Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الإمكانيات الغشاء ، الردود متشابك ، الدارات العصبية ، تعديل العمليات العصبية والأنسجة العضلية باستخدام جراد البحر : تمارين مختبر طالبة

Published: January 18, 2011 doi: 10.3791/2322
Automatic Translation
*1, *1, *2, *1
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

التجارب تثبت نهج سهلة للطلاب لاكتساب الخبرة في دراسة بنية العضلات ، والاستجابات متشابك ، وآثار التدرجات ايون ونفاذية الغشاء على إمكانات. أيضا ، يتم تقديم CNS الحسية والحركية للعضلات حلبة لإظهار وسيلة لاختبار آثار المركبات على الدارة العصبية.

Abstract

الغرض من هذا التقرير هو المساعدة في تطوير فهم للآثار الناجمة عن التدرجات ايون عبر الغشاء البيولوجي. جانبين أن التأثير المحتمل خلية غشاء والتي نتناولها في هذه التجارب هي : (1) تركيز أيون + K من على السطح الخارجي للغشاء ، و (2) نفاذية الغشاء لأيونات معينة. عضلات البطن هي الباسطة جراد البحر في التجمعات مع بعض المقويات يجري (بطيء) وغيرها من طوري (السريع) في هذه الظواهر الفسيولوجية والبيوكيميائية ، وكذلك في بنيتها ، والخلايا العصبية الحركية التي يعصب العضلات هذه تختلف في خصائصها الفنية في المقابل. نحن نستخدم هذه العضلات كذلك ، منشط العضلات السطحية المثنية البطن لإظهار الخصائص في نقل متشابك. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا إدخال CNS الحسية والحركية العصبية للعضلات حلبة لإظهار تأثير الحواس جليدية فضلا عن تأثير neuromodulators على جوانب معينة من الدارة. مع التقنيات التي تم الحصول عليها في هذه العملية ، يمكن للمرء أن يبدأ للرد على الأسئلة الكثيرة المتبقية في التحضيرات تجريبية أخرى ، وكذلك في التطبيقات الفسيولوجية المتعلقة بالطب والصحة. لقد أثبتنا جدوى الاستعدادات اللافقارية نموذج لمعالجة المسائل الأساسية ذات الصلة لجميع الحيوانات.

Protocol

1. مقدمة

أهداف هذه المناورات هي مختبر لفهم خصائص الأغشية منفعل ، وأساس الأيونية من إمكانات غشاء الراحة ، وأساليب لقياس القدرة الغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تلوين الأنسجة والعضلات ، والتي يمكن استخدامها لتعليم بنية العضلات. أيضا ، يتم استخدام نوعين مختلفين من الاستعدادات لشرح تشريح خصائص انتقال متشابك في المجموعات العضلية المختلفة. كما يستخدم كامل الحسية وسط الجهاز العصبي (CNS) ، العصبون الحركي للعضلات البطن الدائرة في جراد البحر لتقديم تمهيدا لدراسة الحواس وتأثير neromodulators والعصبية على جوانب الحلبة.

الجزء الأول من هذا التقرير ، على النهج المستخدمة لقياس جهد الراحة وغشاء نفوذ + K خارج الخلية على غشاء المحتملة. وسوف نقدم أيضا بنية العضلات. في الجزء الثاني من هذه العملية ، فإننا نقدم وسائل مختلفة لقياس ردود متشابك من أنواع مختلفة من الوصلات العصبية والعضلية (NMJs). التمرين الأول يستخدم عضلات البطن وجراد البحر الباسطة الثاني يستخدم عضلات البطن المثنية السطحية. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدم الدائرة العصبية (الحبل العصب البطنية من جراد البحر مع المدخلات والمخرجات الحسية الحركية) التي هي سهلة للحفاظ على ، والتي يمكن أن تستخدم للتدريس وكذلك للبحث في جوانب مختلفة من الجهاز العصبي المركزي حسية الحركية العصبية العضلية الدائرة. بعد الانتهاء من شرح التدريبات الأولية ، نقدم فسيولوجيا NMJs والدوائر الجهاز العصبي المركزي.

ويمكن التدرج ايون عبر غشاء بيولوجي يؤدي إلى اختلاف محتمل. لخلية في راحة ، ويعرف هذا الفرق في الشحنة الكهربائية عبر غشاء الخلية والمحتملة للخلية غشاء يستريح. هناك نوعان من العوامل الرئيسية التي سنتطرق إلى أن التأثير المحتمل غشاء الخلية. الأول هو تركيز أيون على جانبي الغشاء. والثاني هو الأيونية نفاذية الغشاء. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه في الخلية الحية هناك عددا من أيونات مختلفة مع تركيزات مختلفة من داخل وخارج الخلية. الأيونات الرئيسية سنتطرق هي الصوديوم (نا +) والبوتاسيوم (K +) وكلوريد (CL -). الكميات وحركة هذه الأيونات عبر غشاء العضلة يحدد المحتملة الغشاء. من هذا الأساس ، يمكننا ان نتناول امكانات الكهربائية التي لوحظت خلال الإثارة الكهربائية وتثبيط غشاء من ردود متشابك ودراسة آثار العوامل الدوائية. يمكننا أيضا بناء النماذج البيوفيزيائية لتمثيل هذه العمليات إلى مفاهيم اختبار تجريبي (روبنسون وآخرون ، 2010).

استخدام الزجاج الشعرية microelectrodes تصاريح تسجيل الامكانيات الغشاء. يمكن إدراج القطب من خلال غشاء الخلية دون أضرار ، وتوفير رأس صغير بما فيه الكفاية ويمكن الحصول على قياس دقيق لإمكانات عبر الغشاء. تقنية ينطبق بشكل خاص على الخلايا الكبيرة ، التي هي أقل عرضة للتلف من قبل الإدراج من القطب داخل الخلايا. هذه هي واحدة من التقنيات الأساسية في علم وظائف الأعضاء.

الحفاظ على توازن الصوديوم والبوتاسيوم + + عبر الغشاء بواسطة مضخة أتباز نا - K في ظل الظروف الفسيولوجية. في ظل ظروف طبيعية التحركات المضخة ، في المتوسط ​​، وثلاثة نا + الخروج من الخلية واثنين + K في الخلية. كملاحظة جانبية ، حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1997 لجعل هذا الاكتشاف مرة أخرى في أواخر عام 1950. تم الحصول على أساسيات اكتشاف من الابحاث التي تستخدم المحاور من السلطعون (Skou ، 1965 ، 1998).

كما تعتبر هذه المضخة كهربي كما أن لديها القدرة على ضخ أكبر عندما يتم استقطابها الغشاء (Skou ، 1989a ، ب). في العديد من الخلايا ، ومضخة يسرع عند تنشيط كهربائيا خلية بواسطة الاستقطاب.

ويمكن أيضا نقل البوتاسيوم البوتاسيوم من خلال قنوات "تسرب" في حين أن الخلية في حالة الراحة. بسبب هذه القنوات تسرب البوتاسيوم ، وغشاء الخلية في بقية أكثر نفاذا إلى أيونات البوتاسيوم بدلا من الأخرى. وهكذا ، يمكن للخلية غشاء يستريح هو أقرب إلى إمكانية التوازن لأنه لمن البوتاسيوم الصوديوم. ويمكن بعد ذلك إمكانات غشاء يستريح يتم فحص لمعرفة إذا كان يعتمد على توازن محتملة البوتاسيوم.

1) تقلب العضلات

ألياف العضلات القشريات اظهار قدر أكبر من التباين من المزايا الهيكلية ، والخصائص الكهربائية وخصائص الغشاء مقلص من القيام ألياف العضلات الفقاريات. يتم تعديل ألياف العضلات في طوري القشريات للنشل من نوع الانقباضات. فهي تتميز قسيم عضلي أطوال قصيرة (2-4 ميكرون) ، رقيقة ، على التوالي Z - خطوط ، وهي نسبة منخفضة من رقيقة الى myofilaments سميكة ، وأنظمة متطورة للT - الأنابيب والهيولى العضليةشبكية. قد طوري أغشية الألياف العضلية توليد إمكانات عمل متدرج أو كل شيء أو لا شيء. منشط ألياف العضلات ، من جهة أخرى ، يتم تعديل لصيانة طويلة من التوتر. غالبا ما يكون قسيم عضلي أطوال من 10 إلى 15 ميكرون ، سميكة ، وخطوط متموجة Z ، نسبة عالية من رقيقة الى myofilaments سميكة ، وأنظمة أقل تطورا من T - الأنابيب وشبكية الهيولى العضلية. منشط أغشية الألياف العضلية في كثير من الأحيان متعذر الاستثارة كهربائيا ، أو أنها قد تنتج الاستجابات الكهربائية متدرج ("المسامير متدرج"). تم العثور على مجموعة واسعة من أنواع الألياف وسيطة في عضلات القشريات.

2) المعادلات

المعادلات التي تستخدم عادة لتحديد إمكانية وجود التوازن الأيوني غشاء المحتملة والراحة هي معادلة نرنست وغولدمان هودجكين - كاتز المعادلة (GHK) على التوالي. هذا تمييز مهم بين الاثنين هو المعادلات التي تستخدم المعادلة نرنست واحدة لكل أيون معينة لتحديد الإمكانات لذلك التوازن الأيوني ، في حين يتم استخدام المعادلة GHK لتحديد إمكانية الراحة من خلال النظر في نفاذية الأيونات متعددة والتدرجات الخاصة بهم عبر غشاء الخلية (نرنست ، 1888 ، 1889 ؛ غولدمان ، 1943 ؛ هودجكين وهكسلي ، 1952 ؛ هودجكين وآخرون ، 1952 ؛. هودجكين وكاتز ، 1949 ؛ انظر هيلي ، 1992).

ويعتبر عموما معادلة نرنست لأيونات عبر غشاء توليد القوة الدافعة الكهربائية عادة كما هو موضح على النحو التالي :

V = (RT / ZF) LN ([س] من أصل / [س] في)

X = أيون ذات الاهتمام
V = الجهد التوازن للأيون X عبر الغشاء
R = ثابت الغاز [8،314 J / (مول • K)]
T = درجة الحرارة المطلقة [كلفن]
Z = التكافؤ في الأيون
F = ثابت فاراداي [9.649 × 10 4 C / مول]

لايون في K + 20 درجة مئوية ، والتحول من سطر إلى تسجيل 10 مع ملء الثوابت ، ويصل الى واحد على العنوان التالي :

المحتملة = 58 سجل ([K في] / [K أصل]) ؛ وأعرب في بالسيارات

دعونا نفترض أن فقط + K هو نفيذ قبل نشرها. [K في] هو التركيز على K + داخل الخلية و[K من] هو K + التركيز على السطح الخارجي للخلية.

كتقدير ممارسة [K في]. ______________

تفترض هذه العملية الحسابية ، غشاء المحتملة تعتمد فقط على إمكانية التوازن K +.

نظرا ل[K خارج] = المالحة لاستخدامها هو 5.4 ملم. أيضا ، افترض هو غشاء المحتملة ، 70mV.

المحتملة = 58 سجل ([K في] 5.4 /).

