Summary
Beschrijven we een eenvoudige, snelle en robuuste methode voor de vorming van
Abstract
Candida albicans blijft de meest voorkomende oorzaak van schimmelinfecties bij een groeiende populatie van gecompromitteerde patiënten en candidiasis is nu de derde meest voorkomende infectie bij Amerikaanse ziekenhuizen. Verschillende manifestaties van candidiasis worden geassocieerd met biofilm vorming, zowel op de host weefsels en / of medische hulpmiddelen (bijvoorbeeld katheters). Biofilmvorming draagt negatieve klinische implicaties, zoals cellen in de biofilms worden beschermd tegen gastheer immuunreacties en van de actie van de antischimmelmiddelen. We hebben een eenvoudige, snelle en robuuste in vitro model voor de vorming van C. albicans biofilms met 96 wells microtiterplaten-platen, die ook kan worden gebruikt voor de biofilm antischimmel gevoeligheid testen. Het uitlezen van deze test is colorimetrische, gebaseerd op de reductie van XTT (een tetrazolium zout) door de metabool actieve schimmel biofilm cellen. Een typisch experiment duurt ongeveer 24 uur voor de biofilmvorming, met een extra 24 uur voor antischimmel gevoeligheid testen. Door zijn eenvoud en het gebruik van algemeen beschikbare laboratorium-materiaal en apparatuur, deze techniek democratizes biofilm onderzoek en is een belangrijke stap op weg naar de standaardisatie van antifungale gevoeligheid testen van schimmel biofilms.
Protocol
1. Voorbereiding van de C. albicans
C. albicans is een risicogroep 1/BSL1 micro-organisme. Altijd onthouden om goed aseptisch / steriele technieken te gebruiken voor het werken met dit micro-organisme en institutionele procedures voor de juiste afvoer van biologisch gevaarlijke materialen te volgen.
- Bereid een overnachting cultuur van C. albicans in YPD (Gist Peptone Dextrose) vloeibaar medium door het enten een enkele kolonie van C. albicans in 25 ml YPD.
- Incubeer cultuur in een rondschudapparaat (ongeveer 180 rpm) bij 30 ° C gedurende de nacht. De meeste C. albicans stammen zal groeien als gistcellen onder deze omstandigheden.
- Centrifugeer het 's nachts culturen (ongeveer 3.000 rpm, 5-10 minuten), tweemaal wassen cellen met steriel PBS, en resuspendeer de laatste pellet in ongeveer 20-25 ml RPMI 1640 medium gebufferd met 165 mM morpholinepropanesulfonic zuur tot pH 7,0 en voorverwarmde bij 37 ° C (van nu af aan dit medium wordt aangeduid als gewoon "RPMI 1640").
- Tellen cellen met behulp van een hemacytometer. Na het tellen, Maak een suspensie van cellen op een uiteindelijke dichtheid van 1,0 x 10 6 cellen / ml in RPMI 1640.
Let op: Omdat cellen hebben de neiging te aggregeren, is het belangrijk om vortex krachtig tussen de wasbeurten en voor pipetteren.
2. Instellen van de 96-wells microtiterplaat voor de vorming van de biofilm
- Met behulp van een multichannel pipet toe te voegen 100 ul van C. albicans schorsing in geselecteerde putjes van de 96-well microtiterplaat (-s). Voeg geen cellen te putten in kolom 12, omdat deze zal dienen als negatieve controle.
- Bedek de hele microtiterplaat met de oorspronkelijke deksel, afdichting met parafilm, plaats binnen een incubator en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C. De lengte van de incubatietijd kan worden aangepast aan de specifieke experimentele opzet. Bijvoorbeeld, is het mogelijk om de kinetiek van biofilmvorming over een periode van 24 onderzoeken - 48 uur per zaaien meerdere platen en verwerking van elk bord op verschillende tijdstippen (bijvoorbeeld 2, 4, 8, 12, 24 en 48 uur)
- Na de vorming van biofilm, met behulp van een multichannel pipet zuig het medium goed als niet aan te raken en verstoren van de biofilms die zijn gevormd in elk van de putten.
- Met behulp van een multichannel pipet Was de plaatjes driemaal in steriele PBS (200 pi per putje). U kunt ook een geautomatiseerde microtiterplaat wasmachine. Tussen wast, en vooral na de laatste wassen, laat u de platen in een omgekeerde positie door deppen met keukenpapier om de resterende PBS te verwijderen. Op dit punt biofilms gevormd op de bodem van de putten moet duidelijk zichtbaar zijn, zelfs met het blote oog en kan ook worden gevisualiseerd met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1). Biofilms zijn nu klaar om te worden verwerkt voor antischimmel gevoeligheidstests assays.
