Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

Summary

Detta protokoll beskriver ett enkelt självhäftande tejp-metoden för provtagning av tomat och andra färska ytor produkter, följt av en snabb helcellsvaccin upptäckt av

Abstract

Detta protokoll beskriver en enkel metod för självhäftande tejp-baserade provtagning av tomat och andra färska ytor produkter, följt av på-band fluorescens in situ hybridisering (FISH) för snabb kultur-oberoende detektion av Salmonella spp.. Cell-laddade band kan också placeras upp och ner på selektiv agar för fast-fas anrikning före upptäckt. Alternativt kan låg volym vätska anrikningsgrad (vätskeytan miniculture) utföras på ytan av bandet i icke-selektivt substrat, följt av FISH och analys via flödescytometri. Till att börja med är steril tejp kommit i kontakt med färska råvaror, är lätt tryck appliceras, och tejpen har tagits bort fysiskt utvinna mikrober som finns på dessa ytor. Band är monterade klibbiga sidan uppåt på objektglas glas mikroskop och de utvalda celler är fasta med 10% formalin (30 min) och uttorkad med hjälp av en graderad etanol-serien (50, 80 och 95%, 3 min varje koncentration). Nästa, cell-laddade band är fläckig med buffert som innehåller en Salmonella målinriktat cocktail DNA-sond och hybridiseras för 15 - 30 minuter vid 55 ° C, följt av en kort skölj i en tvätt buffert för att avlägsna obundna sond. Anhängare, är fisk-märkta celler sedan counterstained med DNA färgen 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och resultatet visas med fluorescensmikroskopi. För fast-fas anrikning, är cell-laddade band placeras med framsidan nedåt på en lämplig selektiv agar yta och inkuberas för att på plats tillväxten av Salmonella microcolonies, följt av FISH och mikroskopi enligt ovan. För vätskeytan miniculture är cell-laddade band placerade klibbiga sidan upp och ett silikon perfusion kammare tillämpas så att tejpen och objektglas formen i botten av en vattentät kammare i vilken en liten mängd (≤ 500 mikroliter) av trypticase-soja buljong (TSB) införs. Inloppet portar är förseglade och kamrarna inkuberas vid 35 - 37 ° C, vilket gör att tillväxt-baserad förstärkning av tejp-extraherade mikrober. Efter inkubation är inloppsportar oförseglade, celler fristående och blandas med kraftfulla och tillbaka pipettering, skördas genom centrifugering och fasta i 10% neutral buffrad formalin. Slutligen prover hybridiseras och undersöks via flödescytometri för att avslöja förekomsten av Salmonella spp.. Som beskrivs här, kan vår "tape-FISH" tillvägagångssätt ger enkel och snabb provtagning och detektion av Salmonella på tomater ytor. Vi har också använt denna metod för provtagning andra typer av färskvaror, bland annat spenat och jalapeño paprika.

Protocol

1. Yta Provtagning med sterilt tejp

1. Välj ett band att använda för provtagning. Den kommersiellt tillgängliga Svampar-band eller Con-Tact-Det provtagning band är sterila och speciellt förpackade för enkel användning. Vi har dock funnit att transparent (optiskt klar) generiska kontoret bandet kan också användas.
2. Använd en permanent spritpenna att rita 1 cm ² rutor på den icke-klibbiga sidan av en 10 cm bit tejp (ett papper mall kan användas). Detta kommer att fungera som en visuell guide för att notera vilken del av bandet har använts för att provsmaka maten eller miljömässiga yta.
3. Bilda ett "C"-formad ögla av band, med den klibbiga sidan mot ytan som ska provtas. För att göra detta, håll klibbiga slutar med tummen och långfingret och placera pekfingret mot dras torget på baksidan (icke-klibbiga sidan) av bandet (Figur 1).
4. Placera tejpen på ytan som ska provtas och tryck försiktigt det markerade området mot underlaget. Utan att släppa kanterna på bandet använder pekfingret för att säkerställa att den klibbiga sidan av bandet kommer i full kontakt med provets yta, för att undvika bubblor.
5. Använda en jämn rörelse, sakta drar tejpen bort från provet, fysiskt utvinna ytbundet mikrober. Fäst cell-laddade tejp, klibbiga sidan uppåt, på ett glas objektsglas använda generiska genomskinlig kontor tejp. Säkerställ korrekt spänning / sträckning av bandet så att en platt, icke-rynkig yta skapas. Detta kommer att hjälpa till att minimera problem med deformering / curling av bandet under efterföljande uppvärmning under hybridisering.

