Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung gefolgt

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für Klebeband-basierte Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen, durch on-tape-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für die schnelle Kultur-unabhängigen Nachweis von Salmonella spp. Cell-geladenen Bänder können auch verdeckt auf Selektivagar für Festphasen-Anreicherung gelegt werden, bevor die Erkennung. Alternativ kann mit geringem Volumen Flüssigkeit Anreicherungen (Flüssigkeitsoberfläche miniculture) auf der Oberfläche des Bandes in nicht-selektiven Brühe durch FISH und Analyse über die Durchflusszytometrie gefolgt durchgeführt werden. Um zu beginnen, sterile Klebeband ist in Kontakt mit frischen Produkten gebracht wird, wird sanfter Druck angewandt, und das Band entfernt wird, physisch Extrahieren Mikroben anwesend auf diesen Flächen. Tapes sind klebrig-Seite nach oben auf Objektträger aus Glas montiert und in der Stichprobe Zellen werden mit 10% igem Formalin (30 min) und entwässert mit einem abgestuften Ethanol-Reihe (50, 80 und 95%; 3 min jeder Konzentration) festgelegt. Als nächstes Zelle aufgeladen Bänder werden mit Puffer mit einem Salmonella-gezielte DNA-Sonde Cocktail gesichtet und hybridisiert für 15 bis 30 min bei 55 ° C, gefolgt von einer kurzen in einem Waschpuffer, um ungebundene Sonde zu entfernen spülen. Adhärente sind FISH-markierten Zellen werden dann mit den DNA-Farbstoff 4 ',6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) gegengefärbt und die Ergebnisse betrachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für Festphasen-Anreicherung, sind Zell-geladenen Bänder Gesicht nach unten auf einen geeigneten selektiven Agar-Oberfläche gelegt und inkubiert, um in situ Wachstum von Salmonella Mikrokolonien durch FISH und Mikroskopie verfolgt, wie oben beschrieben zu ermöglichen. Für flüssige Oberfläche miniculture sind Zell-geladenen Bänder klebrigen Seite nach oben und ein Silikon Perfusionskammer angewendet wird, so dass das Band und Objektträger bilden den Boden einer wasserdichten Kammer, in die ein kleines Volumen (≤ 500 ul) von Trypticase Soy Broth (TSB) wird eingeführt. Die Einlassöffnungen sind versiegelt und die Kammern sind bei 35 inkubiert - 37 ° C, so dass das Wachstum-basierte Amplifikation von Tape-extrahierten Mikroben. Nach der Inkubation Einlasskanäle entsiegelt worden sind, Zellen abgelöst und unter kräftigem wieder gemischt und her Pipettieren geerntet durch Zentrifugation und in 10% neutral gepuffertem Formalin. Schließlich sind die Proben hybridisiert und untersucht per Durchflusszytometrie, um das Vorhandensein von Salmonella spp offenbaren. Wie hier beschrieben, können unsere "Band-FISH"-Ansatz bietet eine einfache und schnelle Probenahme und Nachweis von Salmonellen auf Tomaten Oberflächen. Wir haben auch diesen Ansatz für die Probenahme andere Arten von frischen Produkten, einschließlich Spinat und Chilischoten verwendet.

Protocol

1. Oberflächenproben mit Sterile Klebeband

1. Wählen Sie ein Band für die Probenahme zu verwenden. Die im Handel erhältlichen Fungi-Tape oder Con-Tact-It Probenahme Bänder sind steril und speziell verpackte für Benutzerfreundlichkeit. Allerdings haben wir festgestellt, dass transparent (optisch klar) generische Büro Band kann ebenfalls verwendet werden.
2. Verwenden Sie einen Permanent-Marker auf 1 cm ² Plätze auf der nicht-klebrige Seite eines 10 cm Stück Klebeband (ein Papier-Vorlage verwendet werden kann) zu zeichnen. Dies wird als visuelle Hilfe für die Feststellung, welcher Teil des Bandes verwendet wurde, um die Lebensmittel-oder Umweltproben Oberfläche Probe dienen.
3. Form eines "C"-förmigen Schleife der Band, mit der klebrigen Seite nach der Fläche in die Stichprobe. Um dies zu tun, halten Sie die klebrigen Enden mit dem Daumen und Mittelfinger und die Position der Zeigefinger gegen die gezogenen Quadrat auf der Rückseite (nicht-klebrige Seite) des Bandes (Abbildung 1).
4. Legen Sie das Band auf der Oberfläche abgetastet und drücken Sie vorsichtig den markierten Bereich an die Oberfläche. Ohne die Freigabe der Ränder des Bandes, verwenden Sie den Zeigefinger, um sicherzustellen, dass die Klebeseite des Bandes in vollem Kontakt mit der Probenoberfläche kommt, blasenfrei.
5. Mit einer gleichmäßigen Bewegung, ziehen Sie das Band von der Probe entfernt, körperlich Extrahieren Oberflächen-gebundenen Mikroben. Befestigen Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Glasobjektträger mit generischen transparent Büro Band. Stellen Sie sicher, die richtige Spannung / Dehnung des Bandes, so dass eine ebene, nicht faltig Oberfläche entsteht. Dies wird dazu beitragen minimieren Probleme mit Deformation / Eisstock des Bandes bei der anschließenden Erwärmung während der Hybridisierung.