في التجربة سوف نقيس إمكانية خلية غشاء الراحة وتحديد كيفية تأثر ذلك عن طريق تغيير [K أصل]. المنحدر من خط افتراضية المحتملة المتعلقة الغشاء و[K من] هو 58. بعد جمع البيانات عن غشاء المحتملة يستريح في مختلف [K خارج] (تتراوح من 5.4 ملم الى 100 ​​ملم) وسوف نقوم في مؤامرة لاحظ القيم لتحديد ما إذا كان هناك تطابق مع الخط افتراضية. سوف نستخدم متوسط ​​المحتملة غشاء يستريح في الحصول على 5،4 مم [K من] للبدء في خطوط افتراضية ، ولاحظ للمقارنة.

معتبرا أن غشاء يمكن نفاذا إلى واحد أو أكثر في بقية أيون ، وكذلك في مختلف الدول استقطابها ، واحد يستخدم المعادلة GHK أن تأخذ في الاعتبار النفاذية (ف في المعادلة) لأيونات مختلفة. والمعادلة GHK خفض للمعادلة نرنست إذا كان الغشاء غير قابلة للاختراق لايون واحد فقط.

وهنا المعادلة GHK معمم لل+ نا ، K + ، والكلور -- الأيونات :

معادلة

منذ الكلور -- يحتوي على شحنة سالبة ، هو مقلوب على المدى التركيز في هذه المعادلة للداخل والخارج. هذا يسمح ترك Z (ايون تهمة) قبالة.

3) أهداف هذا التمرين

في هذه التجربة سوف نقيس إمكانية غشاء الخلية من جراد البحر العضلات وتطبيق المبادئ المذكورة أعلاه إلى العنوان التالي :

  1. كيفية قياس احتمال غشاء الخلية مع الأدوات المناسبة والتقنية.
  2. نفاذية أيون عضلة غشاء الخلية ، وكيف يساهم في غشاء المحتملة.

    بالإضافة إلى ذلك ، سنقوم بإجراء دراسة أولية للهيكل العضلات :
  3. استخدام بقع لتسليط الضوء على تشريح العضلات في الجانب الظهري للبطن جراد البحر ، والذي يستخدم لإجراء هذه التجارب الكهربية.
  4. فحص الأنسجة من أنواع مختلفة من الألياف العضلية.

في هذا التمرين المختبرات ، وسوف نستخدم عضلات البطن جراد البحر الباسطة. وقد استخدم هذا الإعداد في الماضي لتعليم هذه المبادئ في علم وظائف الأعضاء anد التشريح (اتوود وParnas ، 1968). وقد استخدمنا الكثير من الإجراءات من هذا المصدر وغيره تعديلها لاستيعاب الأجهزة الحالية واستكمال أهداف في ساعة واحدة 3 الطالب فترة المختبر. هذه التدريبات هي الأساس للتجارب الأخرى المستخدمة في فسيولوجيا الحيوان بطبيعة الحال في قسم البيولوجيا في جامعة كنتاكي (مدرس الدكتور RL كوبر ، 2010).

4) لماذا هذا النموذج الحيواني

هناك عدة أسباب وجيهة لاستخدام عضلات البطن الباسطة جراد في هذه التجربة :

  1. جراد البحر وتتوفر عادة ورخيصة نسبيا وسهلة للحفاظ على الأوضاع في المختبر.
  2. تشريح سهلة نسبيا للطلاب تقنيات التعلم تشريح للتحضير حية.
  3. عضلة مستقرة لعدة ساعات في المياه المالحة طبيعية ضئيلة مما يخدم بشكل جيد للطلاب تعلم تقنيات الكهربية. إعداد قوي العضلات إلى حد ما عندما الخارجية [K +] يتم تبديل لفترات زمنية قصيرة.
  4. ويمكن الحصول على استجابات مختلفة متشابك بسهولة من خلال تحفيز الخلايا العصبية الحركية.
  5. الترتيب التشريحية للعضلات الباسطة من السهل أن نستشف ، وبسبب حجمها الكبير نسبيا من السهل الحصول على تسجيلات داخل الخلايا مستقرة.
  6. ويمكن ملاحظة العضلات ونمط تعصيب بسهولة مع تلوين الميثيلين الأزرق. بالإضافة ، يمكن أن تكون خاصة أنواع الألياف العضلية معالجتها بسهولة للالأنسجة لمراقبة هيكل قسيم عضلي.
  7. ليست هناك حاجة بروتوكولات الحيوان في هذا الوقت لتحضير الحيوانات اللافقارية في التجارب المختبرية في العديد من المؤسسات داخل الولايات المتحدة.

2. طرق

1) المواد

  • مقص (1)
  • ملقط (1)
  • أسلاك فضية للسلك الأرض (1)
  • المجهر (1)
  • مسبار كهربائي (1)
  • طبق بتري مع Sylgard في القاع (1)
  • محلول ملحي (1)
  • البوتاسيوم الحلول : 5.4mM (ملحي عادي) ، 10 ، 20 ، 40 ، 80 ، 100 ملي
  • التبييض (كمية صغيرة ، لاستخدام غيض من سلك من الفضة لبناء حج - CL)
  • الزجاج الماصة (1) ، إضافة إلى إزالة وحلول
  • حقنة (1)
  • مكبر للصوت / نظام الحصول على (1)
  • قفص فاراداي (1)
  • المكتبي / المحمول (1)
  • دبابيس تشريح (4)
  • جراد البحر

2) أساليب

2.1) إعداد / تشريح :

  1. وينبغي الحصول على جراد البحر حوالي 60-10 سم في طول الجسم (أو حجم معقول). عقد جراد البحر في الجزء الخلفي من الرأس أو ما يقرب من سنتيمتر واحد من الجزء الخلفي من العين. تأكد من أن مخالب جراد البحر أو فمه لا يمكن الوصول إلى الفرد التعامل مع جراد البحر. (قد تكون وضعت في الثلج المجروش جراد البحر لمدة 5 دقائق لتخدير ذلك قبل قطع رأسه.)
  2. استخدم المقص لإزالة بسرعة كبيرة في الرأس. اجراء خفض نظيفة وسريعة من وراء أعين جراد. التخلص من الرأس والزوائد.
    الشكل 1
    الشكل 1. صورة تظهر موضع خفض لإزالة رئيس جراد.
  3. يمكن إزالة الساقين ومخالب للجراد في هذه المرحلة لتجنب الاصابة. يمكن Stylets على الذكور وswimmerets على كل من الذكور والإناث كما يمكن إزالة (الشكل 2). المقبل ، ومنفصلة في البطن من القفص الصدري. اجراء خفض على طول الغشاء التعبير الذي ينضم البطن والصدر (الشكل 3). حفظ جزء من البطن وجراد البحر والتخلص من القفص الصدري.
    الشكل 2
    الشكل 2 ، والمقص وقطع stylets. ويمكن إزالة هذه من جراد البحر.
    الشكل 3
    الشكل 3. صورة تظهر موضع خفض لإزالة الصدر من البطن.
    الشكل 4
    الشكل 4. إزالة القفص الصدري من البطن. وينبغي أن يتم قطع بطريقة دائرية على طول الخط في الانضمام للقطاعات.
    الشكل 5
    الشكل 5. صورة أعلى البطن مع ويبين swimmeret الزوائد. صورة تظهر أسفل البطن دون الزوائد swimmeret.
  4. مع البطن ، ينبغي إجراء خفض في وعاء على طول الحدود ، وانخفاض الوحشي من كل جانب من البطن. ينبغي الحرص على عدم قطع عميق جدا في جراد البحر. للمساعدة في عملية خفض قذيفة ، ينبغي للقطع مع مقص مشيرا إلى أسفل نحو إهمال الجانب البطني وبزاوية. يتبع النمط الطبيعي للخطوط قذيفة من جراد البحر التي تعمل على طول كل قطعة (الشكل 6).
    الشكل 6الشكل 6. مقصات بزاوية واتبع المحاذاة الطبيعية للقذيفة. لا قطع عميق جدا وتدمير الإعداد. السهم رؤساء نقطة إلى السطر الطبيعية على طول كل قطعة التي ينبغي اتباعها لالتخفيضات.
  5. إزالة جزء من بطني قذيفة. الحرص على عدم تدمير عضلات البطن. استخدام الملقط لإزالة الجزء البطني. عندما تتم إزالة جزء من بطني وعاء ، يمكن أن ينظر كتلة بيضاء من الأنسجة على الجزء العلوي من عضلات المثنية العميقة. ويمكن إزالة هذا النسيج بعناية مع ملقط.
    الشكل 7
    الشكل 7. إزالة جزء من بطني قذيفة بالملقط. سحب ما يصل والعودة على الجزء البطني لإزالة. لا تدمر العضلات البطنية تحت القشرة.
    الشكل 8
    الشكل 8. سحب مرة أخرى على بطني جزء من القشرة التي سيتم التخلص منها.
    الشكل 9
    الرقم 9. قص جزء من بطني إعداد بالمقص وتجاهل.
  6. ويمكن إزالة الجهاز الهضمي ، وهو أنبوب صغير على طول خط الوسط للعضلات المثنية العميقة ، من جراد البحر. قرصة الجزء العلوي من المسالك مع ملقط والجذب بعيدا عن البطن. قطع الجزء السفلي من الجهاز -- في نهاية الذيل. تشريح شطف مع المياه المالحة لضمان النفايات البراز لا تتدخل في الإعداد.
    الرقم 10
    الرقم 10. صورة يظهر إزالة الجهاز الهضمي من التحضير.
  7. استخدام الدبابيس تشريح لضمان الإعداد لطبق بيتري. وينبغي أن يعلق زوايا العلوي والسفلي من أسفل إلى إعداد الطبق. وينبغي أن سكب محلول ملحي في طبق بتري وتغطية إعداد تماما حتى يتم تنفيذ التسجيلات داخل الخلايا.
    هذا يجب أن يكون الطبق تشريح (داو كورننغ) Sylgard الطلاء على القاع (1cm سميكة) بحيث يمكن للحشرات عالقة دبابيس في ذلك.
    واستحم في التحضيرات تشريح جراد البحر المالحة القياسية ، فان الحل من تعديل Harreveld في (1936) ، والتي تتم مع كلوريد الصوديوم 205 ؛ 5.3KCl ؛ 13.5 CaCl 2 ؛ 2H 2 O ؛ 2.45 MgCl 2 ؛ 6H 2 O (5) ؛ HEPES وتعديلها لدرجة الحموضة 7.4 (مم).

2.2) بين الخلايا تسجيل

الرقم 11
الرقم 11. الإعداد الشامل لأجهزة التسجيل.