2. Fast fas anrikning och vätskeytan Miniculture

1. Fast fas anrikning sker genom att placera bandet nedåt på xylos-lysin-Tergitol 4 (XLT-4) agarplattor så att den insamlade cellerna är placerade i direkt kontakt med agar yta. Den mallade / prov kontakta delen av bandet är placerad jäms med agar yta och ena änden av bandet löst följs sidovägg petriskålen för att underlätta enkel borttagning av tejpen från agarytan följande berikande.
2. Plattorna är inverterad (för att undvika kondens) och inkuberas vid 35 - 37 ° C för att ge tillräcklig tillväxt av Salmonella spp.. Längden på inkubationstiden som behövs för att berika celler till en detekterbar nivå kommer att bero på initiala nivåer salmonella kontaminering. Vi har sett mycket bra microcolony formation från låga initiala inokulat efter 8 h berikande.
3. Efter att önskad anrikning perioden, öppna agarplatta. Bandet kommer att behålla sin klibbig under inkubationstiden. Tryck försiktigt tejpen mot agar med pekfingret för att säkerställa maximal återvinning av microcolonies bildas på bandet-agar gränssnitt. Ta tag i bandet från kanten fäst väggen i petriskål och ta bort den med en långsam, även rörelse. Montera cell-laddade tejp, klibbiga sidan uppåt, på ett objektsglas som beskrivs i avsnitt 1.5 ovan. Fortsätt till "fixering och dehydrering" steg nedan.
4. För vätskeytan miniculture, börja med att fästa tejpen som används för provtagning på ett objektsglas som beskrivs i avsnitt 1.5 ovan. Därefter täcker mallade / prov kontakta delen av bandet med en icke-steril silikon perfusion kammaren (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), bildar en sluten kammare, vars botten består av cellen laddade band, uppåt. Försiktigt men bestämt tryck i kammaren på plats för att garantera en vattentät tätning.
5. Med hjälp av en flexibel gel lastning pipettspetsen, överföring ≤ 500 mikroliter trypticase-soja buljong eller annat lämpligt förökningssubstrat genom en av kammarens liten vik-portar. Täta båda portarna med transparent kontor tejp för att förhindra avdunstning och inkubera objektglasen vid 35 -37 ° C som krävs för att tillräckligt berikande. Även om alla operationer ska utföras enligt god provtagning och hanteringsrutiner är sterilitet av port-tätningsband eller kammare perfusion inte krävs under vätskeytan miniculture. Kombinationen av FISH och flödescytometri kommer att möjliggöra en klar diskriminering av Salmonella spp.. från icke-mål bakterier som kan förekomma, med det största bidraget av icke-målarter flora förväntas komma från provet själv. Fortsätt till "fixering och dehydrering" steg nedan.

3. Fixering och uttorkning

1. För direkt yta provtagning eller för fast fas anrikning av Salmonella spp.. på XLT-4 agar, utföra på-band cell fixering i 30 minuter vid 25 ° C genom att täcka området provet kontakt med 500 mikroliter 10% neutral buffrad formalin.
2. Kasta fixativ i en förslutningsbar behållare (i en kemisk huva att minimera exponeringen för irriterande / giftiga ångor).
3. Torka i en etanol-serien (50%, 80% och 95%, 300 ml / 3 min varje koncentration). Fortsätt till "hybridisering" steg nedan.
4. För fixering av 500 mikroliter vätska yta miniculture provs, perfusion kammare öppnat, och en flexibel gel-loading Pipettspetsen används för att extrahera enrichate. Snabba upp och ner pipettering används för att säkerställa en effektiv borttagning av eventuella kvarvarande band-bundna celler.
5. Därefter är hela 500 mikroliter miniculture volym överförs till ett mikrocentrifugrör och snurrade ner vid 2000 xg (5 min). Supernatanten tas bort, är pellets vortexed kraftigt i 30-60 s och suspenderade i en lika stor volym 10% neutral buffrad formalin. Celler är fasta i 30 minuter vid 25 ° C.
6. Därefter fixativ avlägsnas och provet är suspenderade i cell lagring buffert, enligt följande. Provet centrifugeras ned vid 2000 xg (5 min, 25 ° C) supernatanten kasseras, är pellets vortexed kraftigt i 30 - 60 s, den suspenderade i en lika stor volym 50% odenaturerad etanol-50% fosfat- saltlösning. Fast cellerna kan lagras på obestämd tid (år) vid -20 ° C. Notera: När vätskor ändras (till exempel vid införandet av en fixativ eller annan buffert), är det viktigt att grundligt resuspendera (med vortexa) cellpelleten i en minimal del (~ 10 till 20 mikroliter) av "utgående" flytande systemet . Detta förhindrar bildning och se till att även upphävande av enskilda celler erhålls. Fortsätt till "hybridisering" steg nedan.