2. Solid-Phase-Enrichment und Flüssigkeitsoberfläche Miniculture

1. Solid-Phase-Anreicherung ist, indem das Band der Vorderseite nach unten auf Xylose-Lysin-Tergitol 4 (XLT-4)-Agar-Platten, so dass die Proben-Zellen in direktem Kontakt mit der Agar-Oberfläche platziert werden durchgeführt. Die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes ist bündig mit der Agar-Oberfläche und ein Ende des Bandes lose an der Seitenwand der Petrischale geklebt um ein leichtes Entfernen des Bandes aus der Agar-Oberfläche folgende Bereicherung zu erleichtern.
2. Die Platten werden invertiert (um Kondensation zu vermeiden) resuspendiert und bei 35 bis 37 ° C, um eine ausreichende Wachstum von Salmonella spp ermöglichen. Die Länge der Inkubationszeit benötigt, um die Zellen auf ein nachweisbares Niveau bereichern wird bei der erstmaligen Kontamination mit Salmonellen abhängen. Wir haben ausgezeichnete Mikrokoloniebildung aus niedrigen anfänglichen Inokula beobachtet nach 8 h Anreicherung.
3. Nachdem die gewünschte Anreicherung Zeitraum, öffnen Sie die Agar-Platte. Das Band wird seine Klebrigkeit während der Inkubation zu behalten. Drücken Sie das Band vor dem Agar mit dem Zeigefinger, um die Rückforderung von Mikrokolonien auf der Band-Agar-Schnittstelle gebildet zu gewährleisten. Fassen Sie das Klebeband von der Kante an der Wand der Petrischale und entfernen Sie sie mit einem langsamen, gleichmäßigen Bewegung. Montieren Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 beschrieben. Fahren Sie mit "Fixation und Dehydration" step unten.
4. Für flüssige Oberfläche miniculture, durch die Befestigung des Bandes für die Probenahme auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 oben beschrieben, verwendet beginnen. Dann bedecken Sie die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes mit einer nicht sterilen Silikon Perfusionskammer (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), bilden eine geschlossene Kammer, deren Boden der Zelle geladenen Band besteht, nach oben. Fest, aber sanft drücken Sie die Kammer in Ort, um eine wasserdichte Abdichtung zu gewährleisten.
5. Mit einem flexiblen Gelbeladung Pipettenspitze, Transfer ≤ 500 ul Trypticase Soy Broth oder einem anderen geeigneten Anreicherungsmedium durch eine der Kammer ist klein Einlasskanäle. Seal beide Ports mit transparenten Büro-Band, um Verdunstung und inkubieren bei 35 -37 ° C zu verhindern, wie für eine ausreichende Anreicherung erforderlich. Obwohl alle Operationen nach guter Probenahme und Handhabung Praktiken durchgeführt werden sollte, ist die Sterilität von Port-Dichtband oder Perfusionskammern nicht während der Flüssigkeitsoberfläche miniculture erforderlich. Die Kombination von FISH und Durchflusszytometrie ermöglicht eine klare Diskriminierung von Salmonella spp. von Nicht-Ziel-Bakterien, die vorhanden sein, wobei der größte Anteil der Nicht-Ziel-Flora erwartet von der Probe selbst kommen können. Fahren Sie mit "Fixation und Dehydration" step unten.