  1. ينبغي أن توضع في طبق بتري مع إعداد تحت المجهر والمضمون مع الشمع في أسفل الإناء لمنع الحركة.
    الرقم 12
    الرقم 12 ، والتنسيب من إعداد تحت المجهر. استخدام الشمع لتأمين طبق بتري والتحضير.
  2. وينبغي الحصول على كل اثنين من الأسلاك بطول قصير من الأسلاك الفضية المرفقة إلى نهاية واحدة. وينبغي أن تراجع سلك الفضة الى كمية صغيرة من المبيض لمدة 20 دقيقة للحصول على طلاء AG - الكلورين. يغسل السلك بالماء قبل استخدامها. وينبغي الحصول على الخلايا الماصة الزجاج وردم بعناية بإبرة طويلة تعلق على حقنة مملوءة بمحلول بوكل 3M. وينبغي تشغيل ماصة أسفل (مع فتح التي تواجه الكلمة) ، ومليئة الحل. وهذا التأكد من أن أي فائض بوكل سوف بالتنقيط من الجزء الخلفي من القطب. تأكد بوكل لا يمتد على طول ماصة الزجاج الذي سيدخل حمام المالحة. تحويل ماصة تستقيم عند الانتهاء من ملء مع محلول كلوريد البوتاسيوم. ويمكن بعد ذلك سلك الفضة توضع في ماصة. يتم توصيل الطرف الآخر إلى القطب (إيجابية) + مكبر للصوت على المسرح الرئيسي. هو المضمون ثم ماصة على مسرى التحقيق. وينبغي الحرص على عدم كسر غيض الكهربائي. يجب وضع سلك third تعلق على قفص فاراداي في القطب الأخضر للمرحلة الرأس. أخيرا يجب أن يوضع السلك حج من الرصاص المتبقي في الحمام وعلى الطرف الآخر تعلق على -- القطب (السالب) هو مبين أدناه. وينبغي أيضا أن يوضع سلك من قفص فاراداي إلى الجزء الأرضي من Powerlab تحويل ميلادي. توصيل مرحلة التوجه الى "إدخال مسبار" على اقتناء / مكبر للصوت (Powerlab).
    الرقم 13
    الرقم 13. رئيس التكوين المرحلة. ويرتكز السلك متصلا مدخلات الأخضر للمرحلة التوجه الى مكبر للصوت أو قفص فاراداي. توصيل الأسلاك متصلة الإدخال الأحمر إلى السلك الكهربائي. يتم استخدام الإدخال السوداء للاتصال حل الاستحمام.
    الرقم 14
    الرقم 14. "اختبار تبديل" في الصف السفلي لاختبار تم العثور أيضا القطب resistance.The "الخشنة" مقبض البابوينبغي أن تكون في إطار تعويض العاصمة التي تحولت على مدار الساعة لمكافحة الحكمة. يتم تعيين مكسب إلى 50 ، مما يزيد اشارات بمعامل الخمسين. يتم وضع سلك الأرض من مرحلة رأسه في "GND" فتح جاك دبوس.
  3. يجب فتح البرنامج LabChart على سطح المكتب أو المحمول. ضبط التخطيط لعرض قناة واحدة فقط بالنقر على "إعداد" ، ثم "ضبط القناة." تحت "إعدادات قناة" تغيير عدد من القنوات إلى واحد. انقر على زر "موافق". في الجزء العلوي من المخطط ، الزاوية اليسرى ، وينبغي أن تكون الدورات في الثانية الواحدة 2k. تعيين فولت (ذ المحور) إلى نحو 200mV ل500mV. انقر على "القناة 1" على الجزء الأيمن من الشاشة. انقر على زر "إدخال مكبر للصوت". تأكد من تحديد المربع التفاضلية.

    وينبغي أن يكون الناتج مكبر للصوت في قناة واحدة. وينبغي استخدام الإعدادات التالية مع مكبر للصوت :
    • ارتفاع تذاكر - DC
    • الشق تصفية - OFF
    • انخفاض باس - 20kHz
    • قدرة شركات.- عكس عقارب الساعة
    • العاصمة الجميلة ويقابل دورة مقبض - عقارب الساعة
    • DC أوفست (+ OFF) -- OFF
    • كسب مقبض - 50
    • المدخلات (فرق MONO GND) -- مهرجان دبي السينمائي الدولي
    • MODE (STIM - GATE - REC) -- REC
    • ΩTEST - OFF
  4. كمقياس للمقاومة القطب ، ينبغي تقسيم الجهد من قبل الحالي ، الذي هو 2.0 NA (أي ، R = V / I ، أو قانون أوم). القيمة الناتجة هي مقاومة القطب الزجاج. وينبغي أن تكون المقاومة 20-60 MegaOhms. انخفاض (<20) ومقاومة عالية (> 100) ليست مقبولة. مرة واحدة وقد تم تحديد المقاومة ، يمكن أن تبدأ الخلايا التسجيلات. مكان غيض من الزجاج الكهربائي في حمام المالحة. تأكد من سلك الأرض هو أيضا في حمام المالحة.
    لبدء التسجيل ، اضغط بدء في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من تعيين المكسب إلى 5 V / شعبة. استخدام مقبض بالطبع على مكبر للصوت لنقل خط على LabChart إلى الصفر قبل إدخال القطب. وينبغي أن تحول مقبض تبديل على ثم اوقف مرات عدة في لاختبار مقاومة القطب. المقبل ، يجب أن تقاس السعة القيم الناتجة عن ذلك. مكان واحد علامة على خط قاعدة ثابتة ومكان ثم الثانية في ذروة المقاومة للحصول على القطب.
  5. استخدام مسبار كهربائي والمجهر لإدراج الكهربائي في عضلات طولية (ماركا أو DEL1 أو DEL2) من إعداد (انظر الشكل 16). وينبغي أن يكون بالكاد القطب إدراجها في العضلات. لا تخترق من خلال العضلات. استخدام مجهر التحقيق والضبط من أجل العثور على العضلات الطولية وإدراج الأقطاب في العضلات. ينبغي تعديل إضاءة عالية الكثافة لرؤية واضحة في العضلات كما يتم إدراج الكهربائي. عندما بدس الألياف العضلية في هذا التحضير لا يمكن للمرء تشغيل عادة إلى أماكن وانشقاقات داخل العضلات. هذا هو السبب في أن غشاء المحتملة يمكن أن تظهر ، ثم تختفي ، ثم تعود الى الظهور.
    الرقم 15
    الرقم 15. الإدراج من القطب في العضلات.
  6. لقياس القدرة الغشاء ، استخدم مقبض الخشنة على مكبر للصوت لنقل خط على LabChart إلى الصفر قبل إدخال القطب. كزة من الألياف العضلية. المقبل ، وقياس سعة القيم الناتجة. وضع علامة على خط قاعدة ثابتة وتسجيل القيمة.
    يتم عرض الفرق في علامة والمؤشر النشط على الجانب الأيمن من الشاشة. ويعطي قيمة الجهد. قد سجلت الجهد يجب أن يتم مقسوما على مقدار التضخيم المستخدمة في مكبر للصوت (أي تضخيم أو 100X 10X). وينبغي تحويل الجهد من بالميليفولت فولت إلى (1 ، V = 1000 فولت) في حال الإبلاغ عن القيم على البرنامج كما فولت.
  7. بعناية استخدام المجهر والمتلاعبين لإزالة القطب من العضلات. كزة آخر ألياف العضلات وملاحظة إمكانات غشاء يستريح. وينبغي للمرء أن يأخذ عدة تسجيلات وتكون مريحة مع التدابير ، فضلا عن توجيه الكهربائي بين الخلايا في الألياف العضلية للاهتمام.
    القطب ربما لن يبقى في الألياف العضلية واحد خلال المتغيرة للتغيير المختلفة [K +] حلول خارج. فمن الأفضل أن تسحب القطب ، ثم تغيير الحل ، ثم مرة أخرى اختراق لتجنب إتلاف العضلات. فمن الأفضل للحصول على 3 قراءات في حل من ألياف العضلات واستخدام منفصلة في المتوسط ​​لتجنب أي قراءات زائفة.
  8. استخدام حقنة لإزالة والتخلص من محلول ملحي من طبق بيتري. وينبغي ملء طبق بتري المقبل مع تركيز أعلى من كلوريد البوتاسيوم محلول ملحي ، وتغطي إعداد تماما. وينبغي تكرار نفس العملية مع كل حل البوتاسيوم وينبغي أن يلاحظ التغيرات التي طرأت على الجهد / المحتملة وتسجيلها. سلسلة [K +] حلول جراد البحر المالحة التي نستخدمها هي : 5.4 ، 20 ، 40 ، 60 ، 80 ، 100 مم.

2.3) تشريح

أن الآن هو الانتهاء من علم وظائف الأعضاء ، ويمكننا فحص المرتبطةتشريح للألياف العضلات ونمط تعصيب. تمهيدا لنقل الطبق تلوين وإضافة الميثيلين الأزرق (1 غرام من زرقة الميثيلين مختلطة مع 100 مليلتر من المياه المالحة جراد البحر). السماح للالمالحة يستحم إعداد لمدة 5 دقائق ثم إزالة وإضافة جديدة جراد البحر المالحة من دون وصمة عار. وقد وصفت هذه تشريح العضلات بالتفصيل على مر السنين (هكسلي ، 1880 ؛ الحاج ويرسما ، 1963). إلا مؤخرا وقد وصفت بعض العضلات تشريحيا ، من الناحية الفسيولوجية والكيميائية الحيوية (كوبر وآخرون ، 1998 ؛. Griffis وآخرون ، 2000 ؛. سهى وآخرون ، 2000).

ويصور تخطيط التشريحية العامة للعضلات في الشكل 16 (الجانب الأيمن من الشكل لهذا الغرض). ابحث عن العصب الرئيسي الذي يعصب العضلات في المقام الأول داخل قطعة. رسم نمط تعصيب إلى SEM ، DEL2 ، DEL1 ماركا والعضلات في الجزء. البطن يجب أن يكون ممددا بالكامل تعلق في إعداد طبق بحزم. إزالة المقبل المالحة وإضافة محلول مثبت. الحل الإصلاح هو الحل بوان (إعداد مع حمض البكريك المشبعة ، حامض الخليك ، والفورمالديهايد ، سيغما الدريخ شركة).

تحذير. لا تحصل على هذا الحل على الجلد أو في عينيك. تجنب التعرض للأبخرة من الحل من خلال العمل تحت غطاء الدخان. إذا عينيك تبدأ في حرق تغسل عينيك على الفور في محطة غسيل للعين.

اسمحوا الحل بوان تبقى على التحضير لحوالي 10 دقيقة ثم استخدم ماصة وتبادل الحل لالمالحة. قطع قطعة رقيقة من أصل العضلات أو DEL1 DEL2 ومكان على شريحة زجاجية. تسمية الشريحة. كرر الإجراء لعضلة SEM. عرض النطاقات نمط قسيم عضلي في كل الاستعدادات الأنسجة. يمكنك استخدام المجهر المركب وتعديل الأهداف وفقا لرؤية أنماط النطاقات. إذا أمكن التقاط صورة رقمية من خلال قطعة عين المجهر (ملاحظة : بعض الكاميرات الهاتف الخليوي تعمل بشكل جيد لهذا الإجراء).

الرقم 16
الرقم 16. الرسم التخطيطي من وجهة نظر البطني في الجزء الظهري للبطن جراد البحر تظهر عضلات الباسطة من كل قطعة. غشاء البطن العضلات الظهرية (DMA) وسطحية العضلات التبعي رئيس الباسطة (SEAcc) تحدث في قطاعات من 1 إلى 5 من البطن مع اتجاها مختلفا عن كل قطعة. باستثناء الجزء 1 ، وهذه العضلات لديها مواقع تعلقهم في نهايتها الأمامية في tergite ومتكلسة في نهاية الخلفي في الغشاء المفصلي. في الجزء 1 ، وعضلات متماثلة لديها مواقع على المرفق الأمامي إلى الغشاء المفصلي الواقعة بين الصدر والبطن. واستند في التوضيح على المونتاج الفوتوغرافي الملون الاستعدادات الميثيلين الأزرق. على الجانب الأيسر من الرقم قد أزيلت جميع عضلات الباسطة العميق لاظهار العضلات الظهرية الباسطة سطحية. الحجم = 2.35 ملم. (مأخوذة من سهى وآخرون 2000).