4. Hybridisering

1. Förbered hybridisering / tvättningsbuffert med kommersiella molekylärbiologisk kvalitet lösningar noterades i material tabell. Slutlig buffert komponent koncentrationer 0,7 M NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% natriumdodecylsulfat, gjorde fram till den slutliga önskad volym med molekylär-grade vattnet filtreras och med hjälp av en 0,22 ìm spruta eller kopp filter. Samma buffert, utan tillsats av sonder (se nedan) används som en tvätt buffert. Värm hybridisering och tvätt buffertar till 55 ° C.
2. Lägg fluorescerande-märkta Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3) och Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3 " ) oligonukleotid sonder (Material tabell) till förvärmd hybridisering buffert. Totalt sond koncentration på 5 ng mikroliter ^-1 används (t.ex. 2,5 ng mikroliter ^-1 varje givare; Bisha och Brehm-Stecher, 2009a).
3. För direkt-till-band och fasta prover fas anrikning, överlägg det mallade området prov kontakt bandet med 300 mikroliter av hybridisering buffert innehållande sonden cocktail och hybridisera band bundna celler i en fuktig, förseglade inkubation kammare inställd på 55 ° C. Om en direkt-kontakt inkubator som Slide Moat instrumentet (Material tabell) används, är proverna hybridiseras i 15 min och> 20 bilder kan behandlas samtidigt. Om en roterande stil hybridisering ugn som Bambino instrumentet (Material tabell) används, är bilderna placeras i 50 ml rör polypropylen centrifugera i hybridisering, en bild per rör. Eftersom värmeöverföring är inte direkt, är dessa prover hybridiseras under längre perioder (upp till 30 min).
4. Efter hybridisering, är de glider bort och sonden innehåller hybridisering buffert överlägg är kasseras. Bilderna är sedan antingen kortvarigt och försiktigt sköljas med förvärmd tvättningsbuffert genom att pipettera en liten mängd buffert under en lutande bild (3 sköljningar av 300 mikroliter i varje), eller formellt tvättas (upp till 30 min) med antingen en överlagring av förvärmd tvätt buffert eller nedsänkning i en 50 ml polypropylen centrifugrör med förvärmd tvätt buffert. Enligt vår erfarenhet är även en formell tvätta kommer att ge bättre resultat (mindre töcken från obundna sond), ett enkelt skölja tillräcklig för entydig detektion av Salmonella spp.. Därefter glider lufttorkas innan man går till "Detection" steg nedan.
5. Hybridisering av flytande prover ytan miniculture utförs genom att snurra ner prover (färska fast eller hålls i lager buffert vid -20 ° C) i 5 min vid 2000 xg, följt av kraftig vortexa av pelleten och resuspension i 100 mikroliter förvärmd hybridisering buffert som innehåller sonden cocktail. Prover hybridiseras vid 55 ° C i 30 min på ett värmeblock eller annan lämplig inkubationstid station (Material tabell), följt av tillägg av 500 mikroliter förvärmd tvätt buffert. Som med tejp-bundet prover, kan dessa prover formellt tvättas i upp till 30 min med ytterligare inkubation vid 55 ° C i denna tvättbuffert med intermittent vortexa. Alternativt kan proven noggrant vortexed efter tillägg av 500 mikroliter förvärmd tvätt buffert, följt av omedelbar avverkning för analys (nedan).
6. Som en förberedelse för detektion av Salmonella spp.. via flödescytometri är vätskeytan miniculture prover centrifugeras ner vid 2000 xg under 5 min, är supernatanten kasseras och proverna suspenderade i 300 mikroliter rumstemperatur (~ 25 ° C) PBS. Om proverna kräver transport till en avlägsen anläggning, eller om en försening väntas mellan hybridisering och analys, kan proverna förvaras i kylskåp eller hållas på is före analys. Alternativt kan prover överföras till cell lagring buffert (50:50 blandning av PBS och absolut etanol) och hålls vid -20 ° C i upp till en vecka utan märkbara förluster i probe-tilldelats fluorescens (Bisha och Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Detection