(Als het belangrijkste doel van het experiment is het beoordelen van de mate van biofilmvorming, de platen zijn klaar om te worden verwerkt volgens de colorimetrische methode. Hiervoor is de XTT / menadion reagens (zie stap 3 hieronder) kunnen worden toegevoegd en de resulterende kleur lezen met behulp van een microtiterplaat lezer).
3. Schimmelwerende Gevoeligheid Testen van Biofilms
- Uit voorraad oplossingen of poeder, bereid een werkende oplossing in RPMI 1640-medium van elke antifungale te testen. Typische hoge concentraties worden 1024 ug / ml voor fluconazol, en 16 ug / ml voor zowel amfotericine B en caspofungine. Andere concentraties kan worden gebruikt voor verschillende agenten.
- Met behulp van een multichannel pipet, voeg 200 pi van de hoge concentratie van antifungale werking om de corresponderende putten in kolom 1 van elke microtiterplaat met schimmel biofilms.
- Voeg 100 ul van RPMI 1640 aan elk putje in de kolommen 2 tot 10.
- Voeg 100 ul van RPMI 1640 tot putten in kolom 11.
- Verwijder de 100 pi van antischimmelmiddel uit de bronnen van kolom 1 en toe te voegen aan de aangrenzende putten in kolom 2 (reeds met 100 ul van medium).
- Meng de inhoud goed door en neer te pipetteren om een seriële verdubbeling verdunning uit te voeren, en verwijder de tips.
- Herhaal dit naar rechts te verplaatsen tot aan de bronnen van de kolom 10, waarna de laatste 100 pi het volume van de bronnen van de kolom 10 na het mengen wordt weggegooid. Op deze manier is een reeks van verdunningen verdubbeling van uw agent (-s) van belang is gemaakt, van het meest geconcentreerd in putjes van kolom 1 het minst geconcentreerd in putjes van kolom 10. Onbetwiste biofilms in kolom 11 zal dienen als positieve controles, en lege waterputten in kolom 12 zal dienen als negatieve controle.
- Bedek de borden met de deksels, afdichting met parafilm en incubeer gedurende 24 -48 uur bij 37 ° C.
- Na de incubatieperiode Was de plaatjes als in stap 2.4 voor (3 x PBS).
- Met behulp van een multichannel pipet toe te voegen 100 pi van de XTT / menadion oplossing voor elk putje met een pre-gewassen biofilm evenals negatieve controle putten voor het meten van de achtergrond XTT-colorimetrische niveaus.
- De XTT is bereid als een verzadigde oplossing van 0,5 g / L lactaat in steriele Ringer's, PBS of zoutoplossing, die moet worden filter-gesteriliseerd met behulp van een 0,22 um-poriegrootte filter. De XTT oplossing is licht gevoelig, dus het moet worden afgedekt met aluminiumfolie tijdens de bereiding. Een keer voorbereid en filter-gesteriliseerd, aliquot in 10 ml werken volumes, en bewaar bij -70 ° C. Bescherm de buizen van licht met behulp van aluminiumfolie. Dooi slechts zoveel buizen als nodig is voor een bepaald experiment vlak voor gebruik.
- Menadion wordt bereid als een 10 mM voorraad-oplossing in 100% aceton, in hoeveelheden verdeeld in kleinere volumes (ongeveer 50 pL) en opgeslagen bij -70 ° C. Bereid de XTT / menadion oplossing vlak voor gebruik, door het toevoegen van een pi van de stockoplossing van menadion om een buisje met 10 ml van de ontdooide XTT oplossing.
- Dek de platen in aluminium folie en incubeer in het donker gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Ontdek de platen. Met behulp van een multichannel pipet verwijderen 80 pi van het resulterende gekleurde supernatant uit elk putje en zetten in de overeenkomstige putjes van een nieuwe microtiterplaat.
- Lees de plaat (-s) in een microtiterplaat reader bij 490 nm.