3. Fixation und Dehydration

1. Für die direkte Entnahme von Oberflächenproben oder für feste Phase Anreicherung von Salmonella spp. auf XLT-4-Agar, führen on-tape Zellfixierung für 30 min bei 25 ° C durch das Abdecken der Probe Kontaktfläche mit 500 ul 10% neutral gepuffertem Formalin.
2. Discard Fixativ in einem verschließbaren Behälter (unter einer chemischen Haube um die Exposition gegenüber irritierenden / giftige Dämpfe zu minimieren).
3. Entwässern in einem Ethanol-Reihe (50%, 80% und 95%, 300 ul / 3 min jeder Konzentration). Fahren Sie mit "Hybridisierung" step unten.
4. Zur Fixierung von 500 ul Flüssigkeitsoberfläche miniculture Probes sind Perfusionskammern entsiegelt worden sind, und eine flexible Gel-loading Pipettenspitze wird verwendet, um die enrichate extrahieren. Schnelle rauf und runter Pipettieren verwendet wird, um sicherzustellen, effektive Entfernung der übrigen Band-gebundenen Zellen.
5. Anschließend wird die gesamte 500 ul miniculture Lautstärke auf ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und abzentrifugiert bei 2.000 xg (5 min). Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30-60 s gevortext, dann in ein gleiches Volumen 10% resuspendiert neutral gepuffertem Formalin. Die Zellen werden für 30 min bei 25 ° C fixiert
6. Als nächstes Fixativ entfernt und die Probe wird in Zelle Speicher-Puffer, wie folgt. 60 s, die in einem gleichen Volumen von 50% nicht-denaturiertem Ethanol-50% resuspendiert Phosphat-- Die Probe wird bei 2.000 xg (5 min, 25 ° C) den Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30 gevortext gesponnen Kochsalzlösung. Fixierten Zellen können unbegrenzt gelagert werden (in Jahren) bei -20 ° C. Hinweis: Wenn Flüssigkeiten verändert werden (zum Beispiel bei der Einführung eines Fixativ oder verschiedene Puffer), ist es wichtig, gründlich resuspendieren (mit Vortex) das Zellpellet in einem minimalen Anteil (~ 10 bis 20 ul) des "outgoing" flüssigen Systems . Dadurch wird verhindert, Verklumpung und sicherzustellen, dass auch Suspensionen von einzelnen Zellen erhalten werden. Fahren Sie mit "Hybridisierung" step unten.