3. النتائج

الأسئلة التالية ومعالجة البيانات لتوضيح المبادئ والأهداف الرئيسية لهذا الإجراء المختبر.

  1. مؤامرة التدابير التي حصل عليها لإمكانات غشاء يستريح في كل [K +] من استخدامها. معرفة ما إذا كانت مطابقة للخطوط وحظ وافتراضية في الانحدار بهم. مؤامرة لاستخدام القيم مؤامرة شبه السجل مع المحور x متنوع [K +] على النحو سجل والعمودي من إمكانات غشاء (كما هو مبين أدناه. الشكل 17). (تحميل ورقة الرسم اذا لزم الامر http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
    الرقم 17
    الرقم 17. رقة رسم بياني
    استخدام غشاء متوسط ​​المحتملة يستريح في الحصول على 5،4 مم [K +] من أجل الشروع في خطوط افتراضية ، ولاحظ للمقارنة.
    إذا كانت لا تطابق خطوط مناقشة هذا قد يكون السبب.
  2. إذا كنت تغيير على الصعيد الخارجي من الأيونات + نا ، هل نتوقع من نفس النوع من التعديلات كما لوحظ تغيير في تركيز K +؟
  3. جيدا كيف لم الميثيلين الأزرق وصمة عار في العضلات بالمقارنة مع الأعصاب؟ لماذا قد تكون هناك اختلافات؟ أزرق الميثيلين تستخدم اليوم لتحديد التباين في أنسجة أو خلايا بشرية حية؟ ما العلاقة هناك مع سيغموند فرويد والبقع المستخدمة في جراد البحر؟
  4. ملاحظة أي اختلافات في أنماط قسيم عضلي بين العضلات وDEL SEM. إذا كان الأمر كذلك ، لكن ما قد يكون السبب؟ تفعل كل العضلات لديها نفس المسافات قسيم عضلي يستريح؟ رسم نمط العضلات النطاقات التي لوحظت مع المجهر وتسمية قدر من الرقم ممكن (في ما يتعلق يعرف تشريح العضلات قسيم عضلي).

4. قياس رد متشابكsponses

1) مقدمة

العضلة الباسطة البطن إعداد تستخدم للتدليل على إمكانات غشاء الراحة هي أيضا مثالية لإثبات تحريض ردود متشابك في NMJs من العضلات المختلفة. ومعصب انتقائي بعض العضلات في القشريات التي طوري إما أو منشط العصبون الحركي ، وإن كان يمكن معصب بعض الألياف واحدة من قبل كل من الخلايا العصبية الحركية طوري مثير ومنشط ، مثل العضلات الباسطة في المشي جراد الساقين (أتوود ، 2008 ، وانظر إن الرب معرف إنتاج # 2319 - وو وكوبر ، 2010) ومعظم عضلات الأطراف الأخرى (يرسما ، 1961a). بشكل انتقائي من خلال تحفيز الخلايا العصبية الحركية طوري ومنشط ، قد يكون قياس الاختلافات الفسيولوجية في EPSPs. تنتج الخلايا العصبية الحركية طوري السريع ارتعاش من ألياف العضلات واستحضار EPSPs بناء على أمر من 10-40 بالسيارات. لا يمكن للاستجابة بسرعة مع خفض طوري 5-10 هرتز القطارات من التحفيز. الخلايا العصبية الحركية منشط يؤدي إلى أصغر EPSPs التي يمكن أن يتيسر في وجود ارتفاع وتيرة (10-50 هرتز) من التحفيز. هيكليا ، ومحطات قبل المشبكي طوري ومنشط في NMJs مختلفة (اتوود وكوبر ، 1996 ؛ Bradacs وآخرون ، 1997 ؛. كوبر وآخرون ، 1998).

من المستغرب أن النمط الظاهري من الاستجابات الفسيولوجية طوري يخضع لعملية تحول الى دولة المقويات التي تشبه الخلايا العصبية كهربائيا تكييف طوري لبضع ساعات يوميا على مدى 7 أيام (كوبر وآخرون ، 1998 ؛. مرسييه وأتوود ، 1989). أيضا الحساسية لتعديل العمليات العصبية لرئيس الوزراء هو تحول NMJs عن التحقيق في تنظيم التعبير مستقبلات (Griffis وآخرون ، 2000).

في هذا إعداد قوي نسبيا (عضلات البطن جراد البحر) ، وتسجل كل من الاستجابات بسهولة ومنشط وبحثت عن طوري و / أو الاكتئاب تيسير الاستجابات متشابك مع نماذج التحفيز متنوعة. مع هذه الاستعدادات ، والطلاب سوف يكون قادرا على التعرف على العموميات من ردود متشابك طوري ومنشط عن طريق حفز حزمة الأعصاب.

يتم استخدام إعداد NMJ الإضافية التي تم تقديمها لرصد الجوهرية النشاط الحركي والحسي الحركي الناجم عن النشاط التحفيز من الجهاز العصبي المركزي. هذا هو العضلة المثنية السطحية على الجانب البطني للبطن جراد البحر. وسيتم أيضا إعداد هذه يمكن استخدامها لرصد الحسية والحركية CNS العضلات الدائرة وآثار neuromodulators (Strawn وآخرون ، 2000)

في كل من الجزء البطن (ما عدا الأخير) هناك ثلاث مجموعات من العضلات وظيفية : (1) تلك التي تتحكم pleopod (swimmerets) الحركة ، (2) ثلاث عضلات الباسطة و (3) عضلات المثنية الثلاثة. وextensors العضلات القابضة في مجموعات معادية للعضلات التي إحداث إما تمديد أو الانحناء البطن من خلال التسبب في الدوران حول مفاصل بين القطع. الجهاز العضلي طوري يحتل معظم حجم البطن ، في حين أن عضلات منشط تشكل صفائح رقيقة من الألياف التي تمتد على ظهري (extensors) والبطنية (العضلات القابضة) جانب من جوانب كل قطعة في البطن.

في جراد البحر ، ومنشط للعضلات معصب المثنية البطن من جراد البحر في كل جزء من خمسة half العصبونات الحركية والخلايا العصبية المثبطة a الطرفية. العصبونات الحركية للاستخدام مثير الغلوتامات كناقل عصبي. الغلوتامات depolarizes ألياف العضلات التي تسبب زيادة في نفاذية في المقام الأول إلى أيونات الصوديوم. الخلايا العصبية المثبطة الافراج غاما زبدي حمض أميني (GABA) ، والتي عادة ما hyperpolarizes ألياف العضلات التي تسبب زيادة في نفاذية لأيونات الكلوريد. في بعض عضلات القشريات (وخاصة في الأطراف) ، والخلايا العصبية المثبطة الطرفية إجراء اتصالات متشابك مع محطات الخلايا العصبية الحركية ، وكذلك مع ألياف العضلات ، وتقليل كمية الارسال صدر عن الخلايا العصبية الحركية (تثبيط قبل المشبكي) (Dudel وKuffler ، 1961 ). هذه الظاهرة ليست موجودة في العضلات المثنية منشط للجراد.

الحبل العصبي البطني من جراد البحر هو بنية ثنائية متناظرة تشغيل طول الحيوان. هناك عقدة واحدة لكل قطعة الجسم. في البطن (6 شرائح) ، ولكل عقدة يحتوي على عدة مئات من الخلايا العصبية ، ولكل من connectives two تتكون من محاور عدة آلاف. الهيئات الخلايا العصبية تشكيل هيئات عدة طبقة الخلايا سميكة على السطح البطني كل عقدة. مباشرة فوق طبقة الخلايا الجسم هو meshwork غرامة العمليات العصبية ، وneuropile. جميع التفاعلات تحدث هنا متشابك ، والهيئات الخلية خالية من نقاط الاشتباك العصبي.

كل العقدة في البطن (ما عدا الأخير) على ثلاثة جذور في كل جانب. الجذر الأول يحتوي على محاور عصبية من الخلايا العصبية التعصيب للعضلات والمحاوير pleopod الحسية ، والثاني يحتوي جذر المحاوير التعصيب عضلات الباسطة طوري ومنشط ومحاور عصبية حسية ، والجذر الثالث ، الأمر الذي يترك الحبل العصب عدة مليمترات الذيلية للعقدة ، ويحتوي على محاور innervating طوري ومنشط العضلات المثنية. هناك فرعين من الجذر الثالث. الفرع العميق (الثالث ألف) يعصب العضلات المثنية طوري فقط. فرع سطحية من الجذر الثالث (IIIB) في كل قطعة ونصف على ستة محاور ، وهي عصب العضلات المثنية منشط.

الخلايا العصبية التعصيب والمثنية منشط تنشط بصورة عفوية ، على عكس الخلايا العصبية صادر طوري ، وعلى التحضير الجيد ، وسوف تستمر في اطلاق النار لعدة ساعات بعد أن تمت إزالة البطن من الحيوان. لاستعراض طبيعة التاريخية للالاكتشافات التي تمت في هذه الاستعدادات البطن انظر آتوود (2008). توجد أجسام الخلايا أربعة من الخلايا العصبية الحركية والخلايا العصبية المثبطة والمحيطية التعصيب العضلات المثنية منشط في أي جزء النصف في العقدة من ذلك الجزء. يقع جسم الخلية من الخلايا العصبية الحركية المتبقية في هذه العقدة الذيلية المقبل. قد تكون هذه العصبونات جديد موثوق من بعضها البعض على أساس سعة سجلت ارتفاعا extracelluarly. إذا تمت إزالة العضلات المثنية منشط الجزء من نصف العقد مع يحتويان على الخلايا العصبية التعصيب هذه العضلة ، وخمسة الخلايا العصبية عادة ما تظهر قدرا من النشاط العفوي. يتم ترقيم هذه الخلايا العصبية على أساس النسبية ارتفاع السعة خارج الخلية ، في ترتيب تصاعدي. F1 إلى F4 هي العصبونات الحركية وF5 ، أكبر الخلايا العصبية نشطة بشكل عفوي ، هو المانع المثنية الطرفية. F6 ، الخلايا العصبية الحركية أكبر ، هو مثير الخلايا العصبية الحركية التي نادرا ما تكون نشطة بصورة تلقائية.

لا يمكن للطبيعة النشاط العفوي منشط الخلايا العصبية الحركية تكون منظم من قبل تطبيق خارجية من المركبات أو عن طريق توفير الحوافز الحسية للبشرة في نفس القطعة التي يتم رصدها للنشاط العصب المحرك.

2) تشريح

للحصول على إعداد الباسطة البطن نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه لدراسة الامكانيات الغشاء الراحة فيما يتعلق البوتاسيوم خارج الخلية. الفرق هو أن تأخذ الرعاية من حزمة الأعصاب القطعي الذي يمتد على طول الجانب من درع. وسوف يتم سحب هذا العصب في القطب الشفط التي ستكون بمثابة القطب محفزة. في حفز 1 هرتز لرصد ردود طوري. حفز مع رشقات نارية قصيرة من البقول 10Hz مدة 10 إلى 20 منبهات في حين رصد ردود منشط.