- Bereken de sessiele minimaal remmende concentraties SMIC50 en SMIC80, die de antifungale concentraties waarbij een 50% of 80% daling van de colorimetrische metingen worden gedetecteerd in vergelijking met de controle biofilms gevormd in de afwezigheid van antifungale geneesmiddelen (in dit geval de waarden voor kolom 11 , ook niet vergeten om de waarden af te trekken van negatieve controle van de putten in kolom 12 met XTT only). SMIC resultaten kunnen worden gepresenteerd als een tabel (dwz meerdere isolaten tegen meerdere antimycotica) of als alternatief, de resultaten voor elke individuele schimmel te isoleren tegen elkaar antifungale kan worden gepresenteerd in een grafiek door het plotten percentage remming ten opzichte van antifungale concentratie.
Voorbeeld: Na aftrek van de waarden in de negatieve controle, de gemiddelde OD van controle biofilms gevormd in kolom 11 is 1,32. De SMIC50 is de laagste antifungale concentratie leidt tot> 50% vermindering van de colorimetrische metingen, in dit geval minder dan 1,32 x 50/100 = 0,66. Ook de SMIC80 is de laagste antifungale concentratie leidt tot> 80% vermindering van de colorimetrische metingen, in dit geval minder dan 1,32 x 20 / 100 = 0.264.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont een microphotograph van een C. albicans biofilm gevormd op de bodem van een put in een 96 wells microtiterplaat genomen met behulp van een omgekeerde microscoop. Figuur 2 toont XTT-colorimetrische metingen (OD 490 waarden) voor elk van de 11 biofilms van een C. albicans wild-type stam gevormd in elk van de acht verschillende rijen van dezelfde 96 goed microtiterplaat. Figuur 3 toont de activiteit van amfotericine B in verschillende concentraties tegen C. albicans biofilms; pijltjes geven SMIC50 en SMIC80 waarden.
Figuur 1. (A) Paneel A toont genomen microphotograph met behulp van een camera bevestigd aan een omgekeerde microscoop van een C. albicans biofilm gevormd op de bodem van de put na aspiratie van RPMI medium en de daaropvolgende wassingen met PBS. (B) Een microfoto van een typische C. albicans biofilm gevisualiseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie. Bars zijn 100 um en 10 um voor de panelen A en B respectievelijk.
Figuur 2. De vorming van meerdere gelijkwaardige C. albicans biofilms in 96-well microtiterplaten. Colorimetrische metingen (OD 490 waarden) van XTT-reductie testen van biofilms gevormd door een C. albicans wild type in putjes van microtiterplaten. Waarden zijn voor 11 onafhankelijke biofilms gevormd in elk van de acht verschillende rijen van dezelfde 96 goed microtiterplaat. Resultaten voor de verschillende rijen werden vergeleken met one-way variantie-analyse en het gebruik van de Bartlett's test voor homogeniteit van variantie en meervoudige vergelijking van de Bonferroni post-test. Geen statistisch significante verschillen werden waargenomen bij het vergelijken van alle paren van de rijen aan elkaar (P> 0,05).
Figuur 3. Typische gevolgen van antifungale testen van de gevoeligheid tegen C. albicans biofilms. grafiek die typische resultaten van de effectiviteit van verschillende amfotericine B concentraties tegen biofilms van een C. albicans wild-type stam. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde percentage colorimetrische metingen voor XTT-reductie assays in vergelijking met putten te controleren. SMIC50 en SMIC80 waarden zijn aangegeven met pijlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudige, snelle, zuinige en zeer reproduceerbaar 96 wells microtiterplaat model voor de vorming van Candida biofilms in combinatie met een colorimetrische methode die de metabole activiteit van cellen die maatregelen in de biofilm met behulp van XTT. Deze 96 wells microtiterplaat model voor de vorming van biofilm werd oorspronkelijk ontwikkeld voor C. albicans, maar kan gebruikt worden voor andere Candida spp. en eenvoudig worden aangepast voor andere schimmels organismen. De methode kan worden gebruikt om meerdere parameters en factoren die van invloed biofilmvorming te onderzoeken en de biofilm-vormende vermogen van meerdere schimmelisolaten en / of mutante stammen te schatten. Maar misschien nog belangrijker, deze methode is zeer nuttig voor de bepaling van de antifungale gevoeligheid testen van de cellen in biofilms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLL-R is eigenaar van het eigen vermogen in MicrobeHTS Technologies, Inc, dat is het ontwikkelen van antimycotica. MicrobeHTS Technologies, Inc mits er geen financiële steun voor deze studies.
Acknowledgments
Biofilm-gerelateerde werkzaamheden in het laboratorium wordt gefinancierd door subsidies genummerde R21DE017294 en R21AI080930 van het National Institute of Dental & Craniofaciale Onderzoek en het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (tot JLL-R.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIDCR, de NIAID of de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L.
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