4. Hybridisierung

1. Bereiten Hybridisierung / Waschpuffer mit der kommerziellen Molekularbiologie-Grade-Lösungen hingewiesen in Werkstoff-Tabelle. Finale Pufferkomponente Konzentrationen sind 0,7 M NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% Natriumdodecylsulfat, machte bis zur endgültigen gewünschte Lautstärke mit molekular-Grad Wasser und unter Verwendung einer 0,22 um Spritze oder eine Tasse Filter. Die gleichen Puffer, ohne den Zusatz von Sonden (siehe unten) wird als Waschpuffer verwendet. Vorheizen Hybridisierung und Waschpuffer bis 55 ° C.
2. Add fluoreszenzmarkierten Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') und Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) Oligonukleotid-Sonden (Werkstoff-Tabelle) vorgeheizt Hybridisierungspuffer. Insgesamt Sonde Konzentration von 5 ng ul ^-1 verwendet (z. B. 2,5 ng ul ^-1 jede Sonde; Bisha und Brehm-Stecher, 2009a).
3. Für Direct-to-Tape-und Festphase Bereicherung Proben, überlagern die Vorlagen Probe Kontaktfläche des Bandes mit 300 ul Hybridisierungspuffer mit der Sonde Cocktail und hybridisieren Band-gebundenen Zellen in einer feuchten, verschlossenen Inkubationskammer Satz bis 55 ° C. Wenn eine direkte Kontakt-Inkubator wie der Slide Moat Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden die Proben für 15 min hybridisiert und> 20 Objektträger können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn ein Dreh-style Hybridisierungsofen wie der Bambino-Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden Folien in 50 mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für die Hybridisierung, eine Folie pro Röhrchen gegeben. Da die Wärmeübertragung nicht direkt, werden diese Proben über einen längeren Zeitraum (bis zu 30 min) hybridisiert.
4. Nach der Hybridisierung werden die Objektträger entfernt und die Sonde-haltigen Hybridisierungspuffer Overlay wird verworfen. Folien werden dann entweder kurz und sanft mit vorgewärmten Waschpuffer durch Pipettieren einem kleinen Volumen Puffer über eine geneigte Rutsche (3 Spülungen von 300 ul jeweils) gespült, oder formal gewaschen (bis zu 30 min) mit entweder einer Überlagerung von vorgewärmtem Waschpuffer oder Eintauchen in eine 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmten Waschpuffer. Nach unserer Erfahrung ist, obwohl eine formelle waschen verbesserten Ergebnissen (weniger Dunst von ungebundenen Sonde) bieten wird, spülen Sie einfach ausreichend für eindeutige Nachweis von Salmonella spp. Anschließend werden Dias an der Luft getrocknet, bevor er nach der "Detection" Schritt unten.
5. Die Hybridisierung der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben wird durch Abzentrifugieren Proben (frisch fixiert oder auf Lager gehalten Puffer bei -20 ° C) für 5 min bei 2.000 xg durchgeführt, gefolgt von kräftigem Vortexen des Pellets und Resuspendierung in 100 ul vorgewärmte Hybridisierungspuffer mit die Sonde Cocktail. Die Proben werden bei 55 hybridisiert ° C für 30 min auf einem Heizblock oder einem anderen geeigneten Inkubationszeit Bahnhof (Werkstoff-Tabelle), durch Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer folgte. Wie bei Band-gebundenen Proben, können diese Proben formal gewaschen werden bis zu 30 min mit weiteren Inkubation bei 55 ° C in diesem Waschpuffer mit Intervallschaltung Vortexen. Alternativ können die Proben gründlich nach Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer verwirbelt werden, gefolgt von sofortiger Ernte für die Analyse (unten).
6. In Vorbereitung für den Nachweis von Salmonella spp. über Durchflusszytometrie, Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben bis auf 2.000 xg für 5 min gesponnen werden, der Überstand wird verworfen und die Proben werden in 300 ul Raumtemperatur resuspendiert (~ 25 ° C) PBS. Wenn Proben Transport benötigen, um eine entfernte Anlage, oder wenn eine Verzögerung zwischen Hybridisierung und Analyse zu erwarten ist, können die Proben im Kühlschrank gelagert werden oder statt auf dem Eis vor anaLyse. Alternativ können die Proben zu Zelle Pufferspeicher (50:50-Mischung aus PBS und absolutem Ethanol) übertragen werden und hielt bei -20 ° C bis zu einer Woche ohne nennenswerte Verluste in Sonde-verliehenen Fluoreszenz (Bisha und Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Erkennung

1. Für on-tape Nachweis von Salmonella spp. via Fluoreszenzmikroskopie werden direct-to-Tape oder fester Phase Bereicherung Proben mit ~ 10 ul Vectashield H-1200 Montage-Medium mit den nuklearen Gegenfärbung 4 ',6-Diamino-2-phenylindole (DAPI), mit einem Deckglas montiert überlagert, dann im Dunkeln für 10 min inkubiert.
2. Immersionsöl auf das Deckglas gelegt, und die Proben werden unter Verwendung eines High-Vergrößerung Öl-Objektiv (63x oder 100x). Die DAPI-Filter verwendet wird, um die Probe in den Fokus zu bringen, das Mikroskop wird dann an den entsprechenden Filter (grün oder rot, je nach dem verwendeten Farbstoff zu Ende-Label der Sonden) und Salmonella-Zellen abgeschaltet werden visuell nach ihrer Fluoreszenz (erzielte Fakten 2 und 3).
3. Für durchflusszytometrischen Nachweis der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben können verschiedene Instrumente verwendet, je nach lokaler Verfügbarkeit werden. In unserem Labor sind PBS suspendiert Proben zu 5 ml Rundboden Probenahme-Röhrchen (BD Falcon) überführt und unter Verwendung eines FACSCanto Durchflusszytometer mit einer Anregung bei 647 nm (Werkstoff-Tabelle). Für angereicherten Proben mit hohen Zahl von insgesamt Bakterien, ist die "Low-Flow-Rate"-Einstellung (10 l min ^-1) verwendet und 5.000-50.000 Ereignisse gesammelt werden. Daten werden mit Hilfe FlowJo Software (Version 8.8.6, Baum Star, Inc., Ashland, OR) oder andere geeignete Analyse-Software (Abbildung 4, Platten A und B).

6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von Salmonella spp. von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten.