إجراءات تجريبية لرعاية تجارب على عضلات المثنية جراد منشط مختلفة واحد يحتاج إلى ترك الحبل البطني العصب سليمة. يتم إجراء إعداد يتكون من عدة قطاعات في البطن. يتم الحصول على هذا النحو التالي :

  1. وينبغي الحصول على جراد البحر حوالي 60-10 سم في طول الجسم (أو حجم معقول). الحصول على جراد بوضعها من الجزء الخلفي من الرأس أو ما يقرب من 2 أو 3 سم من الجزء الخلفي من العين. تأكد من أن مخالب جراد البحر أو الفم لا يمكن الوصول المجرب عند التعامل مع جراد البحر. التخلص من الزوائد في الرأس وبعد إزالتها.
  2. استخدم المقص لإزالة بسرعة الرأس. اجراء خفض نظيفة وسريعة من وراء أعين جراد.
    الرقم 18
    الرقم 18. صورة تظهر موضع خفض لإزالة رئيس جراد.
    يمكن إزالة الساقين ومخالب للجراد في هذه المرحلة لتجنب الاصابة. يمكن Stylets على الذكور وswimmerets على كل من الذكور والإناث كما يمكن إزالة الشكل (19 و 20). المقبل ، ومنفصلة في البطن من القفص الصدري. اجراء خفض على طول الغشاء التعبير الذي ينضم البطن والصدر (الشكل 20).
  3. حفظ جزء من البطن وجراد البحر والتخلص من القفص الصدري.
    الرقم 19
    الرقم 19. صورة تظهر موضع stylets التي يمكن إزالتها من جراد البحر.
    الرقم 20
    الرقم 20. صورة تظهر موضع خفض لإزالة الصدر من البطن.
    الرقم 21
    الرقم 21. إزالة القفص الصدري من البطن. وينبغي أن يتم قطع بطريقة دائرية على طول الخط للانضمام شرائح.
    الرقم 22
    الرقم 22. صورة أعلى البطن يظهر مع الزوائد. صورة تظهر أسفل إزالة الزوائد في البطن.
  4. إعداد مكان الذيل معزولة في محلول ملحي في طبق بيتري كبيرة. دبوس أسفل الجزء العلوي من الذيل والتحضير للطبق. تأكد من إعداد آمنة. استخدام مشرط لإزالة جزء مربع من الجانب البطنية من التحضير بين الضلوع.
    الرقم 23
    الرقم 23.يظهر فيها وينبغي أن يتم خفض جرعة لإزالة البطنية من التحضير.
  5. وينبغي بذل قطع صغيرة (يمكن أيضا أن يتم ذلك مع مقص). وينبغي خفض ورفع رفرف التصاعدي. ويمكن عندئذ يمكن إزالة رفرف مع مقص ، وتعريض عضلات المثنية العميقة. وينبغي استخدام المجهر خلال هذه العملية لضمان الدقة في إزالة جزء من التحضير بطني.
    الرقم 24
    الرقم 24. إعداد قطع مع مقص لفضح العضلات.
    الرقم 25
    الرقم 25. صورة يظهر استيعاب الأعلى للرفرف بالملقط. صورة تظهر أسفل إزالة رفرف من إعداد باستخدام المجهر.
    الرقم 26
    الرقم 26. التعرض للعضلات المثنية السطحية.

3) بين الخلايا التسجيل :

الرقم 27
الرقم 27. الإعداد الشامل لأجهزة التسجيل.

  1. ينبغي أن توضع في طبق بتري مع إعداد تحت المجهر والمضمون مع الشمع في أسفل الإناء لمنع الحركة.
    الرقم 28
    الرقم 28. يظهر موضع إعداد تحت المجهر. استخدام الشمع لتأمين طبق بتري والتحضير.
  2. وينبغي الحصول على اثنين من الأسلاك بطول قصير من الأسلاك الفضية المرفقة إلى نهاية واحدة. وينبغي أن تراجع سلك الفضة الى كمية صغيرة من المبيض لمدة 20 دقيقة للحصول على طلاء AG - الكلورين. يغسل السلك بالماء قبل استخدامها. وينبغي الحصول على الخلايا الماصة الزجاج وتملأ بعناية مع حل (3 م) بوكل. وينبغي تشغيل ماصة أسفل (مع فتح التي تواجه الكلمة) ، ومليئة الحل. وسوف يضمن هذا الأخير أن أي فائض بوكل سوف بالتنقيط من الجزء الخلفي من القطب. تأكد بوكل لا يمتد على طول ماصة الزجاج الذي سيدخل في حمام المالحة. تحويل ماصة تستقيم عند الانتهاء من ملء مع محلول كلوريد البوتاسيوم. ويمكن بعد ذلك سلك الفضة توضع في ماصة. يتم توصيل الطرف الآخر إلى القطب (إيجابية) + على المسرح الرئيسي. هو المضمون ثم ماصة على مسرى التحقيق. وينبغي الحرص على عدم كسر ماصة الكهربائي. يجب وضع سلك third تعلق على قفص فاراداي في القطب الأخضر للمرحلة الرأس. أخيرا يجب أن يوضع السلك حج من الرصاص المتبقي في الحمام وعلى الطرف الآخر تعلق على -- القطب (السالب) هو مبين أدناه. وينبغي أيضا أن يوضع سلك من قفص فاراداي إلى الجزء الأرضي من Powerlab تحويل ميلادي. توصيل مرحلة التوجه الى "إدخال مسبار" على اقتناء / مكبر للصوت (Powerlab).
    الرقم 29
    الرقم 29. رئيس التكوين المرحلة. ويرتكز السلك متصلا الجزء الأخضر للمرحلة التوجه الى مكبر للصوت أو قفص فاراداي. توصيل الأسلاك متصلة الجزء الأحمر لسلك كهربائي. ويستخدم الجزء الأسود للاتصال حل الاستحمام.
    الرقم 30
    الرقم 30. "اختبار تبديل" في الصف السفلي لاختبار مقاومة القطب. تم العثور أيضا على "الخشنة" تحت مفتاح الإزاحة العاصمة التي ينبغي أن تحولت على مدار الساعة لمكافحة الحكمة. يتم تعيين مكسب إلى 50 ، مما يزيد اشارات بمعامل الخمسين. يتم وضع سلك الأرض من مرحلة رأسه في "GND" فتح جاك دبوس.
  3. يجب فتح البرنامج LabChart على سطح المكتب أو المحمول. ضبط التخطيط لعرض قناة واحدة فقط من قبل "الإعداد" فوق ، ثم "ضبط القناة." تحت "إعدادات قناة" تغيير عدد من القنوات إلى واحد. انقر على زر "موافق". في الجزء العلوي من المخطط ، الزاوية اليسرى ، وينبغي أن تكون الدورات في الثانية الواحدة 2k. تعيين فولت (ذ المحور) إلى نحو 200mV ل500mV. انقر على "القناة 1" على الجزء الأيمن من الشاشة. انقر على زر "إدخال مكبر للصوت". تأكد من تحديد المربع التفاضلية.