1. För on-tape detektion av Salmonella spp.. via fluorescensmikroskopi, är direkt-till-band eller fast fas anrikning prover overlayed med ~ 10 mikroliter Vectashield H-1200 monteringsmedium innehåller den nukleära motfärg 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), monterad med ett täckglas, sedan inkuberas i mörker i 10 min.
2. Immersionsolja placeras på omslaget slip, och prover undersökas med en hög förstoring olja objektiv (63x eller 100x). Den DAPI filter används för att få provet i fokus, är mikroskop sedan om till lämpligt filter (grön eller röd, beroende på vilken färg som används till slutet märka sonder) och celler Salmonella poängsätts visuellt enligt deras fluorescens (Siffror 2 och 3).
3. För cytometrisk detektering av flytande prover ytan miniculture kan olika instrument användas, beroende på lokal tillgänglighet. I vårt labb är PBS-suspenderade prov överfördes till 5 botten mL runda Provtagningsrör (BD Falcon) och undersöktes med hjälp av en FACSCanto flödescytometer med excitation vid 647 nm (Material tabell). För berikat prover som innehåller ett stort antal av det totala bakterier, är "lågt flöde" inställningen (10 mikroliter min ^-1) används och 5,000-50,000 händelser samlas in. Data analyseras med FlowJo programvara (version 8.8.6, Tree Star, Inc., Ashland, OR) eller annan lämplig programvara för analys (Figur 4, paneler A och B).

6. Representativa resultat

Figur 1. Användning av självhäftande tejp för provtagning av Salmonella spp.. från ytan av ett konstgjort förorenade tomat.

Figur 2. Typiska resultat för direkt-till-band provtagning och FISH detektion av Salmonella Typhimurium ATCC 14.028 från ytan av en tomat (100 x olja mål). En två-sond cocktail av Texas Red-märkta prober (Sal3/Salm-63) användes att märka dessa celler.

Figur 3. Microcolonies av Salmonella Typhimurium ATCC 14.028 bildas på ytan av xylos Lysine Tergitol-4 (XLT-4) agar efter en 8 h på-band anrikning vid 37 ° C. Den initiala inokulat provtogs från ytan av ett konstgjort förorenade tomat. Fast fas anrikning ökar antalet celler som finns för att upptäcka och ökar också cellulära rRNA innehåll.

Figur 4. Användning av tejp för provtagning av S. enterica serovar Typhimurium från ytan av ett konstgjort förorenade tomat, följt av direkt analys via fisk och flödescytometri (panel A) eller efter 5 h icke-selektiva vätskeytan miniculture anrikning i en perfusion kammare fylld med 500 mikroliter trypticase Soy Broth (panel B ).

Discussion

Enkla och snabba metoder för detektion av patogener på producera ytor kan bidra till att mildra livsmedelsburna sjukdomar genom att ge snabb och genomförbara uppgifter. Tejp-baserade urvalsmetoder har använts i miljö-, livsmedels-och kliniska mikrobiologi sedan 1950-talet och innebär pressning av "Scotch"-stil tejp till ytor för avskiljning av mikroorganismer, följt av direkta mikroskopisk undersökning eller överföring av anhängare mikroorganismer till fast media för tillväxt (Barnetson & Milne, 1973, Edwards & Hartman, 1952; Evancho et al, 2001;. Fung et al, 1980;. Lakshmanan & Schaffner, 2005; Langvad, 1980). En ny modifiering beskrev kombinationen av bandbaserad provtagning med fluorescens in situ hybridisering (FISH) för kultur-oberoende analys av mikroorganismer kolonisera de ytor av sten monument (La Cono & C. Urzì, 2003). Vi har tillämpat ett liknande tillvägagångssätt för snabb provtagning och detektion av Salmonella finns på färskvaror, bland annat tomater, spenat och jalapeño paprika (Bisha och Brehm-Stecher, 2009a). Tejp kan användas för att avlägsna celler från dessa livsmedel och prover kan sedan bearbetas för fiskar och visas via fluorescensmikroskopi. På detta sätt kan så få som 10 ³ CFU cm ^-2 Salmonella (detektionsgränsen för mikroskopi baserade metoder) kan upptäckas på färskvaror inom ~ 1,5 till 2 timmar Alternativt kan korta (8 h) fast fas anrikningsgrad utföras genom att placera cellen laddade tejp nedåt på selektiv agar, och den resulterande microcolonies upptäckts av FISH. Genom att lägga bandet med ≤ 500 mikroliter flytande medier, kan tejpa ingick i urvalet Salmonella celler tas bort och upptäcks direkt efter fiska med flödescytometri (Figur 4, panel A). Kort inkubationstid (~ 5 h) av dessa icke-selektiva flytande minicultures möjliggör betydande anrikning av bakterier, med salmonella celler lätt att upptäcka i komplexa blandningar av målarter och icke målarter celler efter FISH (Figur 4, panel B). Sammantaget våra resultat visar att detta tillvägagångssätt ger en ny metod för utvinning, presentation och identifiering av specifika bakterier på tomater och andra färskvaror. Även om vi har beskrivit användning av DNA-baserade prober här, är det troligt att detta tillvägagångssätt även kan utökas till att omfatta alternativa sond kemier, såsom peptid nukleinsyror (PNAS), där salmonella-specifika prober har också beskrivits (Almeida et al., 2010).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used