Abbildung 2. Typische Ergebnisse für direct-to-Tape-Probenahme-und FISH Detektion von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 von der Oberfläche der Tomaten (100 X Öl-Objektiv). Ein Zwei-Sonde Cocktail aus Texas Red-markierten Sonden (Sal3/Salm-63) wurde verwendet, zur Kennzeichnung dieser Zellen.

Abbildung 3. Mikrokolonien von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 auf der Oberfläche der Xylose-Lysin-Tergitol-4 (XLT-4)-Agar nach 8 h on-tape Bereicherung bei 37 ° C. Die anfängliche Inokulum von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten abgetastet wurde gebildet. Solid-Phase-Anreicherung steigt die Zahl der verfügbaren Zellen für die Detektion und verbessert auch die zelluläre rRNA Inhalt.

Abbildung 4. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von S. enterica Serovar Typhimurium von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten, durch direkte Analyse über FISH und Durchflusszytometrie (Panel A) oder nach 5 h nicht-selektiven Flüssigkeitsoberfläche miniculture Bereicherung in einer Perfusionskammer mit 500 ul Trypticase Soy Broth (Panel B gefüllt, gefolgt ).

Discussion

Einfache und schnelle Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern auf Oberflächen erzeugen kann zu einer Abschwächung Lebensmittelinfektionen durch rechtzeitige und verwertbare Daten. Klebeband-basierte Methoden zur Probenahme in Umwelt-, Klinik-und Lebensmittel-Mikrobiologie, seit den 1950er Jahren verwendet und beinhalten Drücken von "Scotch"-Stil Band auf Oberflächen zur Entfernung von Mikroorganismen, gefolgt von direkten mikroskopischen Untersuchung oder die Übertragung von anhaftenden Mikroorganismen zu festen Medien für Wachstum (Barnetson & Milne, 1973; Edwards & Hartman, 1952; Evancho et al, 2001;. Fung et al, 1980;. Lakshmanan & Schaffner, 2005; Langvad, 1980). Eine aktuelle Änderung beschrieb die Kombination von Tape-basierten Stichproben mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für die Kultur-unabhängige Analyse von Mikroorganismen besiedeln die Oberflächen der Steindenkmäler (La Cono & C. Urzi, 2003). Wir haben einen ähnlichen Ansatz für eine schnelle Probenahme und Nachweis von Salmonellen auf frische Produkte, einschließlich Tomaten, Spinat und Paprika Jalapeño (Bisha und Brehm-Stecher, 2009a) angewandt. Klebeband kann verwendet werden, um Zellen aus diesen Lebensmitteln und Proben zu entfernen können dann für Fisch verarbeitet und angezeigt werden via Fluoreszenzmikroskopie. 2 h - Auf diese Weise kann so wenig wie 10 ³ CFU cm ^-2 Salmonella (die Nachweisgrenze für die Mikroskopie-Methoden) auf frische Produkte innerhalb ~ 1,5 detektiert werden Alternativ können kurze (8 h) Festphase Bereicherungen, indem Sie die Zelle aufgeladen Band Gesicht nach unten auf Selektivagar durchgeführt werden, und die daraus resultierenden Mikrokolonien durch FISH nachgewiesen werden. Durch die Überlagerung der Band mit ≤ 500 ul flüssigen Medien können Band-Proben Salmonella-Zellen getrennt und detektiert werden direkt nach FISH mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 4, Panel A). Kurze Inkubation (~ 5 h) dieser nicht-selektiven flüssigen Minikulturen ermöglicht erhebliche Anreicherung von Bakterien, die mit Salmonella-Zellen leicht in komplexe Mischungen von Ziel-und Nicht-Ziel-Zellen nach FISH (Abbildung 4, Panel B) nachgewiesen. Gemeinsam zeigen unsere Ergebnisse, dass dieser Ansatz eine neue Methode zur Extraktion, Präsentation und Identifikation von spezifischen Bakterien auf Tomaten und anderen frischen Produkten bietet. Obwohl wir die Verwendung von DNA-Sonden hier beschrieben habe, ist es wahrscheinlich, dass dieser Ansatz kann auch erweitert, um alternative Sonde Chemikalien, wie Peptid-Nukleinsäuren (PNA), für die Salmonellen-spezifischen Sonden auch beschrieben worden sind (Almeida erweitert werden et al., 2010).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used