    وينبغي أن يكون الناتج مكبر للصوت في قناة واحدة. وينبغي استخدام الإعدادات التالية مع مكبر للصوت :
    • ارتفاع تذاكر - DC
    • الشق تصفية - OFF
    • انخفاض باس - 20kHz
    • قدرة شركات.- عكس عقارب الساعة
    • العاصمة الجميلة ويقابل دورة مقبض - عقارب الساعة
    • DC أوفست (+ OFF) -- OFF
    • كسب مقبض - 50
    • المدخلات (فرق MONO GND) -- مهرجان دبي السينمائي الدولي
    • MODE (STIM - GATE - REC) -- REC
    • ΩTEST - OFF
  4. لقياس المقاومة الكهربائي ، ينبغي تقسيم الجهد من قبل الحالي ، الذي هو 2.0 غ. القيمة الناتجة هي مقاومة القطب الزجاج. وينبغي أن تكون المقاومة 20-60 MegaOhms. مرة واحدة وقد تم تحديد المقاومة ، يمكن أن تبدأ الخلايا التسجيلات. مكان غيض من الزجاج الكهربائي في حمام المالحة. تأكد من سلك الأرض هو أيضا في حمام المالحة.
    لبدء التسجيل ، اضغط على "بدء" في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من تعيين المكسب إلى 5 V / شعبة. استخدام مقبض بالطبع على مكبر للصوت لنقل خط على LabChart إلى الصفر قبل إدخال القطب. وينبغي أن تحول مقبض تبديل على ثم اوقف مرات عدة في لاختبار مقاومة القطب. المقبل ، يجب أن تقاس السعة القيم الناتجة عن ذلك. مكان واحد صانع خط قاعدة ثابتة ومكان ثم الثانية في ذروة المقاومة للحصول على القطب.
  5. استخدام مسبار كهربائي والمجهر لإدراج الكهربائي في العضلات. لا تخترق من خلال العضلات. استخدام مجهر التحقيق والضبط من أجل العثور على طبقة رقيقة من ألياف العضلات وإدراج الأقطاب في الألياف. ويمكن استخدام إضاءة عالية الكثافة كمصدر الضوء عندما يخترق العضلات.
    الرقم 31
    الرقم 31. الإدراج من القطب في العضلات.
  6. يجب توخي الحذر لتجنب إلحاق الضرر جذور الأعصاب إلى العضلات السطحية.
    فإنه من المستحسن أن تبقي الاستحمام المالحة التحضيرات بارد (10-15 درجة مئوية) والاوكسيجين بشكل جيد في حين تنفيذ إجراءات تجريبية. إذا وحدات التبريد لا تتوفر استبدال المالحة مع الطازجة والمبردة المالحة بانتظام. وينبغي فقاعات غاز الأكسجين ، والهواء أو على الأقل ، من خلال المالحة.
  7. سجل النشاط العفوي للEPSPs. لاحظ أحجام مختلفة من EPSPs وإذا IPSPs موجودة.
  8. تأخذ بعناية جدا صغير بوش الطلاء وباليد حفز على طول حافة إهاب داخل الجزء نفسه الى ان احد هو رصد النشاط العفوي. لاحظ تغييرا في وتيرة الردود وإذا EPSPs مختلفة الحجم يبدو أن لم تكن موجودة قبل لتحفيز إهاب
    الرقم 32
    الرقم 32. التحضير مع الفرشاة وتحفيز عصب الجذور. (معدلة من Strawn وآخرون ، 2000)
  9. يمكن أن يتكرر في تحفيز تبادل بعناية بعد الاستحمام المالحة مع واحد يحتوي على neuromodulator مثل السيروتونين (1 microM) أو المالحة مع فقاعات ثاني أكسيد الكربون 2. لاحظ تأثير على الوضع حافزا لنشاط معين. نلاحظ أيضا إذا ظهر تبادل المالحة لإرجاع المالحة العذبة النشاط إلى حالته الأولية.
  10. المقبل ، يمكن للمرء أن رصد النشاط العصبي داخل الدوائر العصبية الحسية CNS موتور بطرق مختلفة. يمكننا استخدام الشفط الكهربائي بدلا من القطب الكهربائي داخل الخلايا (شكل 33) لمراقبة نشاط الخلايا العصبية الحركية. في غيض من الزجاج الكهربائي شفط ، يتم وضع الأنابيب البلاستيكية التي قد فتح من الحجم الصحيح لسحب العصب إلى الحافة. ينبغي أن لا يكون الافتتاح كبير جدا ، والعصب وتسقط ، أو صغيرة جدا ، لأن ذلك من شأنه أن تتلف العصب بسبب الضغط من القطب. يتم سحبها أنابيب بلاستيكية فوق اللهب وقلصت مرة أخرى إلى الحجم المطلوب.
    الرقم 33
    الرقم 33. إعداد الترتيبات مع القطب شفط التسجيل.
    موقف micromanipulator في وضع يمكنها من حيث القطب الشفط وسهولة الوصول إلى حمام المالحة. شفط المياه المالحة حتى انها على اتصال مع أسلاك الفضة داخل القطب الشفط. ترتيب الأسلاك الأخرى على جانب قطع من مسرى الشفط على مقربة من غيض من القطب ، لذلك سيكون كل من الأسلاك في اتصال مع حمام المالحة.
    كما لرصد الكهربائية توصيل مكبر للصوت التفاضلية AC / DC (مضخم) إلى 26T مختبر الطاقة. القيام بذلك عن طريق ربط الحبل السليم من المدخلات (1) بشأن 26T PowerLab إلى الإخراج على مكبر للصوت.
    • وينبغي وضع الضوابط صك مكبر للصوت إلى الإعدادات التالية :
      • ارتفاع تذاكر - DC
      • الشق تصفية - OFF
      • انخفاض باس - 20kHz
      • قدرة شركات.- عكس عقارب الساعة
      • العاصمة الجميلة ويقابل دورة مقبض - عقارب الساعة
      • DC أوفست (+ OFF) -- OFF
      • كسب مقبض - 50
      • المدخلات (فرق MONO GND) -- مهرجان دبي السينمائي الدولي
      • MODE (STIM - GATE - REC) -- REC
      • ΩTEST - OFF
    ربط رئيس لمرحلة "المدخلات والتحقيق" على مكبر للصوت.
    توصيل الأسلاك الكهربائية من القطب إلى مرحلة شفط الرأس. وينبغي أن تكون متصلا مع الأسلاك الحمراء (إيجابية) في أعلى اليسار الأخضر (على الأرض) في وسط الأسود (السلبية في أسفل ، ويدل هذا في الشكل 34 ، ويمكن فقط سلك الأرض توضع في حمام المالحة.
    الرقم 34
    الرقم 34. مرحلة التكوين رئيس
  11. الآن الاتصال سلك USB من 26T PowerLab للمحمول. ضمان أن كلا من مكبر للصوت وPowerLab26T موصولة وتحولت في يوم قبل افتتاح LabChart7 على الكمبيوتر.
  12. فتح LabChart7.
    • سوف مربع LabChart مركز الترحيب البوب ​​مفتوحة. إغلاقه. </ لى>
    • انقر على الإعداد
    • انقر على ضبط القناة. تغيير عدد من القنوات ل1 (أسفل يسار مربع) دفع موافق.
    • في الجانب الأيسر العلوي من المخطط تعيين الدورات في الثانية الواحدة إلى حوالي 2k. تعيين فولت (المحور الصادي) إلى نحو 500 أو 200mv.
    • انقر على القناة 1 على يمين المخطط. انقر على مكبر للصوت الإدخال. تأكد من أن الإعدادات : واحد العضوية ، إلى جانب ميلان ، وعكس (المقلوب إشارة إذا لزم الأمر) ، ومكافحة مستعار ، والتحقق.
    • بدء التسجيل لبدء الصحافة.
    يمكن أن نسجل من فرع من الجذر الثالث 3 والتي يعصب العضلات المثنية السطحية (فرع IIIB) لرصد حجم امكانات العمل مع تسجيل خارج الخلية. ويشار إلى أن النبضات العصبية خارج الخلية على أنها "المسامير". يذكر أن هناك خمسة الخلايا العصبية الحركية واحد مثير الخلايا العصبية الحركية المانع في هذا الجذر (كينيدي وتاكيدا ، 1965 ؛ فيليز وايمان ، 1978). ويمكن استخدام التحفيز للبشرة باستخدام فرشاة أو تعرض neuromodulators الشكل (35). ويمكن استخدام فرشاة الرسم باليد أو لتحفيز متناسقة ويمكن تثبيته على micromanipulator للتحكم في كمية الضغط والحركة.
    الرقم 35
    الرقم 35. نشاط من الجذر الثالث 3 قبل وخلال التحفيز جليدية في المياه المالحة (أعلى) و 100 نانومتر في 5 - HT (القاع). يشار الوقت خلال التحفيز إهاب من العارضة. لاحظ نشاطا معززا قبل وبعد التحفيز عندما استحم في إعداد HT - 5 (معدلة من Strawn وآخرون ، 2000).
    يمكن أن نسجل من ش 1 أو 2 جذور الثانية بجعل تسجيلا باسانت ان العصب ، أو نستطيع القطع جذر بعيدا عن فنك وتسجيل المدخلات الحسية الصرفة الناشئة من المحيط الذي سيرسل إشارات إلى فنك. وبالتالي ، هل سجل من جذر مقطوع مما أدى إلى هامش للنشاط الحسية.
    جذر الثانية 2 يحتوي كبيرة جدا وارد المحاور الأساسية من الأجهزة مستقبلات العضلات (MRO) وأصغر من محاور الخلايا العصبية الحركية لefferents الباسطة (الحقول وكينيدي ، 1965). هناك العديد من المحاور العصبية الحسية في القرن الحادي و1 و 2 جذور الثانية.
    mechanosensory الخلايا العصبية لديهم اتصالات مباشرة ، عن طريق نقاط الاشتباك العصبي الكهربائي مع المحاور الجانبية العملاقة (LG) (Krasne 1969 ؛ زوكر 1972). ومن المعروف أيضا أن الخلايا العصبية لإثارة mechanosensory interneurons عبر المشابك الكيميائية.
    لدراسة الكيفية التي يمكن أن تؤثر على المدخلات الحسية العصبون الحركي النشاط ، من خلال الدائرة العصبية الحسية والحركية CNS ، يمكننا تسجيل الاستجابات متشابك في العضلات. يمكن فحص مختلف جوانب الحلبة سوف نستخدم. على سبيل المثال ، فإننا يمكن أن تسجل من جذر العصب الحسي وحده أو جذر السيارات مع أو بدون مدخلات الحسية سليمة في فنك لتحليل تسجيلات ارتفاع وتيرة ، يمكن للمرء الاعتماد على مدى الفترة الزمنية في ظروف مختلفة. يمكن جعل تدابير التحفيز قبل فرشاة وخلال التحفيز فرشاة لفترة معينة من الزمن (الشكل 35). يمكن للمرء أن تكرار الظروف 5 مرات والحصول على تغيير في المئة في المتوسط ​​في وتيرة كتدبير لإجراء مقارنات.
    يمكن للمرء أن ينطبق أيضا مركبات خارجية مثل السيروتونين (Strawn وآخرون ، 2000) أو أستيل (ACH) ، والنيكوتين أو الغلوتامات. وقد وصفت الإجراءات السلوكية المختلفة للنيكوتين في اللافقاريات. فإن ذلك يشير إلى وجود مستقبلات النيكوتين (Tsunoyama وGojobori ، 1998). الغلوتامات هو ناقل عصبي كبير مثير في معظم اللافقاريات في منظمة العمل ضد الجوع وNMJ هو ناقل عصبي كبير مثير داخل الجهاز العصبي المركزي (Monoghan وآخرون ، 1989 ؛ واتكينز ، وآخرون ، 1990).
    يمكن للمرء أن يحاول heptanol أو CO 2 فقاعات المالحة نظرا لأنه سيكون فك الارتباط بين جراد البحر محوجزة (أو فجوة) تقاطعات داخل الدائرة والدكتور محمد Bierbower سونيا (جامعة كنتاكي) وقد أظهرت الأبحاث في رسالتها. هذا قد عمل لحساب تغير سلوك الحيوان كله عندما تتعرض لارتفاع ثاني أكسيد الكربون 2 في البيئة (Bierbower وكوبر ، 2010). عند تحفيز إهاب بفرشاة والمدخلات الحسية وسجل محرك ردا في الخلايا العصبية الحركية ، لاحظ إذا كان هناك اختلاف في النشاط قبل وأثناء heptanol أو التعرض CO 2. هذا قد أو قد لا توحي تقاطعات الفجوة أن يكون لها دور في الدائرة العصبية الحسية والحركية CNS.

Discussion

غشاء المحتملة

في وقت مبكر من عام 1902 ، وكان برنشتاين التعامل مع القضايا ذات إمكانات يستريح في محور عصبي من الحبار. فمن المثير للاهتمام للنظر في كيفية هذه الأفكار والملاحظات في وقت مبكر من Berstein (1902) ونرنست (1888) في وقت لاحق أثرت البحوث في علم وظائف الأعضاء الغشاء. (انظر استعراض وMalmivuo Plonsey ، 1995 ؛ متاحة أيضا على شبكة الاتصالات العالمية http://www.bem.fi/book/ ). لا يزال هناك ، حتى يومنا هذا ، واختراقات تبذل حول وظيفة القناة الايونية وخصائص الأغشية البيولوجية التي هي مهمة جدا في فهم الفيزيولوجيا الخلوية التي تتعلق وظيفة الأجهزة والأنسجة والأنظمة.

المقارنة بين آثار التجريبية والنظرية المستمدة من الخارجية [K +] على إمكانات غشاء يستريح يدل على تأثير الأيونات على إمكانات غشاء. مزيد من التجارب باستخدام هذا المستحضر نفسه لا يزال يتعين القيام بها لمعالجة المسائل الأساسية الفسيولوجية. وسلط الضوء على بعض مرة أخرى في عام 1968 من قبل اتوود وParnas وحتى الآن لم يتم التصدي لها بشكل كامل. مع التقنيات التي تم الحصول عليها في هذه العملية ، يمكن للمرء أن الشروع في الإجابة على الأسئلة المتبقية في العديد من الأعمال التحضيرية تجريبية أخرى ، وكذلك في التطبيقات الفسيولوجية المتعلقة بالطب والصحة. وقد برهنا على فائدة نموذج إعداد اللافقارية لمعالجة المسائل الأساسية ذات الصلة لجميع الحيوانات.

مع المعرفة المكتسبة على التدرجات الكهروكيميائية للأيونات في هذه العملية المذكورة أعلاه ، يمكنك التقدم الآن إلى استثارة الأغشية عن طريق دراسة انتقال متشابك في الاستعدادات العصبية والعضلية في جراد البحر.

قياس ردود متشابك

وقد وفرت التفاصيل المنصوص عليها في الجزء الأول من هذا المختبر ، والفيلم يرتبط بها ، والخطوات الرئيسية لتسجيل والتحقيق إمكانات غشاء هيكل العضلات. في الجزء الثاني من هذه المختبرات ، وقدمت دليلا على تشريح تسجيل وانتقال متشابك في NMJs الوحدات الحركية طوري ومنشط التعرض لمفاهيم أساسية في علم وظائف الأعضاء. التعرض للدائرة العصبية ، والتي يمكن في جزء منه يمكن استخدامها لتفسير السلوكيات المرتبطة بها ، والحيوان سليمة لديها امكانات ليس فقط للطلاب للتحقيق في مختلف أسئلة مفتوحة العضوية في ممارسة المختبر وإنما أيضا للبحث في المستقبل على الدوائر العصبية في بئر أنشئت إعداد اللافقارية (كينيدي وآخرون ، 1969 ؛. Antonsen وادواردز ، 2003)

ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الاستعدادات لتسهيل التحقيق في متشابك ، والاكتئاب وطويلة الأجل اللدونة (لم يتم التحقيق في هذه الدراسة المختبرية). حتى داخل بعض أنواع من جراد البحر واللدونة العصبية يعتمد على الظروف التحفيز التجريبية (مرسييه وأتوود ، 1989 ؛. كوبر وآخرون ، 1998) فضلا عن بيئتهم الطبيعية. إلى أي مدى القدرة على تغيير متشابك فعالية وديناميكية العضلات يخدم الحيوان لا يزال يتعين التحقيق فيها. منذ جراد لا يغير سلوكهم في ما يتعلق التغيرات الموسمية ودورة تساقط ، هناك اختلافات النشاط نسبيا على المدى الطويل في نظمها العصبية والعضلية. وقد تبين أن العصب المحرك لعضلات طوري محطات أقرب مخلب يحمل مورفولوجيا الكلاسيكية طوري خلال فصل الشتاء ، ولكن تنتفخ وتصبح أكثر الدوالي على طول المعبر خلال أشهر الصيف (Lnenicka 1993 ؛ Lnenicka وتشاو ، 1991).

