластины для грибковых посевной (мы используем 2 недели культур), сетка, завод подложку (дерево), экзогенные материалы, шулер, парафильмом полосы, и передача инструментов. Мы пламени стерилизовать с использованием 70% этанола, и мы используем передачу инструмент для посевной и щипцы для блоков и сетки. Парафильмом следует разрезать бритвой, чтобы избежать любых ников по краям. Никс в парафильмом привести к разрывам при герметизации, и это будет толкать образцы и требуют повторного въезда.
- Пламя передачи инструментов или пинцетом, прежде чем добавить следующее (в этом порядке):
- Пластиковые сетки.
- Вуд подложки. Для нашей демонстрации, мы добавим два блока древесины по длине сетки, как с той же начальной блок, который был разделен таким образом мы можем пары данных из ранних и поздних урожаев. Эти блоки добавил бок о бок, с конца зерна (дерево сечение) перед точкой источником грибковой посевной.
- Экзогенные материалов. Здесь мы проводим тестирование роль гипса на распад на нитчатых грибов. Поэтому мы хотим гриб сталкиваться с этим гипсом диски не дойдя до дерева, и тем самым добавить гипс диск между каждой точке материалом, а блок в верхней части сетки. Это означает, добавив 2 дисков в микромире. Не допускайте контакта между дисками и дерева, но держать их близко.
- Грибковые посевной. Мы используем # 4 пробки буром с диаметром 7 мм, чтобы пробки от 2-недельного культуры, выращенные в 20 мл агара. Это помогает контролировать объем посевной. Для не-контроль прививку, то лучше, чтобы добавить вилку из стерильной пластины. Как правило, мы добавим эти пробки на агар, а не на сетку. Не допускайте контакта между посевной и либо экзогенными субстратами или дерева, но опять же, размещать их близко друг к другу. Существует один посевной вилка на блок.
Примечание: Это имеет смысл собрать эти содержания в агар блюдо, прежде чем начать обеспечивать будет не менее 3 мм головы пространства, что будет не менее 3 мм расстояние между деревянные блоки и крышки стены, и что ваша пластиковая сетка Размеры будет легко приспособиться к вашим субстратов.
- Парафильмом блюда, чтобы запечатать их, держа горящий спирт пламени и щипцами готов. Держите пластины горизонтального и обернуть парафильмом в гладкой непрерывном движении. Если парафильмом перерывов или если содержимое толкаются, удалить парафильмом, повторно вводить и собирать содержание, и повторите попытку.
- Этикетка блюдо крышкой использованием спиртоустойчивой маркер, маркировка номера блоков непосредственно поверх соответствующих субстратов. Мы также обращаем кругов над гипсовой дисков. Как дерево распадов, вы, скорее всего, потеряете способность читать маркировку на подложках. Важно, чтобы не отставать от блюдо позиции. Кроме того, не следует недооценивать способность к грибу ухудшить качество или колонизировать множество других типах материалов, включая металлы.
- Если у вас тонкие сборка на вашей сети, передачи пластин тщательно инкубатора. У нас есть, только один раз, столкнулся бен пластин от двери вареньем и пришлось вновь собирать пластинки. Не торопитесь, и участок маршрута. Это одноразовый озабоченность, так что будьте аккуратнее в этот раз.
4) Инкубация и сбора
Плиты могут быть инкубировали в соответствии с вашими гриб, но следует иметь в биологических инкубатор если это возможно, чтобы избежать конденсации влаги из-за температурных колебаний. Урожаев Временные ряды делаются асептически, за исключением последнего урожая. Если эти промежуточные урожаи сделано после роста насубстратов является значительным, обработки пластин легче, потому что гиф субстратов крест ссылке.
- Для нашего примера мы инкубировать пластин при 20 ° С, а в темное время суток. В неделю 5 урожая точки, мы удаляем всю партию лечения, спрей каждый нижней и верхней с 70% этанола и использовать пылали щипцы для удаления материала внутри шкафа биобезопасности.
- Снимайте фотографии перед уничтожением агаром, сосредоточив внимание на какой-либо морфологии или меланизации.
- Удалить блоки должны рассматриваться как ваши потребности требуют. Используйте свой палец, чтобы откатить избыток гифы (с нитриловые перчатки), но будьте осторожны, чтобы не терять распались материала. Как правило, мы абсолютно сухой блоков из алюминия весом кастрюли, чтобы определить потерю массы, используя свежий и сухой вес управления для контроля за чрезмерную влагу. Мы также этикетки и отслеживать любые темно-коричневого цвета блоков, которые четко заболоченных, хотя это должно быть минимальным этого подхода. Потеря массы данных помогает индикатор хода процесса распада, и важно, данные, если элементарная концентрации должны быть рассчитаны на грамм веса основе, позже. Также помните, что процент данные должны быть нормализованы для статистики. Мы рассчитываем следующим образом:
Потеря% Массовая = [(начальный вес конечного веса) / начальный вес] х 100- Альтернативные воздушной сушки: Если требуется воздушной сушки, с вашей целью, чтобы относиться к биологически материал дальше, вы должны использовать режим кондиционирования с п. 2.3 для ремонта. Если необходимо определить потерю массы, это потребует мера влажности, Одно из решений заключается в разделении блоков (или порошки) в больших и малых часть. Взвесьте оба, но только абсолютно сухой небольшая часть. Рассчитать влажность коэффициент преобразования, как и выше, а затем применить его к общей сырой вес маленький + большие порции (всего блока сырого веса). Особенно, если предварительная обработка материала с грибом до осахаривания или других процессов, потеря массы поможет Вам с определением баланса массы позже и составляет углеводов потребляется гриба.
- Уничтожьте культур в автоклавируемый сумки, но сохранить пластиковую сетку поддержку и любые другие компоненты, которые могут быть переработаны для использования в будущих экспериментах.
5) интерпретация результатов
Лигноцеллюлозной ткани, как правило, медленный распад в агар-блок-схем, но в этот момент вы должны иметь относительно низкой изменчивости даже при умеренных уровнях распада. Вы также должны иметь умеренную (20-50%), а не с высоким содержанием влаги в контрольной ткани.
- Содержание влаги (на основе сухого веса) в лесу не подвергается гриб, как правило, умеренные, около 40% в этой демонстрации. Это выше точки насыщения волокна (FSP) сосны (обычно около 24%), что означает, что есть некоторые свободные воды сверх воды, связанной в лигноцеллюлозных вторичной клеточной стенки. Это также означает, что некоторые влагу всего происходит. Относительная влажность 100% все равно не позволяют дереву MC превышать FSP. Ваш проект может достичь разные результаты в зависимости от основы и сетка отбора. Ключ должен держать влажности ниже 85% или около того, на основе сухого веса.
- Потеря% по массе в лесу деградировали в этих агар-блок микрокосм, как правило, около 30% после 16 недель для большинства грибов. Для некоторых грибов, в этом случае Serpula lacrymans, грибов будет добиться полной деградации в это время,> 60% потери массы. С. lacrymans является коричневый гриб гнили, удаление маленьких лигнин, поэтому 62% потери массы в этом испытании средств распада рядом или мимо завершения. Белые грибы гнить будет удалить лигнин, и потери массы зависит от видов, а в качестве субстрата.
- Позаботьтесь, чтобы записывать гиф морфологии. В этой демонстрации гиф морфологии не показать своей сути успех или неудача в какой-либо лечения, но меланизации цвета были важны. Это позволило связать роль железа в качестве примеси в гипс на предыдущих исследованиях, как низкий и соавт. (2000), где родной материалы были проверены и, где это раскрашивание "ржавчина" не наблюдалось. Роль кальция и железа были обсуждены в странах с низким и соавт. (2000), и здесь мы видим расширение распада с железом, а не кальция, а те же рыжие гифы.
- Если вы хотите измерить концентрацию ничего в этом degraded дерева, лучше всего для нормализации потери массы. Если, например, кальций является ни ввозимые или вывозимые из дерева распались 50%, его концентрации на основе веса появится в два раза время от нуля до конечного урожая. Это потому, что 1 г порошка в настоящее время представляет в два раза объема древесины, чем это было в нулевой момент времени. Гриб потребляется 50% от матрицы, уменьшением плотности. Нормализация любой концентрации (например, ммоль / г), чтобы компенсировать потери массы следующим образом:
Нормализованная концентрация = ммоль / дх [1 - (% потери массы / 100)]
Пример: 10 ммоль / г Са в лесу degraded 20%, по сравнению с 7 ммоль / г в нулевой момент времени.
Вопрос: Содержание кальция увеличивается во время распада?
10 ммоль / г является очевидной 3 ммоль / г рост, 43% увеличение, но опе грамм порошка из деградированных древесины с меньшей плотностью сейчас представляет больший объем. Нормализация требуется сравнить начальный и конечный Содержание кальция в равных объемах древесины.
10 х [1 х (20% / 100)] = 8 ммоль / г нормированы
Ответ: Да, Ca сделал увеличение, но на 14%, а не 43%.
(Данные также могут быть выражены в дерево объема, ммоль / см 3, путем умножения на плотность.
Рисунок 1. Агар-блок микрокосм, как создать в этой демонстрации, до инкубации.
Рисунок 2. Serpula lacrymans колонизации сосновый лес отдыха блоков на пластиковые сетки, чтобы поднять блоки выше агар-контакт. Это грибница представляет собой важную связь между деревом и экзогенные питательные / элемент источников, и управления этими экзогенных источников материала в агар или в виде твердых материалов является ключевым преимуществом агар-блочная конструкция, по сравнению с почвенно-блочная конструкция.
Рисунок 3. Средняя потеря веса%, а мерой степени древесины распада по Serpula lacrymans через 5 и 15 недель инкубации с сосны в агар-блок микрокосм. Лечение было ни одного (Са-бесплатно), 5 мМ CaCl 2 добавлены в агар (CaCl 2),> 99% чистого гипса (CaSO 4), или 1% железа поправками гипса. Охраняемые ANOVA средства сравнений с помощью тестов Тьюки, при α = 0,05. Для каждого урожая, баров под той же буквой, существенно не отличаются. Планки погрешностей = стандартное отклонение. Опубликовано в Шиллинг (2010).
Рисунок 4. Верхнее фото () всех пяти повторяет в неделю 15 распада одним и тем же коричневый гриб теста гнили, Serpula lacrymans, а также блоков (В) удалены и печи сушки. Обратите внимание на отсутствие меланизации в Са-бесплатное лечение, пожелтение в чистом лечения кальция, и появление ржавчины в железо-поправками лечения. Лечение помечены как показано на рисунке 3, с контролем в (Б) не являющиеся прививку блоки для сравнения.
Рисунок 5. Верхнее изображение из различных исследование с использованием более высокий средний концентрации железа, солодовый агар Blakeslee в. Обратите внимание, потери наблюдаются меланизации, по сравнению с Рисунок 4. Блоки удалены и весил не показали эффекта лечения на потерю веса. Это представляется как демонстрация влияния внешних компонентов этих блоков испытаний. Эти эффекты не были бы проверяемые в почвенно-блок-схем, банки, где эти экзогенные входы слишком трудно контролировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя наши агар-блок настройки (рис. 1) Serpula lacrymans вырос в прямом контакте с гипсовой поверхности и в деревянных блоков (рис. 2), что приводит к более чем 60% потери веса в контрольной коричнево-сгнили блоков сосны (рис. 3 ). Это легко удовлетворяет цели ASTM стандарт> 50% распада, а средний коэффициент вариации (С V) в распаде на 0,055 был на 16 неделе. Эти данные опубликованы в Шиллинг 7. Опять же, других грибов потребуется больше инкубации в агар-блок, чем в почвенно-блок. Для справки, мы успешно запустить аналогичные проекты в нескольких прошлых экспериментов с рядом других видов грибов, часто с использованием сканирующей электронной микроскопии с электронной спектроскопии дисперсионные (SEM-EDS) и индуктивно-связанной плазмой спектроскопии (ICP-OES) для проверки связи с экзогенными субстратов и транслокации кальция и других элементов в дерево 8,9.
В дополнение к низкой изменчивости, Есть два других результатов, что наш агар-блочная конструкция раскрывает. Во-первых, эффект лечения (рис. 3), где наши кальция дополнения, следует ли агар как CaCl 2 или как чистый гипс, ингибирует распад этим грибом. Это полезный результат, потому что другие предположили, кальций усиливает распад на основе исследований с реальными материалами, такими как раствор и штукатурку. Вместо этого мы видим отскок скорости распада с добавлением железа гипса, предполагая, железа, а не кальция, является ключевым. Второй полезный результат, однако, не определена, но вместо того, чтобы цвет мицелия (рис. 4). Существуют значительные и очевидные различия в меланизации внешних гиф среди методов лечения, и исследователи уже отмечалось меланизации "ржавчина" при встрече с этим грибом на строительные материалы (например, низкая и соавт. 2000). В наших последних исследований, мы обнаружили, что эти эффекты теряются использованием высоких железа среды (рис. 5). В совокупности это означает, что этот гриб используется железо, а не кальция, в этих материалах, и что более ранние исследования, с "ржавой" мицелия сообщалось, наблюдали железа следствие, а не кальция эффект.
В целом, эти результаты и отсутствие эффектов лечения с использованием высоких железа агара очень сильный демонстрация управления, агар-блочная конструкция может обеспечить исследователя, особенно в свете альтернативных почвенно-блок подход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Nalge Nunc international | 4014 | 25 x 150 mm |
| Agar, Type A | Sigma-Aldrich | A4550 | |
| Ammonium nitrate, NH4NO3 | Millinckrodt | 3436-12 | |
| Potassium phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | |
| Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Dextrose |
| Boric acid, H3BO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 2549-04 | |
| Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 8880-12 | |
| Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O | JT Baker | 2540-04 | |
| Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O | Sigma-Aldrich | 431346 | |
| Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 4160-12 | |
| Sodium chloride, NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-12 | |
| Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 5056-12 | |
| Pipet-aid | Drummond Scientific | 4-000-110 | Cordless EtOH the surface |
| 10 ml sterile polystyrene pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Gutter Guard | Thermwell Products Co. | VX620 | Pre-scrubbed with soap Hardware store |
| Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O | Acros Organics | 385355000 | |
| #4 cork borer | Boekel Scientific | 1601 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 |
References
- ASTM D1413-07. Standard test method for testing wood preservatives by laboratory soil-block cultures. . Annual Book of ASTM Standards. , 185-192 (2007).
- Bravery, A. F. A miniaturized wood block for the rapid evaluation of wood preservative fungicides. , International Research Group on Wood Protection (IRG/WP 2113). (1978).
- Low, G. A., Young, M. E., Martin, P., Palfreyman, J. W. Assessing the relationship between the dry rot fungus Serpula lacrymans and selected forms of masonry. Int. Biodeterior. Biodegrad. 46, 141-150 (2000).
- Nicolas, D. Volume I (One/1) - Degradation and Protection of Wood (Syracuse Wood Science Series #5). Wood Deterioration and Its Prevention by Preservative Treatments. , Syracuse University Press. (1973).
- Schilling, J. S. Effects of calcium-based materials and iron impurities on wood degradation by the brown rot fungus Serpula lacrymans. Holzforschung. 64, 93-99 (2010).