أظهرت بعض الدراسات التي أجريت في وقت مبكر الوحشي interneurons جراد (LG) العملاقة داخل الحبل البطني العصب وجود تقاطعات الفجوة (جونسون ، 1924 ؛ واتانابي وGrundfest ، 1961). ومن المعروف جيدا أن CO 2 له تأثير على الاتصالات الكهربائية عن طريق uncoupling تقاطعات الفجوة (أريانو وآخرون ، 1990). وقد تبين مؤخرا أن الحبل العصبي والاتصال داخل الدائرة الحسية والحركية CNS العضلات ، كما هو موضح في هذا التقرير ، هو أيضا حساسة للCO 2 ، والتعرض تشير إلى وجود تقاطعات الفجوة (Bierbower ، 2010 ؛ Bierbower وكوبر ، 2010)

كان النشاط العفوي من جذر 3 المحرك الثالث موضوع منذ عام 1960 عندما إيكرت (1961) درست إذا منشط اطلاق ثابت الجهاز مستقبلات العضلات (MRO) داخل نفس القطعة المجاورة أو يمكن حساب لمحرك السيارات عفوية. في هذه الدراسات في وقت سابق أصبح من الواضح أن الدافع وراء النشاط في الحبل البطني العصب (VNC) ربما من أعلى مراكز (إيكرت ، 1961 ؛ كينيدي وتاكيدا ، 1965a ، ب ؛. Strawn وآخرون ، 2000). منذ وجود CO 2 توقف النشاط العفوي ، ويمكن للمرء أن يفترض في مكان ما في محرك أقراص إلى الخلايا العصبية الحركية قد يكون هناك تقاطعات الفجوة أو محرك مثير glutamatergic. يتم حظر NMJs أو انخفاض حساسية للمعرض الغلوتامات في حضور CO 2 ، وأنها قد تكون الكتلةرطة كذلك داخل الجهاز العصبي المركزي (Bierbower ، 2010 ؛ Bierbower وكوبر ، 2010 ؛ انظر أيضا بدر وآخرون ، 2005).

هو أيضا عمل neuromodulators درس مختلف بسهولة على أنواع مختلفة من NMJs (كوبر وكوبر ، 2009 ؛ Griffis وآخرون ، 2000 ؛. Southard وآخرون ، 2000 ؛. Strawn وآخرون ، 2000). بالإضافة إلى ذلك ، تبذل مختلف التأثيرات التي neuromodulators على الدوائر الجهاز العصبي المركزي. وقد اقترح أن ال 5 - HT والخلايا العصبية octopaminergic قد تعمل ك "واضعي كسب -' تغيير في الإخراج من الدوائر العصبية (ما وآخرون ، 1992 ؛. شنايدر وآخرون ، 1996 ؛. هورنر وآخرون ، 1997 ؛. إدواردز وآخرون ، 2002). العمل لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به قبل أن نتمكن من فهم كامل للآثار neuromodulators على الخلايا المستهدفة الفردية. بالنظر إلى أن neuromodulators مختلفة قد تعمل بالتنسيق مع بعضها البعض ، وتحليل عملها المختلط هو مجال للبحث في المستقبل (Djokaj وآخرون ، 2001). بالإضافة إلى ذلك ، عدد قليل من الدراسات ، لا سيما في الفقاريات ، ومعالجة آثار neuromodulators على المسارات كلها التي يمكن أن تنظم سلوك معين. في هذا الإعداد وحدة حسية حركية الجهاز العصبي المركزي يمكن للمرء أن دراسة تأثير كل من المدخلات الحسية وneuromodulators على نشاط الخلايا العصبية الحركية (كينيدي وآخرون ، 1969).

منذ تم افتراضه أن 5 - HT يلعب دورا في تنظيم الدولة السلوكية للجراد البحر والكركند وسرطان البحر (ليفنجستون وآخرون ، 1980 ؛. Sneddon وآخرون ، 2000) ، وقد بذلت محاولات عديدة لتحديد تركيزه في وفنك ، والدملمف ، وفي العقد المعزولة من الكركند (ليفنجستون وآخرون ، 1980 ؛. اريك هاريس وكرافيتز 1984 ؛. Fadool وآخرون ، 1988). ومع ذلك ، كان هناك تباين كبير في القياسات المسجلة ، مما يحول دون الاستجابة للجرعة محددة العلاقات التي يمكن أن تشكل الإجراءات السلوكية.

وقد يعتقد أن جراد البحر مع مخالب عقدت في موقف أثار مع والذيل مدسوس تحت البطن ليحمل موقفا الهيمنة (ليفنجستون وآخرون ، 1980). حالة انثناء البطن في جراد البحر لا يبدو أن الموقف السائد أن جراد البحر ، في غضون الزوج ، المعرض خلال التفاعلات الاجتماعية أو مع الحفاظ على الوضع السائد الهرمي (Listerman وآخرون ، 2000). وجراد البحر منقاد شد البطن حتى في ظل تراجع نفسها لأنها من الخصم. وينظر أيضا مثل الدس والذيل وضعية الدفاع (Listerman وآخرون ، 2000). وقد لاحظ هذه السلوكيات بسهولة في الميدان ، وضبط في المختبرات (Bovbjerg ، 1953 ، 1956 ؛ Bruski ودنهام ، 1987 ؛ لي وآخرون ، 2000 ؛. Listerman وآخرون ، 2000). يتم عكس المثير للاهتمام ، ومواقف سلوكية سجلته في الكركند (ليفنجستون وآخرون ، 1980) لHT - 5 وحقن octopamine في جراد البحر الاسترالي ، Cherax مدمر (ماكراي ، 1996). ربما ، سيكون لاحظ استجابات مختلفة تماما في إعداد المثنية السطحية في جراد البحر الاسترالي. بالإضافة إلى ذلك ، منذ هيمنة عموما ذات الصلة بين حجم جراد البحر ، فإن للمرء أن يتوقع استجابة نظام البلاستيك جدا لتغير الظروف الاجتماعية بسرعة (Strawn وآخرون ، 2000). ليونة في الاستجابة لneuromodulators في اللافقاريات هو مساحة مفتوحة من التحقيق.

أنتجت Wyttenbach ، جونسون ، وهوي (1999) وسائل الإعلام الرقمية ودليل المختبر لالتجريب جراد مختلف العضلات التي تنطوي على نفسها المعروضة في هذا التقرير ، بالإضافة إلى التحضيرات جراد الأخرى. هذا هو مصدر ممتاز للتمارين الطلاب.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

بدعم من جامعة كنتاكي ، قسم علم الأحياء ، ومكتب للدراسات الجامعية وكلية الآداب والعلوم.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. Bouin’s fixative solution was used directly and methylene blue is made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. Sylgard-bottomed glass dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Model 3000 AC/DC amplifier for intracellular as well as extracellular recordings can be used.
  8. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  9. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. Intracellular electrodes were filled with 3 M KCl.
  10. A suction electrode is used to record extracellular signals.
  11. Faraday cage.
  12. High Intensity Illuminator (light source).
  13. Micromanipulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Differential dye coupling reveals lateral giant escape circuit in crayfish. J. Comp. Neurol. 466, 1-13 (2003).
  2. Arellano, R. O., Rivera, A., Ramón, F. Protein phosphorylation and hydrogen ions modulate calcium-induced closure of gap junction channels. Biophys. J. 57, 363-367 (1990).
  3. Atwood, H. L. γ -aminobutyric acid and crab muscle fibres. Experientia (Basel). 20, 161-163 (1964).
  4. Atwood, H. L. Variation in physiological properties of crustacean motor synapses. Nature. 215, 57-58 (1967).
  5. Atwood, H. L. Peripheral inhibition in crustacean muscle. Experimentia. 24, 753-763 (1968).
  6. Atwood, H. L. An attempt to account for the diversity of crustacean muscles. Am. Zool. 13, 357-378 (1973).
  7. Atwood, H. L. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems. Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).
  8. Atwood, H. L. Synapses and neurotransmitters. The Biology of Crustacea. Sandeman, D. C., Atwood, H. L. 3, Academic Press, Inc. New York. 105-150 (1982).
  9. Atwood, H. L. Parallel 'phasic' and 'tonic' motor systems in the crayfish abdomen. J. Exp. Biol. 211, 2193-2195 (2008).
  10. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Functional and structural parallels in crustaceans and Drosophila neuromuscular systems. Am. Zool. 35 (6), 556-565 (1995).
  11. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Assessing ultrastructure of crustacean and insect neuromuscular junctions. J. Neurosci. Meth. 69, 51-58 (1996).
  12. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions. Invertebrate Neurosci. 1, 291-307 (1996).
  13. Atwood, H. L., Parnas, I. Recording from the crayfish abdominal extensor muscle preparation with microelectrodes. In: Experiments in physiology and biochemistry. Kerkut, G. A. , Academic. London. 307-330 (1968).
  14. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila larvae. Comparative Biochemistry and Physiology A. 140, 363-376 (2005).
  15. Bernstein, J. Untersuchungen zur Thermodynamik der bioelektrischen Ströme. Pflüger Arch. ges. Physiol. 9, 521-562 (1902).
  16. Bernstein, J. Elektrobiologie. , Viewag. Braunschweig. 215 (1912).
  17. Bierbower, S. M. Environmental effects on behavior and physiology in crayfish. , Department of Biology, University of Kentucky. (2010).
  18. Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The effects of acute carbon dioxide on behavior and physiology in Procambarus clarkii. J. Exp. Zool. , In press (2010).
  19. Boistel, J., Fatt, P. Membrane permeability change during inhibitory transmitter action in crustacean muscle. J. Physiol. (Lond.). 144, 176-191 (1958).
  20. Bovbjerg, R. V. Dominance order in the crayfish Orconectes 6irilis (Hagen). Physiol. Zool. 26, 173-178 (1953).
  21. Bovbjerg, R. V. Some factors affecting aggressive behavior in crayfish. Physiol. Zool. 29, 127-136 (1956).
  22. Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle. J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).
  23. Bruski, C. A., Dunham, D. W. The importance of vision in agonistic communication of the crayfish Orconectes rusticus, I. an analysis of bout dynamics. Behaviour. 63, 83-107 (1987).
  24. Burke, W., Ginsborg, B. L. The electrical properties of the slow muscle fibre membrane. J. Physiol. 132, 586-598 (1956).
  25. Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595 (2009).
  26. Cooper, R. L., Warren, W. M., Ashby, H. E. Activity of phasic motor neurons partially transforms the neuronal and muscle phenotype to a tonic-like state. Muscle & Nerve. 21, 921-931 (1998).
  27. Djokaj, S., Cooper, R. L., Rathmayer, W. Effects of octopamine, serotonin, and cocktails of the two modulators on synaptic transmission at crustacean neuromuscular junctions. J. Comp. Physiol. A. 187 (2), 145-154 (2001).
  28. Dudel, J., Kuffler, S. W. Mechanism of facilitation at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (Lond.). 155, 540-542 (1961).
  29. Eckert, R. O. Reflex relationships of the abdominal stretch receptors of the crayfish. J. Cell. Comp. Physiol. 57, 149-162 (1961).
  30. Edwards, D. H., Yeh, S. R., Musolf, B. E., Antonsen, B. L., Krasne, F. B. Metamodulation of the crayfish escape circuit. Brain Behav Evol. 60 (6), 360-369 (2002).
  31. Fadool, D. A., Cobb, S. J., Kass-Simon, G., Brown, P. R. Liquid chromatographic procedures for the analysis of compounds in the serotonergic and octopamine pathways of lobster hemolymph. J. Chromatogr. 452, 491-501 (1988).
  32. Fatt, P., Katz, B. The electrical properties of crustacean muscle fibers. J. Physiol. 120, 171-204 (1953).
  33. Fields, H. L., Kennedy, D. Functional role of muscle receptor organs in crayfish. Nature. 206 (990), 1235-1237 (1965).
  34. Fisher, L., Florey, E. Modulation of synaptic transmission and excitation-contraction coupling in the opener muscle of the crayfish, Astacus leptodactylus, by 5-hydroxytryptamine and octopamine. J. Exp. Biol.. 102, 187-198 (1983).
  35. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Anzeiger Akad. 18, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 275 (1881).
  36. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Sitzungsber. Akad. 85, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 9-46 (1881).
  37. Goldman, D. E. Potential, impedance, and rectification in membranes. J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943).
  38. Griffis, B., Bonner, P., Cooper, R. L. Sensitivity of transformed (phasic to tonic) motor neurons to the neuromodulator 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology A. 127, 495-504 (2000).
  39. Grundfest, H., Reuben, J. P. Neuromuscular synaptic activity in lobster. Nervous Inhibition. Florey, E. , Pergamon Press. Oxford. 92-104 (1961).
  40. Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Cellular mechanisms for modulation of posture by octopamine and serotonin in the lobster. J. Neurosci. 4, 1976-1993 (1984).
  41. Hagiwara, S., Chichibu, S., Naka, K. I. The effects of various ions on resting and spike potentials of barnacle muscle fibers. J. Gen. Physiol. 48, 163-179 (1964).
  42. Hille, B. Ionic Channels of Excitable Membranes. , 2nd, Sinauer Assoc. Sunderland, Mass. (1992).
  43. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. (Lond.). 117, 500-544 (1952).
  44. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F., Katz, B. Measurement of current-voltage relations in the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. (Lond.). 116, 424-448 (1952).
  45. Hodgkin, A. L., Katz, B. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid. J. Physiol. (Lond.). 108, 37-77 (1949).
  46. Hodgkin, A. L., Rushton, W. A. H. The electrical constants of a crustacean nerve fibre. Proc. Roy. Soc. 133, 444-479 (1946).
  47. Hörner, M., Weiger, W. A., Edwards, D. H., Kravitz, E. A. Excitation of identified serotonergic neurons by escape command neurons in lobsters. J. Exp. Biol. 200, 2017-2033 (1997).
  48. Huxley, T. H. The crayfish. , C. Kegan Paul and Co. London. (1880).
  49. Johnson, G. E. Giant nerve fibers in crustaceans with special reference to Cambaus and Palaemonetes. J. Comp. Neurol. 36, 323-373 (1924).
  50. Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramon, F. Interaction of anaesthetics with electrical synapses. Nature (Lond.). 286, 498-500 (1980).
  51. Katz, B., Miledi, R. The role of calcium in neuromuscular facilitation. J. Physiol. (Lond.). 195, 481-492 (1968).
  52. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of abdominal flexor muscles in the crayfish: the twitch system. J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).
  53. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of the abdominal flexor in the crayfish: the tonic system. J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).
  54. Kennedy, D., Selverston, A. I., Remler, M. P. Analysis of restricted neural networks. Science. 164, 1488-1496 (1969).
  55. Krasne, F. B. Excitation and habituation of the crayfish escape reflex: the depolarizing response in lateral giant fibres of the isolated abdomen. J. Exp. Biol. 50, 29-46 (1969).
  56. Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate measures in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comp. Biochem. Physiol A. 127, 55-70 (2000).
  57. Listerman, L., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Measures of heart rate during social interactions in crayfish and effects of 5-HT. Comp. Biochem. Physiol A. 125, 251-264 (2000).
  58. Livingstone, M. S., Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Serotonin and octopamine produce opposite postures in lobsters. Science. 208, 76-79 (1980).
  59. Lnenicka, G. A. Seasonal differences in motor terminals. Comp. Biochem. Physiol A. 104, 423-429 (1993).
  60. Lnenicka, G. A., Zhao, Y. Seasonal differences in the physiology and morphology of crayfish motor terminals. J. Neurobiol. 22, 561-569 (1993).
  61. Ma, P. M., Beltz, B. S., Kravitz, E. A. Serotonin containing neurons in lobsters: their role as 'gainsetters' in postural control mechanisms. J. Neurophysiol. 68, 36-54 (1992).
  62. Malmivuo, J., Plonsey, R. Bioelectromagnetism-Principles and Applications of Bioelectric and Biomagnetic Fields. , Oxford University Press. New York. (1995).
  63. McRae, T. On the postural effects induced in female Cherax destructor (Clark) by serotonin and octopamine. Freshwater Crayfish. 11, 293-298 (1996).
  64. Mercier, A. J., Atwood, H. L. Long-term adaptation of a phasic extensor motoneurone in crayfish. J. Exp. Biol. 145, 9-22 (1989).
  65. Monaghan, D. T., Bridges, R. J., Cotman, C. W. The excitatory amino acid receptors: their classes, pharmacology, and distinct properties in the function of the central nervous system. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 365-402 (1989).
  66. Moody, W. Gradual increase in the electrical excitability of crayfish slow muscle fibers produced by anoxia or uncouplers of oxidative phosphorylation. J. Comp. Physiol. 125, 327-334 (1978).
  67. Nernst, W. H. Zur Kinetik der Lösung befindlichen Körper: Theorie der Diffusion. Z. Phys. Chem. 3, 613-637 Forthcoming.
  68. Nernst, W. H. Die elektromotorische Wirksamkeit der Ionen. Z. Phys. Chem. 4, 129-181 Forthcoming.
  69. Pilgrim, R. L. C., Wiersma, C. A. G. Observations on the skeleton and somatic musculature of the abdomen and thorax of Procambarus clarkii (Girard), with notes on the thorax of Panulirus interruptus (Randall) and Astacus. J. Morphol. 113, 453-587 (1963).
  70. Robinson, M. M., Martin, J. M., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2325 (2011).
  71. Schneider, H., Budhiraja, P., Walter, I., Beltz, B. S., Peckol, E., Kravitz, E. A. Developmental expression of the octopamine phenotype in lobsters. J. Comp. Neurol. 371, 3-14 (1996).
  72. Skou, J. C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 439-446 (1989).
  73. Skou, J. C. The identification of the sodium-pump as the membrane-bound Na+/K+-ATPase: a commentary on 'The Influence of Some Cations on an Adenosine Triphosphatase from Peripheral Nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 435-438 (1989).
  74. Skou, J. C. Enzymatic basis for active transport of Na+ and K+ across cell membrane. Physiol. Rev. 45, 596-617 (1965).
  75. Skou, J. C. Nobel Lecture. The identification of the sodium pump. Biosci Rep. 18, 155-169 (1998).
  76. Sneddon, L. U., Taylor, A. C., Huntingford, F. A., Watson, D. G. Agonistic behavior and biogenic amines in shore crabs Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 203, 537-545 (2000).
  77. Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen. J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2000).
  78. Southard, R. C., Haggard, J., Crider, M. E., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Influence of serotonin on the kinetics of vesicular release. Brain Res. 871, 16-28 (2000).
  79. Stefani, E., Steinbach, A. B. Resting potential and electrical properties of frog slow muscle fibers. Effect of different external solutions. J. Physiol. 203, 383-401 (1969).
  80. Strawn, J. R., Neckameyer, W. S., Cooper, R. L. The effects of 5-HT on sensory neurons, CNS command, and neuromuscular junctions of the crayfish abdominal superficial flexor. Comp. Biochem. Physiol B. 127, 533-550 (2000).
  81. Takeuchi, A., Takeuchi, N. Anion permeability of the inhibitory post-synaptic membrane of the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (London). 191, 575-590 (1967).
  82. Tsunoyama, T., Gojobori, S. Evolution of Nicotinic Acetylcholine receptor Subunits. Mol. Biol. Evol. 15 (5), 518-527 (1998).
  83. Van Harreveld, A., Mendelson, M. Glutamate-induced contractions in crustacean muscle. J. Cell Comp. Physiol. 54, 85-94 (1959).
  84. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustaceans. Proc. Soc Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).
  85. Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. The Triple Innervation of the Crayfish Muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22 (11), 667 (1936).
  86. Vélez, S. J., Wayman, R. J. Synaptic connectivity in a crayfish neuromuscular system. I. Gradient of innervations and synaptic strength. J. Neurophysiol. 41, 75-84 (1978).
  87. Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. J. Gen. Physiol. 45, 267-308 (1961).
  88. Watkins, J. C. L-Glutamate as a central neurotransmitter: Looking back. Biochemical Society Transactions. 28, 297-310 (2000).
  89. Wiersma, C. A. G. The neuromuscular system. The Physiology of Crustacea. Waterman, T. H. II, Academic Press. New York. (1961).
  90. Wiersma, C. A. G. Reflexes and the central nervous system. The physiology of Crustacea. II, Academic Press. New York. 241-279 (1961).
  91. Wine, J. J., Mittenthal, J. E., Kennedy, D. The structure of tonic flexor motoneurons in crayfish abdominal ganglia. J. Comp. Physiol. 93, 315-335 (1974).
  92. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle. J. Vis. Exp. (45), e2319 (2010).
  93. Wyttenbach, R. A., Johnson, B. R., Hoy, R. R. Crawdad. A CD-ROM Lab manual for neurophysiology. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (1999).
  94. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. 3. Electrical junctions and dendrite spikes in fast flexor motoneurons. J. Neurophysiol. 35, 638-651 (1972).
  95. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. II. Physiological mechanisms underlying behavioral habituation. J. Neurophysiol. 35 (5), 621-637 (1972).
  96. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. I. Neural circuit exciting lateral giant fiber. J. Neurophysiol. 35 (5), 599-620 (1972).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 47 ، اللافقاريات ، جراد البحر ، علم الأعصاب والعضلات ، والتشريح والفيزيولوجيا الكهربية
الإمكانيات الغشاء ، الردود متشابك ، الدارات العصبية ، تعديل العمليات العصبية والأنسجة العضلية باستخدام جراد البحر : تمارين مختبر طالبة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baierlein, B., Thurow, A. L.,… More

Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322, doi:10.3791/2322 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter