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Neuroscience

झिल्ली क्षमता, Synaptic प्रतिक्रियाएँ Neuronal Circuitry, Neuromodulation और बलवान क्रेफ़िश प्रोटोकॉल का उपयोग: छात्र प्रयोगशाला व्यायाम

Published: January 18, 2011 doi: 10.3791/2322
Automatic Translation
*1, *1, *2, *1
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

प्रयोगों का प्रदर्शन छात्रों के लिए एक आसान दृष्टिकोण मांसपेशियों संरचना, synaptic प्रतिक्रियाओं, आयन gradients और झिल्ली क्षमता पर पारगम्यता के प्रभाव की जांच में अनुभव हासिल है. इसके अलावा, एक सीएनएस संवेदी मोटर मांसपेशियों सर्किट neuronal सर्किट पर यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण का मतलब दिखाने के लिए प्रस्तुत किया है.

Abstract

इस रिपोर्ट का उद्देश्य एक जैविक झिल्ली भर आयन gradients की वजह से प्रभाव की समझ को विकसित करने में मदद की है. (1) की झिल्ली बाहर कश्मीर + आयन एकाग्रता, और (2) विशिष्ट आयनों की झिल्ली की पारगम्यता: दो पहलुओं कि एक कोशिका झिल्ली की क्षमता को प्रभावित और इन प्रयोगों में जो हम पता कर रहे हैं. क्रेफ़िश पेट extensor मांसपेशियों कुछ (धीमा) टॉनिक और दूसरों को उनके जैव रासायनिक और शारीरिक phenotypes में phasic (तेज), के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनकी संरचना में के साथ समूहों में हैं, मोटर न्यूरॉन्स है कि इन मांसपेशियों अंदर आना तदनुसार कार्यात्मक विशेषताओं में अलग हैं. हम इन मांसपेशियों के रूप में सतही, टॉनिक पेट flexor मांसपेशियों के रूप में अच्छी तरह से उपयोग synaptic प्रसारण में गुण प्रदर्शित. इसके अलावा, हम शुरू करने के लिए एक संवेदी सीएनएस - मोटर न्यूरॉन पेशी सर्किट सर्किट के कुछ पहलुओं पर cuticular संवेदी उत्तेजना के प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neuromodulators के प्रभाव का प्रदर्शन. इस अभ्यास में प्राप्त तकनीक के साथ, एक करने के लिए कई अन्य प्रयोगात्मक तैयारी में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शारीरिक चिकित्सा और स्वास्थ्य से संबंधित अनुप्रयोगों में शेष सवालों का जवाब शुरू कर सकते हैं. हम मॉडल invertebrate की तैयारी की उपयोगिता के लिए सभी पशुओं को उचित मौलिक सवालों के पते का प्रदर्शन किया है.

Protocol

1. परिचय

प्रयोगशाला अभ्यास के इन लक्ष्यों को उत्तेजनीय झिल्ली के गुणों, आराम झिल्ली क्षमता के ईओण का आधार है, और विधियों को समझने के लिए झिल्ली क्षमता को मापने हैं. इसके अलावा, धुंधला हो जाना और मांसपेशियों के ऊतक विज्ञान प्रस्तुत है, जो मांसपेशियों संरचना को सिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, dissected तैयारी की दो अलग अलग प्रकार के विभिन्न समूहों की मांसपेशी में synaptic प्रसारण के गुणों का प्रदर्शन किया जाता है. पूरा संवेदी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) क्रेफ़िश पेट में मोटर प्रणाली सर्किट न्यूरॉन - मांसपेशियों को भी संवेदी उत्तेजना और एक सर्किट के पहलुओं पर neromodulators और न्यूरोट्रांसमीटर के प्रभाव की जांच के लिए एक तैयारी पेश करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

इस रिपोर्ट के पहले भाग के लिए आराम झिल्ली क्षमता और झिल्ली क्षमता पर कोशिकी + K के प्रभाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. हम यह भी मांसपेशियों संरचना मिलवा देंगे. इस अभ्यास के दूसरे भाग में, हम neuromuscular जंक्शनों (NMJs) के विभिन्न प्रकार के से synaptic प्रतिक्रियाओं को मापने के विभिन्न मतलब उपस्थित थे. पहला अभ्यास क्रेफ़िश पेट extensor मांसपेशियों का उपयोग करता है और दूसरा पेट सतही flexor मांसपेशियों का उपयोग करता है. इसके अलावा, हम एक तंत्रिका सर्किट है कि बनाए रखने के लिए आसान है (संवेदी आदानों और मोटर outputs के साथ क्रेफ़िश के उदर तंत्रिका कॉर्ड) मौजूद है, और जो शिक्षण के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुसंधान के लिए एक संवेदी सीएनएस के विभिन्न पहलुओं में इस्तेमाल किया जा सकता मोटर न्यूरॉन - मांसपेशियों सर्किट. प्रारंभिक अभ्यास के विवरण को पूरा करने के बाद, हम NMJs और CNS के सर्किट के शरीर क्रिया विज्ञान प्रस्तुत करते हैं.

एक जैविक झिल्ली भर आयन ढाल एक संभावित अंतर में परिणाम कर सकते हैं. आराम में एक सेल के लिए, कोशिका झिल्ली भर में बिजली के प्रभारी में इस सेल के आराम झिल्ली संभावित अंतर के रूप में जाना जाता है. वहाँ दो मुख्य कारक हैं हम कि प्रभावित कोशिका झिल्ली की क्षमता को संबोधित करेंगे रहे हैं. पहले झिल्ली के दोनों तरफ आयन एकाग्रता है. दूसरा झिल्ली के ईओण पारगम्यता है. यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि एक जीवित कोशिका में सेल के अंदर और बाहर अलग सांद्रता के साथ अलग आयनों के एक नंबर रहे हैं. कुंजी आयनों हम को संबोधित करेंगे सोडियम (+ ना), पोटेशियम (+ K) और क्लोराइड (Cl). मात्रा और एक मांसपेशी झिल्ली भर में इन आयनों के आंदोलन झिल्ली क्षमता निर्धारित करता है. इस नींव से, हम बिजली और synaptic प्रतिक्रियाओं से एक झिल्ली की उत्तेजना निषेध के दौरान मनाया बिजली क्षमता का पता और औषधीय एजेंटों के प्रभाव की जांच कर सकते हैं. हम भी biophysical मॉडल का निर्माण करने के लिए प्रयोगात्मक परीक्षण अवधारणाओं (रॉबिन्सन एट अल., 2010) के लिए इन प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.

गिलास केशिका microelectrodes के उपयोग झिल्ली क्षमता की रिकॉर्डिंग परमिट. इलेक्ट्रोड क्षति के बिना कोशिका झिल्ली के माध्यम से डाला जा सकता है, प्रदान टिप काफी छोटा है और transmembrane क्षमता का एक सटीक उपाय प्राप्त किया जा सकता है. तकनीक विशेष रूप से बड़े कोशिकाओं है, जो कम intracellular इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि द्वारा क्षतिग्रस्त होने की संभावना हैं करने के लिए लागू है. यह एक शरीर क्रिया विज्ञान में आवश्यक तकनीकों का है.

ना - कश्मीर शारीरिक शर्तों के तहत ATPase पंप से ना + और कश्मीर की झिल्ली भर + संतुलन बनाए रखा है. सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत पंप चाल, औसत पर, तीन ना + और सेल में दो + K सेल के. एक तरफ ध्यान दें के रूप में, रसायन शास्त्र में नोबेल पुरस्कार 1997 में इस खोज के लिए देर से 1950 में वापस कर दिया सम्मानित किया गया. खोज की बुनियादी बातों में एक केकड़ा (Skou, 1965, +१९९८) से axons का उपयोग अनुसंधान से प्राप्त किया गया.

इस पंप भी electrogenic माना जाता है के रूप में यह एक बड़ा पंप जब झिल्ली depolarized है की क्षमता (Skou, 1989a, ख) है. कई कोशिकाओं में, पंप गति जब एक सेल विद्युत विध्रुवण द्वारा सक्रिय है.

पोटेशियम भी पोटेशियम "लीक" चैनलों के माध्यम से स्थानांतरित जबकि एक कक्ष में एक आराम की स्थिति में है. इन पोटेशियम रिसाव चैनलों के कारण, बाकी पर सेल अन्य आयनों से अधिक पोटेशियम के लिए पारगम्य झिल्ली है. इस प्रकार, सेल के आराम झिल्ली संभावित सोडियम के लिए तुलना में पोटेशियम संतुलन के लिए क्षमता के लिए करीब है. आराम झिल्ली की क्षमता तो देखने के लिए अगर यह पोटेशियम संतुलन की क्षमता पर निर्भर करता है की जांच किया जा सकता है.

1) बलवान परिवर्तनशीलता

Crustacean मांसपेशी फाइबर संरचनात्मक सुविधाओं, झिल्ली बिजली के गुणों और सिकुड़ा गुणों की तुलना में हड्डीवाला मांसपेशी फाइबर की अधिक से अधिक परिवर्तनशीलता दिखा. क्रसटेशियन में phasic मांसपेशी फाइबर चिकोटी - प्रकार संकुचन के लिए संशोधित कर रहे हैं. वे कम sarcomere लंबाई (2-4 microns), पतली, सीधे जेड लाइनों, मोटी myofilaments करने के लिए पतली की एक कम अनुपात, और टी tubules और sarcoplasmic की अच्छी तरह से विकसित प्रणाली द्वारा विशेषता कर रहे हैंजालिका. Phasic मांसपेशी फाइबर झिल्ली वर्गीकृत या सभी या कोई भी कार्रवाई क्षमता उत्पन्न कर सकते हैं. टॉनिक मांसपेशी फाइबर, दूसरे हाथ पर, तनाव के लंबे समय तक रखरखाव के लिए संशोधित कर रहे हैं. वे अक्सर 10 से 15 microns, मोटी, लहराती Z लाइनों, मोटी myofilaments करने के लिए पतली की एक उच्च अनुपात, और कम अच्छी तरह से विकसित प्रणालियों टी tubules और sarcoplasmic जालिका sarcomere लंबाई है. टॉनिक मांसपेशी फाइबर झिल्ली अक्सर विद्युत inexcitable, या वे वर्गीकृत बिजली प्रतिक्रियाओं का उत्पादन ("वर्गीकृत spikes") हो सकता है. मध्यवर्ती फाइबर प्रकार के एक विस्तृत रेंज crustacean मांसपेशियों में पाया जाता है.

2) समीकरण

समीकरण है कि आमतौर पर एक आयन और आराम झिल्ली क्षमता का संतुलन क्षमता का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है नेर्न्स्ट समीकरण और गोल्डमैन Hodgkin है Katz समीकरण (GHK) क्रमशः रहे हैं. दो समीकरणों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि नेर्न्स्ट समीकरण केवल एक विशिष्ट आयन कि आयन के लिए संतुलन की क्षमता का निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि GHK समीकरण कई आयनों और उनके gradients की पारगम्यता भर पर विचार करके आराम क्षमता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक कोशिका झिल्ली (नेर्न्स्ट, 1888, 1889, गोल्डमैन, 1943; Hodgkin है और हक्सले, 1952; Hodgkin एट अल, 1952, Hodgkin है और Katz, 1949; Hille, 1992 देखें).

नेर्न्स्ट समीकरण आम तौर पर एक एक इलेक्ट्रोमोटिव जैसा कि आमतौर पर के रूप में दिखाया बल पैदा झिल्ली भर आयनों के लिए माना जाता है:

वी = ln (आरटी / ZF) ([एक्स] / बाहर [एक्स])

एक्स ब्याज की = आयन
वी = एक्स आयन के लिए झिल्ली भर में संतुलन वोल्टेज
आर गैस = निरंतर [8.314 / जम्मू (mol • कश्मीर)]
टी = निरपेक्ष तापमान [केल्विन]
जेड = आयन के valence
F = है फैराडे निरंतर [9.649 4 x 10 / सी mol]

+ K आयन 20 डिग्री सेल्सियस और एल.एन. के परिवर्तन करने के लिए 10 स्थिरांक में भरने के साथ लॉग इन करें, एक पर आता है:

संभावित = 58 ([कश्मीर के बाहर] / [कश्मीर] में) लॉग, एम वी में व्यक्त

चलो हमें लगता है कि केवल + K प्रसार द्वारा permeant है कि . [कश्मीर में] कश्मीर + और ​​[बाहर] कश्मीर सेल के अंदर पर एकाग्रता कश्मीर + सेल के बाहर पर एकाग्रता.

[कश्मीर] में एक व्यायाम अनुमान के रूप में. ______________

इस गणना के लिए मान लें, झिल्ली संभावित + K संतुलन क्षमता पर ही निर्भर है.

को देखते हुए [कश्मीर बाहर] = इस्तेमाल किया खारा के लिए 5.4 मिमी है . इसके अलावा, झिल्ली की क्षमता है 70mV-मान.

संभावित = 58 लॉग (/ 5.4 [में कश्मीर]).

प्रयोग में हम एक सेल आराम झिल्ली क्षमता को मापने और निर्धारित कैसे यह [के] बदलकर प्रभावित है . काल्पनिक [] कश्मीर बाहर झिल्ली क्षमता और संबंधित लाइन की ढलान 58 है. आराम झिल्ली में विभिन्न संभावित [कश्मीर बाहर] (5.4 मिमी से 100 मिमी रेंज) पर डेटा इकट्ठा करने के बाद हम मनाया मूल्यों की साजिश करने के लिए निर्धारित करती है कि काल्पनिक रेखा के साथ एक मैच है . हम तुलना के लिए काल्पनिक और मनाया लाइनों की शुरुआत के लिए औसत आराम झिल्ली [बाहर कश्मीर] 5.4 मिमी पर प्राप्त की संभावना का उपयोग करेगा.

यह देखते हुए कि एक से अधिक आयन के लिए एक झिल्ली पारगम्य आराम में, विभिन्न depolarized राज्यों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कर सकते हैं, एक GHK समीकरण का उपयोग करता है के लिए खाते में विभिन्न आयनों के लिए पारगम्यता (समीकरण में पी) ले. GHK समीकरण नेर्न्स्ट समीकरण को कम अगर केवल एक आयन के लिए एक झिल्ली पारगम्य है.

यहाँ ना + + K, और सीएल के लिए एक सामान्यीकृत GHK समीकरण है - आयनों :

समीकरण

चूंकि सीएल - एक नकारात्मक चार्ज है, एकाग्रता अवधि के अंदर और बाहर के लिए इस समीकरण में उलटा है . यह जेड (आयन प्रभारी) से नहीं छोड़ा जा सकता अनुमति देता है.

3) इस अभ्यास का उद्देश्य

इस प्रयोग में हम एक क्रेफ़िश मांसपेशी कोशिका की झिल्ली की क्षमता को मापने और पता करने के लिए ऊपर चर्चा सिद्धांतों को लागू करेंगे:

  1. कैसे उचित उपकरण और तकनीक के साथ एक कोशिका झिल्ली की क्षमता को मापने के लिए.
  2. मांसपेशी कोशिका झिल्ली के आयन पारगम्यता और कैसे यह झिल्ली क्षमता के लिए योगदान देता है.

    इसके अलावा, हम मांसपेशियों की संरचना का एक प्रारंभिक अध्ययन करना होगा:
  3. दाग का प्रयोग करें क्रेफ़िश पेट, जो इन electrophysiological प्रयोगों का आयोजन करने के लिए प्रयोग किया जाता है पृष्ठीय पहलू में मांसपेशियों का शरीर रचना विज्ञान पर प्रकाश डाला.
  4. विभिन्न मांसपेशी फाइबर प्रकार के ऊतक विज्ञान जांच.

इस प्रयोगशाला अभ्यास में, हम क्रेफ़िश पेट extensor मांसपेशियों का प्रयोग करेंगे. इस तैयारी के अतीत में इस्तेमाल किया गया है फिजियोलॉजी में इन सिद्धांतों सिखाने एकघ शरीर रचना विज्ञान (Atwood और Parnas, 1968). हम इस स्रोत और संशोधित दूसरों से प्रक्रियाओं के कई इस्तेमाल किया है वर्तमान इंस्ट्रूमेंटेशन को समायोजित करने के लिए और एक एकल 3 घंटे छात्र प्रयोगशाला अवधि में लक्ष्य को पूरा. इन अभ्यासों अन्य पशु जीव विज्ञान विभाग में फिजियोलॉजी कोर्स केंटकी के विश्वविद्यालय (प्रशिक्षक डा. आरएल कूपर, 2010) में में प्रयोग किया जाता प्रयोगों के लिए नींव हैं.

4) इस मॉडल क्यों जानवर

इस प्रयोग में क्रेफ़िश पेट extensor मांसपेशियों का उपयोग करने के लिए कई अच्छे कारण हैं:

  1. क्रेफ़िश आमतौर पर उपलब्ध हैं और प्रयोगशाला परिस्थितियों में अपेक्षाकृत सस्ते हैं और बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं.
  2. विच्छेदन जीने की तैयारी के लिए विच्छेदन तकनीक सीखने के छात्रों के लिए अपेक्षाकृत आसान है.
  3. मांसपेशी जो electrophysiological तकनीक सीखने के छात्रों के लिए अच्छी तरह से कार्य करता है एक न्यूनतम सामान्य खारा में कई घंटे के लिए स्थिर है. मांसपेशी की तैयारी काफी मजबूत है जब बाहरी [+ K] कम समय अवधि के लिए बदल दिया है.
  4. विभिन्न synaptic प्रतिक्रिया आसानी से मोटर न्यूरॉन्स उत्तेजक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
  5. extensor मांसपेशियों के संरचनात्मक व्यवस्था के लिए विचार करने के लिए आसान है, और उनके बड़े आकार की वजह से यह अपेक्षाकृत स्थिर intracellular रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए आसान है.
  6. मांसपेशियों और innervation पैटर्न methylene नीले धुंधला के साथ आसानी से देखा जा. इसके अलावा, विशेष रूप से मांसपेशी फाइबर प्रकार ऊतक विज्ञान के लिए आसानी से संसाधित किया जा sarcomere संरचना का पालन कर सकते हैं.
  7. कोई जानवर प्रोटोकॉल invertebrate जानवरों की तैयारी के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका के भीतर कई संस्थानों में प्रयोगशाला प्रयोगों में इस समय की जरूरत है.

2. तरीके

1) सामग्री

  • कैंची (1)
  • संदंश (1)
  • जमीन तार के लिए सिल्वर वायर (1)
  • माइक्रोस्कोप (1)
  • इलेक्ट्रोड जांच (1)
  • Sylgard के साथ नीचे पर पेट्री डिश (1)
  • नमकीन घोल (1)
  • पोटेशियम समाधान: 5.4mM (सामान्य नमक), 10, 20, 40, 80, 100 मिमी
  • ब्लीच (छोटी राशि, चांदी के तार की नोक के लिए प्रयोग एजी-सीएल निर्माण)
  • ग्लास (1) पिपेट, हटाने और के समाधान जोड़ने
  • सिरिंज (1)
  • एम्पलीफायर / अधिग्रहण प्रणाली (1)
  • फैराडे पिंजरे (1)
  • डेस्कटॉप / लैपटॉप (1)
  • विच्छेदन पिंस (4)
  • क्रेफ़िश

2) तरीकों

2.1) / तैयार विच्छेदन:

  1. एक क्रेफ़िश शरीर की लंबाई में 6-10 लगभग सेमी (या एक प्रबंधनीय आकार) प्राप्त किया जाना चाहिए. सिर के पीछे में क्रेफ़िश या आँखों के पीछे से लगभग एक सेंटीमीटर पकड़ो. सुनिश्चित करें कि क्रेफ़िश या उसके मुंह के पंजे क्रेफ़िश से निपटने व्यक्ति तक नहीं पहुँच सकते. (क्रेफ़िश कुचल बर्फ में 5 मिनट के लिए रखा जा सकता है इसे करने के लिए बंद सिर काटने से पहले anesthetize.)
  2. बड़ी कैंची का प्रयोग करने के लिए जल्दी से सिर हटायें. क्रेफ़िश की आँखों के पीछे से एक स्वच्छ और जल्दी काट बनाओ. सिर और appendages के निपटान.
    चित्रा 1
    चित्रा 1 छवि कटौती क्रेफ़िश के सिर को हटाने के स्थान से पता चलता है.
  3. पैर और क्रेफ़िश के पंजे में इस बिंदु पर हटाया जा सकता है के लिए चोट से बचने के लिए. पुरुषों और दोनों पुरुषों और महिलाओं पर swimmerets पर Stylets भी हटाया जा सकता है (चित्रा 2). अगले, छाती से पेट अलग. Articulating झिल्ली जो पेट और छाती (चित्रा 3) में मिलती है साथ में कटौती करें. क्रेफ़िश के पेट भाग सहेजें और छाती के निपटान.
    चित्रा 2
    चित्रा 2. कैंची stylets काट रहे हैं. ये क्रेफ़िश से हटाया जा सकता है है.
    चित्रा 3
    चित्रा 3. छवि कटौती की नियुक्ति के पेट से छाती हटाने से पता चलता है.
    चित्रा 4
    पेट से चित्रा 4 छाती का हटाया जाना. कटौती परिपत्र फैशन में रेखा के साथ क्षेत्रों के शामिल होने में बनाया जाना चाहिए.
    चित्रा 5
    चित्रा 5 शीर्ष छवि swimmeret appendages के साथ पेट से पता चलता है. नीचे की छवि swimmeret appendages के बिना पेट से पता चलता है.
  4. पेट के साथ, एक कट निचले पेट के प्रत्येक पक्ष के पार्श्व सीमा के साथ खोल में बना होना चाहिए. केयर क्रेफ़िश में भी गहराई में कटौती नहीं लिया जाना चाहिए. खोल काटने की प्रक्रिया में मदद करने के लिए, कट उदर पक्ष की ओर और एक कोण पर नीचे slighting ओर इशारा करते हुए कैंची के साथ किया जाना चाहिए. क्रेफ़िश कि प्रत्येक खंड (चित्रा 6) की लंबाई को चलाने के लाइनों की प्राकृतिक खोल पैटर्न का पालन करें.
    चित्रा 6
    चित्रा 6. कैंची एक कोण पर रखा जाता है और खोल के प्राकृतिक संरेखण का पालन करें. कटौती भी गहरी और तैयारी को नष्ट मत करो. प्रत्येक खंड है कि कटौती के लिए पीछा किया जाना चाहिए के साथ प्राकृतिक पंक्ति को इंगित तीर सिर.
  5. खोल के उदर भाग निकालें. ध्यान रखना करने के लिए उदर की मांसपेशियों को नष्ट नहीं. संदंश का प्रयोग करें उदर भाग को हटाने. जब खोल के उदर भाग को निकाल दिया जाता है, ऊतक के एक सफेद जन गहरी flexor मांसपेशियों के शीर्ष पर देखा जा सकता है. इस ऊतक संदंश के साथ सावधानी से हटाया जा सकता है.
    7 चित्रा
    7 चित्रा संदंश के साथ खोल के उदर भाग निकालना. ऊपर खींचो और निकालना उदर भाग पर वापस. वेंट्रल खोल के तहत मांसपेशियों को नष्ट मत करो.
    8 चित्रा
    8 चित्रा खोल जो त्याग किया जाता है के उदर भाग पर वापस खींच.
    9 चित्रा
    9 चित्रा कैंची के साथ तैयार करने के उदर भाग कट और त्यागें .
  6. GI पथ, एक छोटे से गहरी flexor मांसपेशियों के midline साथ चल रहा है ट्यूब, क्रेफ़िश से हटाया जा सकता है. संदंश के साथ पथ के शीर्ष चुटकी और पेट से दूर खींच. पूंछ के अंत में - पथ के नीचे कट. नमक के साथ विच्छेदन कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें fecal अपशिष्ट तैयारी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.
    10 चित्रा
    10 चित्रा छवि तैयारी से GI पथ के हटाने से पता चलता है.
  7. पेट्री डिश के लिए तैयारी सुरक्षित विच्छेदन पिन का उपयोग करें. तैयारी के ऊपर और नीचे कोनों पकवान नीचे टिकी चाहिए. नमकीन घोल पेट्री डिश में डाला जाना चाहिए और तैयारी पूरी तरह से कवर तक intracellular रिकॉर्डिंग प्रदर्शन कर रहे हैं.
    यह विच्छेदन पकवान तल पर एक Sylgard (डॉव Corning) कोटिंग (1cm मोटी) इतना है कि कीट पिन में अटक किया जा सकता है है चाहिए.
    Dissected तैयारी मानक क्रेफ़िश खारा में स्नान कर रहे हैं, वान Harreveld समाधान (1936), जो 205 NaCl के साथ बनाया है से संशोधित; 5.3KCl; 13.5 2 CaCl, 2H 2 हे, 2.45 2 MgCl, 6 2 हे, 5 HEPES और पीएच को समायोजित 7.4 (मिमी में).

2.2) Intracellular रिकॉर्डिंग

11 चित्र
11 चित्रा रिकॉर्डिंग उपकरणों के कुल मिलाकर सेटअप .

  1. तैयारी के साथ पेट्री डिश खुर्दबीन के नीचे रखा जाना चाहिए और डिश के आंदोलन को रोकने के नीचे मोम के साथ सुरक्षित है.
    12 चित्रा
    12 चित्रा खुर्दबीन के नीचे तैयार करने के स्थान . मोम का प्रयोग करें पेट्री डिश और तैयारी सुरक्षित.
  2. चांदी के तार के एक छोर से जुड़ी एक छोटी लंबाई के साथ प्रत्येक दो तारों प्राप्त होना चाहिए. चांदी के तार के बारे में 20 मिनट के लिए ब्लीच की एक छोटी राशि में डूबा कोटिंग एजी-सीएल प्राप्त होना चाहिए. पानी के साथ प्रयोग करने से पहले तार धो लें. एक गिलास intracellular विंदुक और प्राप्त किया जाना चाहिए और ध्यान से एक लंबी सुई के साथ एक 3M KCl समाधान के साथ भरा सिरिंज से जुड़ी backfilled. विंदुक नीचे कर दिया जाना चाहिए (खोलने के साथ मंजिल का सामना करना पड़ रहा) और समाधान के साथ भरा. इससे यह सुनिश्चित होगा कि किसी भी अतिरिक्त KCl इलेक्ट्रोड के पीछे ड्रिप जाएगा. सुनिश्चित करें कि कोई KCl कि खारा स्नान में प्रवेश करेंगे कांच विंदुक के साथ चलाता है. विंदुक ईमानदार मुड़ें जब पोटेशियम क्लोराइड समाधान के साथ भरने समाप्त. चांदी के तार तो पिपेट में रखा जा सकता है. दूसरे छोर + प्रवर्धक सिर मंच पर ध्रुव (सकारात्मक) से जुड़ा है. विंदुक तो इलेक्ट्रोड जांच पर सुरक्षित है. केयर इलेक्ट्रोड टिप नहीं तोड़ करने के लिए किया जाना चाहिए. फैराडे पिंजरे से जुड़ी एक तिहाई तार सिर मंच की हरी पोल में रखा जाना चाहिए. (नकारात्मक) नीचे दिखाया पोल - शेष नेतृत्व के अन्त एजी तार स्नान और अन्य संलग्न करने के लिए अंत में रखा जाना चाहिए. तार भी फैराडे पिंजरे से ई. कनवर्टर Powerlab की जमीन भाग के लिए रखा जाना चाहिए. सिर मंच अधिग्रहण / प्रवर्धक (Powerlab) पर 'इनपुट जांच' से जुड़ा है.
    13 चित्रा
    13 चित्रा प्रमुख मंच विन्यास. सिर मंच की हरी इनपुट से जुड़े तार एम्पलीफायर या फैराडे पिंजरे के लिए आधारित है. लाल इनपुट से जुड़े तार बिजली तार से जुड़ा है. काले इनपुट स्नान समाधान के लिए कनेक्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    14 चित्रा
    14 चित्रा "टॉगल टेस्ट" नीचे पंक्ति में परीक्षण करने के लिए इलेक्ट्रोड resistance.The "मोटे" घुंडी भी पाया जाता हैडीसी ऑफसेट के तहत जो काउंटर बुद्धिमान घड़ी दिया जाना चाहिए. लाभ 50 है, जो पचास का एक पहलू द्वारा संकेतों amplifies सेट कर दिया जाता है. सिर मंच से जमीन तार "GND" पिन जैक खोलने में रखा गया है.
  3. LabChart सॉफ्टवेयर डेस्कटॉप या लैपटॉप पर खोला जाना चाहिए. चार्ट को समायोजित करें "सेटअप", तो क्लिक करके केवल एक चैनल प्रदर्शित के "चैनल सेटिंग्स." के तहत चैनलों की "चैनल सेटिंग्स," परिवर्तन नंबर एक. पर क्लिक करें "ठीक है." चार्ट, बाएँ हाथ के कोने के शीर्ष पर, प्रति सेकंड चक्र 2K होना चाहिए. (Y-अक्ष) वोल्ट सेट 200mV के आसपास 500mV करने के लिए. पर क्लिक करें "1 चैनल" स्क्रीन के दाहिने हाथ भाग पर. "इनपुट प्रवर्धक." पर क्लिक करें. सुनिश्चित करें विभेदकों बॉक्स की जाँच की है.

    एम्पलीफायर उत्पादन में एक चैनल में होना चाहिए. निम्न सेटिंग्स प्रवर्धक के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए:
    • हाई - पास डीसी
    • पायदान फ़िल्टर-रवाना
    • निम्न दर्रा 20kHz
    • क्षमता Comp .- वामावर्त
    • डीसी ऑफसेट ठीक है और घुंडी वामावर्त कोर्स
    • डीसी (+ रवाना) ऑफसेट - रवाना
    • 50 - लाभ घुंडी
    • (अन्तर मोनो GND) इनपुट - diff
    • MODE - आरईसी (Stim गेट आरईसी)
    • ΩTEST-रवाना
  4. इलेक्ट्रोड प्रतिरोध का एक उपाय के रूप में, वोल्टेज वर्तमान, जो 2.0 NA (ie., आर वी = / मैं, या ओम कानून) द्वारा विभाजित किया जाना चाहिए. जिसके परिणामस्वरूप मूल्य कांच इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध है. प्रतिरोध 20 से 60 MegaOhms होना चाहिए. (लोअर <20) और उच्च प्रतिरोध (> 100) स्वीकार्य नहीं हैं. एक बार प्रतिरोध निर्धारित किया गया है, intracellular रिकॉर्डिंग शुरू कर सकते हैं. खारा स्नान में कांच इलेक्ट्रोड की नोक रखें. सुनिश्चित करें कि एक जमीन तार खारा स्नान में भी.
    रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए, स्क्रीन के नीचे स्थित शुरू दबाएँ. सुनिश्चित करें कि लाभ 5 वी / div सेट कर दिया जाता है. एम्पलीफायर पर बेशक घुंडी प्रयोग LabChart पर इलेक्ट्रोड डालने से पहले लाइन शून्य करने के लिए कदम. टॉगल घुंडी तो पर और बंद कई बार दिया जाना चाहिए क्रम में करने के लिए इलेक्ट्रोड प्रतिरोध परीक्षण. अगला, परिणामस्वरूप मूल्यों के आयाम मापा जाना चाहिए. स्थिर बेस लाइन पर एक मार्कर प्लेस और फिर चरम पर दूसरे स्थान पर इलेक्ट्रोड प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए.
  5. इलेक्ट्रोड जांच और माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए तैयारी के अनुदैर्ध्य (DEM या DEL1 या DEL2) की मांसपेशियों (चित्र 16 देखें) में इलेक्ट्रोड डालने. इलेक्ट्रोड मांसपेशियों मुश्किल में डाला जाना चाहिए. मांसपेशियों के माध्यम से प्रवेश मत करो. खुर्दबीन और जांच सेटिंग्स का उपयोग क्रम में अनुदैर्ध्य मांसपेशियों को खोजने के लिए और मांसपेशियों में इलेक्ट्रोड सम्मिलित है. उच्च तीव्रता के प्रकाशक के लिए स्पष्ट रूप से मांसपेशियों के रूप में इलेक्ट्रोड डाला जा रहा है समायोजित किया जाना चाहिए. जब इस तैयारी में मांसपेशी फाइबर poking आमतौर पर मांसपेशियों के भीतर रिक्त स्थान और clefts में चला सकते हैं. यही कारण है क्यों झिल्ली संभावित फिर गायब हो जाते हैं, तो फिर से प्रकट होना प्रकट कर सकते हैं.
    15 चित्रा
    15 चित्रा इलेक्ट्रोड मांसपेशियों में निवेशन.
  6. झिल्ली की क्षमता को मापने के लिए, एम्पलीफायर पर मोटे घुंडी उपयोग LabChart पर इलेक्ट्रोड डालने से पहले लाइन शून्य करने के लिए कदम. एक मांसपेशी फाइबर प्रहार. अगले परिणामस्वरूप मूल्यों के आयाम को मापने. स्थिर बेस लाइन पर एक मार्कर प्लेस और मूल्य रिकॉर्ड.
    मार्कर में अंतर और सक्रिय कर्सर स्क्रीन के दाईं ओर प्रदर्शित होता है. मूल्य वोल्टेज देता है. दर्ज वोल्टेज प्रवर्धन की राशि प्रवर्धक पर इस्तेमाल किया (यानी 10x या 100x प्रवर्धन) द्वारा विभाजित किया जा आवश्यकता हो सकती है. वोल्टेज वोल्ट से millivolts (1 वी = 1000 mV) के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए अगर मान वोल्ट के रूप में सॉफ्टवेयर पर रिपोर्ट कर रहे हैं.
  7. ध्यान खुर्दबीन और manipulators का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों से इलेक्ट्रोड हटाने. एक और मांसपेशी फाइबर प्रहार और आराम झिल्ली संभावित ध्यान दें. एक कई रिकॉर्डिंग लेने के लिए और उपायों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ब्याज की मांसपेशी फाइबर में कहनेवाला इलेक्ट्रोड निर्देशन के साथ सहज होना चाहिए.
    इलेक्ट्रोड शायद एक मांसपेशी फाइबर में सब अलग अलग [+ K] बाहर समाधान बदल बदल के दौरान नहीं रहेगी . यह सबसे अच्छा है इलेक्ट्रोड वापस लेने, तो समाधान को बदलने के लिए, तो फिर घुसना मांसपेशी हानिकारक से बचने के. यह सबसे अच्छा है अलग मांसपेशी फाइबर से समाधान प्रति 3 रीडिंग प्राप्त करने और एक औसत का उपयोग करने के लिए किसी भी नकली रीडिंग से बचने के लिए.
  8. एक सिरिंज का उपयोग हटाने और पेट्री डिश से नमकीन घोल त्यागें. पेट्री डिश पोटेशियम क्लोराइड नमकीन घोल के अगले उच्च एकाग्रता, तैयारी पूरी तरह से कवर के साथ भरा जाना चाहिए. उसी प्रक्रिया प्रत्येक पोटेशियम समाधान के साथ दोहराया जाना चाहिए और वोल्टेज / क्षमता में परिवर्तन और ध्यान दिया जाना चाहिए दर्ज की. : 5.4, 20, 40, 60, 80, 100 मिमी की श्रृंखला [K +] क्रेफ़िश खारा समाधान का उपयोग हम बाहर हैं.

2.3) एनाटॉमी

अब जब कि शरीर क्रिया विज्ञान पूरा हो गया है, हम जुड़े जांच कर सकते हैंमांसपेशी फाइबर और innervation पैटर्न का शरीर रचना विज्ञान. धुंधला पकवान तैयारी स्थानांतरण और methylene नीले (methylene नीले क्रेफ़िश खारा के 100 एमएल के साथ मिश्रित की 1 ग्राम) जोड़ें. चलो खारा 5 मिनट के लिए तैयार स्नान और तब हटाने और दाग के बिना ताजा क्रेफ़िश खारा जोड़ने. इन मांसपेशियों का शरीर रचना विज्ञान से अधिक वर्षों के विस्तार में वर्णित किया गया है (हक्सले, 1880, तीर्थ और Wiersma, 1963). हाल ही में कुछ मांसपेशियों के anatomically है वर्णित किया गया है, और physiologically biochemically (कूपर एट अल, 1998, Griffis एट अल, 2000;. Sohn एट अल, 2000).

मांसपेशियों के सामान्य संरचनात्मक लेआउट 16 चित्रा (इस प्रयोजन के लिए आंकड़ा के दाईं ओर) में दिखाया गया है. मुख्य तंत्रिका है कि मुख्य रूप से एक खंड के भीतर मांसपेशियों innervates के लिए देखो. Innervation SEM, DEL2, DEL1 और एक खंड में DEM मांसपेशियों पैटर्न स्केच. यह पेट के लिए बाहर पकवान में तैयारी मजबूती लगाए द्वारा पूरी तरह से बढ़ाया जा की जरूरत है. अगला खारा हटाने और लगानेवाला समाधान जोड़ें. तय समाधान एक BOUIN के समाधान, सिग्मा Aldrich कं संतृप्त picric एसिड, formaldehyde और एसिटिक एसिड के साथ तैयार है.

चेतावनी. आपकी त्वचा पर या तुम्हारी आँखों में इस समाधान प्राप्त नहीं करो. धूआं हुड के तहत काम करके समाधान के वाष्पकणों से बचें. यदि आपकी आँखें अपनी आँखें धो आंख धोने स्टेशन पर जला तुरंत शुरू करते हैं.

BOUIN समाधान के बारे में 10 मिनट के लिए तैयारी पर बनी रहती है और फिर एक विंदुक और खारा के लिए समाधान विनिमय का उपयोग. DEL1 या DEL2 मांसपेशियों बाहर की एक पतली टुकड़ा काट और एक गिलास स्लाइड पर जगह है. स्लाइड लेबल. SEM मांसपेशियों के लिए प्रक्रिया दोहराएँ. दोनों ऊतक तैयारी में sarcomere बैंडिंग पैटर्न देखें. आप यौगिक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें और उद्देश्यों को तदनुसार समायोजित कर सकते हैं बैंडिंग पैटर्न देखने के लिए. यदि खुर्दबीन की आँख टुकड़ा के माध्यम से संभव एक डिजिटल फोटो लेने के (ध्यान दें: कुछ सेल फोन कैमरे इस प्रक्रिया के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं).

16 चित्रा
16 चित्रा क्रेफ़िश पेट के प्रत्येक खंड के extensor मांसलता दिखा पृष्ठीय भाग के एक उदर देखने से योजनाबद्ध ड्राइंग. पृष्ठीय झिल्ली पेट (डीएमए) मांसपेशियों और सतही extensor गौण मांसपेशी सिर (SEAcc) 5 प्रत्येक खंड के लिए एक अलग उन्मुखीकरण के साथ पेट के माध्यम से 1 क्षेत्रों में पाए जाते हैं. 1 खंड के अपवाद के साथ, इन मांसपेशियों calcified tergite उनके पूर्वकाल अंत में और जोड़ झिल्ली में पीछे अंत में उनके लगाव साइटों है. 1 खंड में, मांसपेशियों मुताबिक़ उनके जोड़ छाती और पेट के बीच स्थित झिल्ली पूर्वकाल लगाव साइटों है. उदाहरण methylene नीले दाग तैयारी की फोटो montages पर आधारित था. आंकड़ा के बाईं ओर पर सब गहरी extensor मांसपेशियों पृष्ठीय सतही extensor मांसपेशियों को दिखाने के हटा दिया गया है. स्केल = 2.35 मिमी. (Sohn एट अल. 2000 से लिया).

3. परिणाम

निम्नलिखित प्रश्न और डाटा प्रोसेसिंग इस प्रयोगशाला प्रक्रिया के लिए मुख्य सिद्धांतों और उद्देश्यों को दर्शाते हैं.

  1. प्रत्येक [+ K] आराम झिल्ली क्षमता के लिए प्राप्त इस्तेमाल किया बाहर उपायों प्लॉट . देखो, अगर उनके ढलान में मनाया और काल्पनिक लाइनों मिलान कर रहे हैं. साजिश मूल्यों x-अक्ष के साथ एक अर्द्ध लॉग साजिश का उपयोग विभिन्न [+ K] एक लॉग इन करें और झिल्ली क्षमता (के रूप में नीचे दिखाया गया है, चित्रा 17) की y- अक्ष के रूप में. (मुफ्त डाउनलोड ग्राफ़ पेपर अगर जरूरत http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
    17 चित्रा
    17 चित्रा. ग्राफ़ कागज
    औसत आराम झिल्ली क्षमता 5.4 मिमी पर प्राप्त का उपयोग करें [+ K] तुलना के लिए काल्पनिक और मनाया लाइनों की शुरुआत के लिए बाहर.
    यदि लाइनों चर्चा क्यों यह हो सकता है मेल नहीं खाते.
  2. यदि आप ना + आयनों के बाहरी स्तर बदल, आप परिवर्तन का एक ही प्रकार के रूप में कश्मीर को बदलने के लिए मनाया + एकाग्रता उम्मीद करेंगे?
  3. कैसे अच्छी तरह methylene नीले मांसपेशियों दाग था के रूप में नसों की तुलना? वहाँ मतभेद क्यों हो सकता है? Methylene नीले ऊतक या रहते हैं मानव कोशिकाओं में विपरीत की पहचान के लिए आज प्रयोग किया जाता है? सिगमंड फ्रायड और क्रेफ़िश में इस्तेमाल किया दाग के साथ क्या संबंध है?
  4. DEL और SEM मांसपेशियों के बीच sarcomere पैटर्न में कोई मतभेद नोट. यदि हां, तो क्या कारण हो सकता है? क्या सभी की मांसपेशियों को एक ही आराम sarcomere दूरी है? मांसपेशियों बैंडिंग पैटर्न आप खुर्दबीन और संभव के रूप में आंकड़ा (जाना जाता है sarcomere मांसपेशियों शरीर रचना के संबंध में) के में ज्यादा के रूप में लेबल के साथ मनाया ड्रा.

4. Synaptic पुन मापनेsponses

1) परिचय

पेट extensor मांसपेशियों आराम झिल्ली क्षमता प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया तैयारी भी विभिन्न मांसपेशियों से NMJs पर synaptic प्रतिक्रियाओं का प्रेरण का प्रदर्शन करने के लिए आदर्श है. क्रसटेशियन में कुछ मांसपेशियों के चुनिंदा या तो एक phasic या एक टॉनिक मोटर न्यूरॉन द्वारा innervated हैं, हालांकि कुछ एकल फाइबर पैर चलने क्रेफ़िश में extensor मांसपेशियों (Atwood, 2008 के लिए दोनों phasic और टॉनिक के रूप में इस तरह के उत्तेजक मोटर न्यूरॉन्स द्वारा innervated किया जा सकता है है, जौव देख उत्पादन आईडी # 2319 - वू और कूपर, 2010) और सबसे अन्य अंग की मांसपेशियों (Wiersma, 1961a). चुनिंदा phasic और टॉनिक मोटर न्यूरॉन्स उत्तेजक, EPSPs में शारीरिक मतभेदों को मापा जा सकता है. Phasic मोटर न्यूरॉन्स मांसपेशी फाइबर के तेजी से हिल उत्पादन और 10-40 एम वी के आदेश पर EPSPs आह्वान. phasic प्रतिक्रिया 5 10 हर्ट्ज गाड़ियों की उत्तेजना के साथ तेजी से दबाना कर सकते हैं. टॉनिक मोटर न्यूरॉन्स छोटे EPSPs है कि उत्तेजना के एक उच्च आवृत्ति (हर्ट्ज 10-50) की उपस्थिति में मदद की जा सकती को जन्म दे. Structurally, NMJs पर presynaptic phasic और टॉनिक टर्मिनलों अलग हैं (एटवुड और कूपर, 1996; Bradacs एट अल, 1997;. कूपर एट अल, 1998).

(, मर्सिए और Atwood, 1989 कूपर एट अल, 1998) हैरानी की बात है phasic शारीरिक प्रतिक्रियाओं के phenotype 7 दिनों में कुछ दैनिक घंटे के लिए विद्युत कंडीशनिंग phasic न्यूरॉन्स द्वारा एक टॉनिक की तरह राज्य के लिए एक परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं . इसके अलावा तब्दील NMJs के neuromodulation संवेदनशीलता रिसेप्टर अभिव्यक्ति के विनियमन (Griffis एट अल., 2000) की जांच के लिए प्रधानमंत्री है.

इस अपेक्षाकृत मजबूत तैयारी (क्रेफ़िश पेट की मांसपेशियों), दोनों टॉनिक और phasic प्रतिक्रियाओं को आसानी से और दर्ज की सुविधा और / या विभिन्न उत्तेजना मानदंड के साथ synaptic प्रतिक्रियाओं का अवसाद जांच कर रहे हैं. इन तैयारियों के साथ, छात्रों के लिए एक तंत्रिका बंडल उत्तेजक द्वारा phasic और टॉनिक synaptic प्रतिक्रियाओं का सामान्योक्तियां पहचान करने में सक्षम हो जाएगा.

एक अतिरिक्त प्रस्तुत तैयारी NMJ सीएनएस से आंतरिक मोटर गतिविधि और संवेदी उत्तेजना प्रेरित मोटर गतिविधि की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है. यह क्रेफ़िश पेट के उदर पक्ष पर सतही flexor मांसपेशियों है. यह तैयारी भी संवेदी सीएनएस मोटर पेशी सर्किट की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और neuromodulators (Strawn एट अल., 2000 ) के प्रभाव.

पेट खंड (पिछले छोड़कर) में से प्रत्येक में तीन मांसपेशियों के कार्यात्मक समूह हैं: (1) उन लोगों को नियंत्रित करने pleopod (swimmerets) आंदोलन, (2) तीन extensor मांसपेशियों और (3) तीन flexor मांसपेशियों. flexors और extensors मांसपेशियों जो या तो पेट या intersegmental टिका के बारे में रोटेशन के कारण द्वारा बल का एक्सटेंशन के बारे में लाने के विरोधी समूह हैं. phasic मांसलता पेट की मात्रा के सबसे रह रहे हैं, जबकि टॉनिक की मांसपेशियों फाइबर है कि पृष्ठीय (extensors) और प्रत्येक पेट खंड के उदर पहलू (flexors) अवधि के पतली शीट शामिल हैं.

क्रेफ़िश, टॉनिक क्रेफ़िश के पेट flexor मांसपेशियों प्रत्येक आधा खंड में पांच motoneurons के द्वारा और एक परिधीय निरोधात्मक न्यूरॉन द्वारा innervated हैं. उत्तेजक motoneurons एक neurotransmitter के रूप में ग्लूटामेट का उपयोग करें. ग्लूटामेट पारगम्यता में मुख्य रूप से सोडियम आयनों को बढ़ाने के कारण मांसपेशी फाइबर depolarizes. निरोधात्मक न्यूरॉन्स गामा अमीनो butyric एसिड (GABA) है, जो आमतौर पर क्लोराइड आयनों पारगम्यता में वृद्धि के कारण मांसपेशी फाइबर hyperpolarizes जारी. कुछ crustacean मांसपेशियों (मुख्य रूप से अंगों में), परिधीय निरोधात्मक न्यूरॉन्स मोटर न्यूरॉन टर्मिनलों के साथ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मांसपेशी फाइबर के साथ synaptic संपर्क बनाने के लिए, और मोटर न्यूरॉन (presynaptic निषेध) (Dudel और Kuffler, 1961 द्वारा जारी ट्रांसमीटर की राशि को कम ). इस घटना क्रेफ़िश के टॉनिक flexor मांसपेशियों में मौजूद नहीं है.

क्रेफ़िश के उदर तंत्रिका कॉर्ड एक द्विपक्षीय सममित संरचना जानवर की लंबाई को चलाने के है. शरीर खंड प्रति एक नाड़ीग्रन्थि है. पेट (6 खंडों) में, प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि कई सौ न्यूरॉन्स, और प्रत्येक दो connectives के कुछ हजार axons की होते होते. तंत्रिका कोशिका निकायों एक परत कई प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि के ventral सतह पर मोटी सेल निकायों के रूप में. तुरंत सेल शरीर परत के ऊपर neuronal प्रक्रियाओं की एक ठीक meshwork, neuropile है. सभी synaptic बातचीत यहाँ पाए जाते हैं, कोशिका निकायों synapses के रहित हैं.

प्रत्येक पेट नाड़ीग्रन्थि (पिछले छोड़कर) प्रत्येक पक्ष पर तीन जड़ों की है. पहला रूट pleopod मांसलता और संवेदी axons innervating न्यूरॉन्स के axons होता है; दूसरा रूट phasic और टॉनिक extensor मांसलता और संवेदी axons innervating axons हैं; और तीसरे जड़ है, जो तंत्रिका कॉर्ड कई नाड़ीग्रन्थि के लिए दुम मिलीमीटर पत्ते axons innerv शामिलphasic और टॉनिक flexor मांसलता ating. तीसरे रूट की दो शाखाएं हैं. गहरी शाखा (IIIa) केवल phasic flexor मांसपेशियों innervates. प्रत्येक आधा खंड में तीसरे रूट (IIIb) के सतही शाखा छह axons, जो टॉनिक flexor मांसपेशियों अंदर आना होता है.

टॉनिक न्यूरॉन्स innervating flexor अनायास सक्रिय हैं, phasic अपवाही न्यूरॉन्स के विपरीत है, और एक अच्छी तैयारी में, वे पेट के बाद कई घंटे के लिए आग जारी रहेगा जानवर से हटा दिया गया है. इन पेट की तैयारी में की गई खोजों में से एक ऐतिहासिक प्रकृति की एक समीक्षा के लिए एटवुड (2008) देखते हैं. मोटर न्यूरॉन्स के चार और परिधीय निरोधात्मक न्यूरॉन के किसी भी आधा खंड में टॉनिक flexor मांसपेशियों innervating सेल निकायों कि खंड के नाड़ीग्रन्थि में स्थित हैं. शेष मोटर न्यूरॉन सेल शरीर अगले दुम नाड़ीग्रन्थि में स्थित है. इन न्यूरॉन्स मज़बूती से extracelluarly दर्ज स्पाइक आयाम के आधार पर एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. यदि एक आधा खंड से टॉनिक flexor मांसपेशियों के साथ दो ganglia युक्त इस मांसपेशी innervating न्यूरॉन्स के साथ हटा दिया जाता है, पांच न्यूरॉन्स आमतौर पर सहज गतिविधि के कुछ डिग्री दिखाओ. इन न्यूरॉन्स रिश्तेदार कोशिकी स्पाइक आयाम के आधार पर आरोही क्रम में गिने जा रहे हैं. F4 के लिए f1 motoneurons और F5, सबसे बड़ा अनायास सक्रिय न्यूरॉन, परिधीय flexor अवरोध करनेवाला है. F6, सबसे बड़ा मोटर न्यूरॉन, एक उत्तेजक मोटर न्यूरॉन है जो शायद ही कभी अनायास सक्रिय है.

टॉनिक मोटर न्यूरॉन गतिविधि का सहज स्वभाव यौगिकों के exogenous अनुप्रयोग द्वारा या छल्ली कि मोटर तंत्रिका गतिविधि के लिए नजर रखी जा रही है एक ही खंड के भीतर एक संवेदी प्रेरणा प्रदान करके modulated किया जा सकता है.

2) विच्छेदन

पेट extensor तैयारी एक ही प्रक्रिया के रूप में कोशिकी पोटेशियम के संबंध में आराम झिल्ली क्षमता की जांच के लिए ऊपर वर्णित प्राप्त करने के लिए. अंतर कमानी तंत्रिका बंडल है कि कछुवे की पीठ की हड्डी की ओर साथ चलाता का ख्याल रखना है. इस तंत्रिका जो उत्तेजक इलेक्ट्रोड के रूप में काम करेगा एक चूषण इलेक्ट्रोड में खींच लिया जाएगा. Phasic प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए 1 हर्ट्ज पर उत्तेजित. 10 से 20 उत्तेजनाओं के लिए दालों 10Hz की कमी फटने के साथ उत्तेजित जबकि टॉनिक प्रतिक्रियाओं की निगरानी.

क्रेफ़िश टॉनिक flexor मांसपेशियों पर प्रयोग की देखभाल के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं अलग और एक की जरूरत है वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड बरकरार छोड़ रहे हैं. एक तैयारी कई पेट क्षेत्रों से मिलकर बना है. यह निम्नानुसार प्राप्त है:

  1. एक क्रेफ़िश शरीर की लंबाई में 6-10 लगभग सेमी (या एक प्रबंधनीय आकार) प्राप्त किया जाना चाहिए. यह सिर के पीछे या आँखों के पीछे से लगभग 2 या 3 सेंटीमीटर से पकड़े द्वारा क्रेफ़िश प्राप्त करते हैं. सुनिश्चित करें कि क्रेफ़िश या मुँह के पंजे experimenter नहीं पहुँच जब क्रेफ़िश से निपटने कर सकते हैं. उन्हें हटाने के बाद सिर और appendages के निपटान.
  2. कैंची का उपयोग करने के लिए जल्दी से सिर हटायें. क्रेफ़िश की आँखों के पीछे से एक स्वच्छ और जल्दी काट बनाओ.
    18 चित्रा
    18 चित्रा छवि कटौती क्रेफ़िश के सिर को हटाने के स्थान से पता चलता है.
    पैर और क्रेफ़िश के पंजे में इस बिंदु पर हटाया जा सकता है के लिए चोट से बचने के लिए. पुरुषों और दोनों पुरुषों और महिलाओं पर swimmerets पर Stylets भी हटाया जा सकता है (चित्रा 19 और 20). अगले, छाती से पेट अलग. Articulating झिल्ली जो पेट और छाती (20 चित्रा) में मिलती है साथ में कटौती करें.
  3. क्रेफ़िश के पेट भाग सहेजें और छाती के निपटान.
    19 चित्रा
    छवि 19 चित्रा stylets कि क्रेफ़िश से हटाया जा सकता है है के स्थान से पता चलता है..
    20 चित्रा
    छवि 20 चित्रा कटौती की नियुक्ति के पेट से छाती हटाने से पता चलता है..
    21 चित्रा
    पेट से 21 चित्रा. छाती हटाना. कटौती खंडों के शामिल होने की रेखा के साथ परिपत्र फैशन में बनाया जाना चाहिए.
    22 चित्रा
    22 चित्रा शीर्ष छवि appendages के साथ पेट से पता चलता है. नीचे की छवि पेट appendages के हटाने से पता चलता है.
  4. एक बड़े पेट्री डिश में नमकीन घोल में अलग पूंछ तैयारी रखें. डिश के लिए नीचे की तैयारी के पूंछ और ऊपरी भाग पिन. सुनिश्चित करें कि तैयारी सुरक्षित है. एक स्केलपेल प्रयोग पसलियों के बीच की तैयारी के ventral पक्ष के एक वर्ग भाग हटायें.
    23 चित्रा
    23 चित्रा.पता चलता है जहां कटौती की तैयारी के उदर औषधि दूर किया जाना चाहिए.
  5. एक छोटा सा कट (भी कैंची से किया जा सकता है) किया जाना चाहिए. एक प्रालंब और कटौती की जानी चाहिए और ऊपर की ओर उठाया. प्रालंब तो कैंची से हटाया जा सकता है, गहरी flexor मांसपेशियों को उजागर. खुर्दबीन इस प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाना चाहिए तैयारी के उदर भाग को हटाने में शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए.
    24 चित्रा
    24 चित्रा तैयारी कैंची से काटना की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए..
    25 चित्रा
    25 चित्रा शीर्ष छवि संदंश के साथ प्रालंब के लोभी से पता चलता है. नीचे की छवि प्रालंब की तैयारी का उपयोग कर खुर्दबीन से हटाने से पता चलता है.
    26 चित्रा
    26 चित्रा सतही flexor मांसपेशियों का एक्सपोजर.

3) Intracellular रिकॉर्डिंग:

27 चित्रा
27 चित्रा रिकॉर्डिंग उपकरणों के कुल मिलाकर सेटअप .

  1. तैयारी के साथ पेट्री डिश खुर्दबीन के नीचे रखा जाना चाहिए और डिश के आंदोलन को रोकने के नीचे मोम के साथ सुरक्षित है.
    28 चित्रा
    28 चित्रा खुर्दबीन के नीचे तैयार करने के स्थान दिखाता है . मोम का प्रयोग करें पेट्री डिश और तैयारी सुरक्षित.
  2. चांदी के तार के एक छोर से जुड़ी छोटी लंबाई के साथ दो तारों प्राप्त होना चाहिए. चांदी के तार के बारे में 20 मिनट के लिए ब्लीच की एक छोटी राशि में डूबा कोटिंग एजी-सीएल प्राप्त होना चाहिए. पानी के साथ प्रयोग करने से पहले तार धो लें. एक गिलास intracellular विंदुक और प्राप्त किया जाना चाहिए एक KCl समाधान (एम 3) के साथ सावधानी भरा है. विंदुक नीचे कर दिया जाना चाहिए (खोलने के साथ मंजिल का सामना करना पड़ रहा) और समाधान के साथ भरा. बाद में यह सुनिश्चित करेंगे कि किसी भी अतिरिक्त KCl इलेक्ट्रोड के पीछे ड्रिप जाएगा. सुनिश्चित करें कि कोई KCl कि खारा स्नान में प्रवेश करेंगे कांच विंदुक के साथ चलाता है. विंदुक ईमानदार मुड़ें जब पोटेशियम क्लोराइड समाधान के साथ भरने समाप्त. चांदी के तार तो पिपेट में रखा जा सकता है. दूसरे छोर + सिर मंच पर ध्रुव (सकारात्मक) से जुड़ा है. विंदुक तो इलेक्ट्रोड जांच पर सुरक्षित है. केयर इलेक्ट्रोड विंदुक तोड़ नहीं बनाया जाना चाहिए. फैराडे पिंजरे से जुड़ी एक तिहाई तार सिर मंच की हरी पोल में रखा जाना चाहिए. (नकारात्मक) नीचे दिखाया पोल - शेष नेतृत्व के अन्त एजी तार स्नान और अन्य संलग्न करने के लिए अंत में रखा जाना चाहिए. तार भी फैराडे पिंजरे से ई. कनवर्टर Powerlab की जमीन भाग के लिए रखा जाना चाहिए. सिर मंच अधिग्रहण / प्रवर्धक (Powerlab) पर "इनपुट जांच" जुड़ा हुआ है.
    29 चित्रा
    29 चित्रा प्रमुख मंच विन्यास. सिर चरण के हरे भाग से जुड़े तार एम्पलीफायर या फैराडे पिंजरे के लिए आधारित है. लाल हिस्से से जुड़े तार बिजली तार से जुड़ा है. काले हिस्से को स्नान समाधान के लिए कनेक्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    30 चित्रा
    30 चित्रा "टॉगल टेस्ट" नीचे करने के लिए इलेक्ट्रोड प्रतिरोध परीक्षण के लिए पंक्ति में है. "मोटे" घुंडी भी डीसी ऑफसेट जो काउंटर बुद्धिमान घड़ी दिया जाना चाहिए के अंतर्गत पाया जाता है. लाभ 50 है, जो पचास का एक पहलू द्वारा संकेतों amplifies सेट कर दिया जाता है. सिर मंच से जमीन तार "GND" पिन जैक खोलने में रखा गया है.
  3. LabChart सॉफ्टवेयर डेस्कटॉप या लैपटॉप पर खोला जाना चाहिए. चार्ट को समायोजित करें क्लिक करें "सेटअप" से केवल एक चैनल है, तो चैनल "प्रदर्शित सेटिंग्स." के तहत चैनलों की "चैनल सेटिंग्स," परिवर्तन नंबर एक. पर क्लिक करें "ठीक है." चार्ट, बाएँ हाथ के कोने के शीर्ष पर, प्रति सेकंड चक्र 2K होना चाहिए. (Y-अक्ष) वोल्ट सेट 200mV के आसपास 500mV करने के लिए. पर क्लिक करें "1 चैनल" स्क्रीन के दाहिने हाथ भाग पर. "इनपुट प्रवर्धक." पर क्लिक करें. सुनिश्चित करें विभेदकों बॉक्स की जाँच की है.

    एम्पलीफायर उत्पादन में एक चैनल में होना चाहिए. निम्न सेटिंग्स प्रवर्धक के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए:
    • हाई - पास डीसी
    • पायदान फ़िल्टर-रवाना
    • निम्न दर्रा 20kHz
    • क्षमता Comp .- वामावर्त
    • डीसी ऑफसेट ठीक है और घुंडी वामावर्त कोर्स
    • डीसी (+ रवाना) ऑफसेट - रवाना
    • 50 - लाभ घुंडी
    • (अन्तर मोनो GND) इनपुट - diff
    • MODE - आरईसी (Stim गेट आरईसी)
    • ΩTEST-रवाना
  4. इलेक्ट्रोड प्रतिरोध शक्ति को मापने के लिए, वोल्टेज वर्तमान, जो 2.0 NA द्वारा विभाजित किया जाना चाहिए. जिसके परिणामस्वरूप मूल्य कांच इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध है. प्रतिरोध 20 से 60 MegaOhms होना चाहिए. एक बार प्रतिरोध निर्धारित किया गया है, intracellular रिकॉर्डिंग शुरू कर सकते हैं. खारा स्नान में कांच इलेक्ट्रोड की नोक प्लेस. सुनिश्चित करें कि एक जमीन तार खारा स्नान में भी.
    रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए, स्क्रीन के नीचे "शुरू" दबाएँ. सुनिश्चित करें कि लाभ 5 वी / div सेट कर दिया जाता है. एम्पलीफायर पर बेशक घुंडी प्रयोग LabChart पर इलेक्ट्रोड डालने से पहले लाइन शून्य करने के लिए कदम. टॉगल घुंडी तो पर और बंद कई बार दिया जाना चाहिए क्रम में करने के लिए इलेक्ट्रोड प्रतिरोध परीक्षण. अगला, परिणामस्वरूप मूल्यों के आयाम मापा जाना चाहिए. एक निर्माता स्थिर बेस लाइन प्लेस और फिर चरम पर दूसरे स्थान पर इलेक्ट्रोड प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए.
  5. इलेक्ट्रोड जांच और माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों में इलेक्ट्रोड डालने. मांसपेशियों के माध्यम से प्रवेश मत करो. खुर्दबीन और जांच सेटिंग्स का उपयोग क्रम में मांसपेशी फाइबर की पतली परत को खोजने के लिए और करने के लिए तंतुओं में इलेक्ट्रोड सम्मिलित है. उच्च तीव्रता प्रकाशक एक प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब मांसपेशियों के मर्मज्ञ.
    31 चित्रा
    31 चित्रा इलेक्ट्रोड मांसपेशियों में निवेशन.
  6. देखभाल करने के लिए सतही मांसपेशियों के लिए तंत्रिका जड़ों हानिकारक से बचने लिया जाना चाहिए.
    यह खारा तैयारी (10-15 डिग्री सेल्सियस) शांत और अच्छी तरह से oxygenated जबकि बाहर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को ले जाने स्नान रखने की सलाह दी जाती है. यदि शीतलन यूनिट उपलब्ध ताजा साथ खारा की जगह नहीं कर रहे हैं, खारा नियमित रूप से ठंडा. आक्सीजन गैस, या कम से कम हवा, खारा के माध्यम से bubbled होना चाहिए.
  7. EPSPs की सहज गतिविधि रिकॉर्ड. EPSPs के विभिन्न आकारों के नोट और अगर IPSPs मौजूद हैं.
  8. बहुत ध्यान से एक छोटे से रंग झाड़ी ले और हाथ से एक ही खंड है कि एक सहज गतिविधि की निगरानी कर रहा है के भीतर छल्ली बढ़त के साथ उत्तेजित. प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति में एक परिवर्तन पर ध्यान दें और अगर अलग अलग आकार EPSPs दिखाई देते हैं कि वहाँ छल्ली उत्तेजक से पहले नहीं थे.
    32 चित्रा
    32 चित्रा ब्रश और तंत्रिका जड़ों उत्तेजक के साथ तैयार है. (Strawn एट अल, 2000 से संशोधित)
  9. उत्तेजना सावधानी के साथ एक जैसे (1 microM) serotonin या खारा सीओ 2 के साथ bubbled neuromodulator युक्त खारा स्नान का आदान प्रदान के बाद दोहराया जा सकता है है. नोट किसी दिए गए प्रोत्साहन के लिए गतिविधि प्रोफ़ाइल पर प्रभाव. यह भी ध्यान दें अगर खारा वापस अपने प्रारंभिक शर्त को ताजा खारा गतिविधि रिटर्न का आदान प्रदान.
  10. अगले, एक संवेदी सीएनएस मोटर न्यूरॉन सर्किट के भीतर विभिन्न तरीकों में तंत्रिका गतिविधि की निगरानी कर सकते हैं. हम निगरानी मोटर न्यूरॉन गतिविधि के लिए एक चूषण इलेक्ट्रोड एक intracellular इलेक्ट्रोड (33 चित्रा) के बजाय का उपयोग कर सकते हैं. कांच चूषण इलेक्ट्रोड की नोक पर, प्लास्टिक टयूबिंग रखा गया है जो टिप में तंत्रिका खींचने के लिए सही आकार का एक खोलने है. बहुत बड़ी खोलने नहीं हो, के रूप में तंत्रिका बाहर गिर जाएगा चाहिए, या बहुत छोटा है, क्योंकि तंत्रिका इलेक्ट्रोड के दबाव के द्वारा क्षतिग्रस्त किया जाएगा. प्लास्टिक टयूबिंग एक लौ से अधिक खींच लिया है और जरूरत आकार को वापस छंटनी की.
    33 चित्रा
    33 चित्रा चूषण इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग व्यवस्था के साथ सेट करें .
    एक स्थिति है जहां चूषण इलेक्ट्रोड खारा स्नान के लिए आसान पहुँच गया है में micromanipulator स्थिति. सक्शन ऊपर खारा है जब तक यह चूषण इलेक्ट्रोड के अंदर चांदी के तार के साथ संपर्क में है. अन्य तार इलेक्ट्रोड की टिप करने के लिए करीब चूषण इलेक्ट्रोड की कटौती तरफ व्यवस्थित, तो दोनों तारों नमकीन स्नान के साथ संपर्क में हो जाएगा.
    विद्युत निगरानी के लिए के रूप में पावर लैब 26T के लिए एसी / डीसी विभेदकों प्रवर्धक प्रवर्धक () कनेक्ट. PowerLab 26T पर इनपुट 1 से एम्पलीफायर पर उत्पादन करने के लिए उचित कॉर्ड को जोड़ने के द्वारा यह मत करो.
    • प्रवर्धक साधन नियंत्रण निम्न सेटिंग्स के लिए सेट किया जाना चाहिए:
      • हाई - पास डीसी
      • पायदान फ़िल्टर-रवाना
      • निम्न दर्रा 20kHz
      • क्षमता Comp .- वामावर्त
      • डीसी ऑफसेट ठीक है और घुंडी वामावर्त कोर्स
      • डीसी (+ रवाना) ऑफसेट - रवाना
      • 50 - लाभ घुंडी
      • (अन्तर मोनो GND) इनपुट - diff
      • MODE - आरईसी (Stim गेट आरईसी)
      • ΩTEST-रवाना
    'इनपुट जांच प्रवर्धक पर सिर चरण कनेक्ट.
    चूषण इलेक्ट्रोड से सिर चरण के लिए बिजली के तारों कनेक्ट. तारों ऊपर छोड़ दिया पर लाल (सकारात्मक) के साथ जुड़ा होना चाहिए, (जमीन) के बीच में हरा, काला (नकारात्मक नीचे में यह 34 चित्र में संकेत दिया है जमीन तार बस खारा स्नान में डाल दिया जा सकता है..
    34 चित्रा
    34 चित्रा. हेड मंच विन्यास
  11. अब PowerLab 26T से लैपटॉप के लिए यूएसबी कॉर्ड कनेक्ट. सुनिश्चित करें कि दोनों एम्पलीफायर और PowerLab26T में खामियों को दूर कर रहे हैं और कंप्यूटर पर LabChart7 खोलने से पहले बदल गया.
  12. LabChart7 खोलें.
    • LabChart आपका स्वागत केंद्र बॉक्स खुला पॉप जाएगा. इसे बंद करो. </ Li>
    • सेटअप पर क्लिक करें
    • चैनल सेटिंग्स पर क्लिक करें. 1 (बॉक्स के नीचे छोड़ दिया) चैनलों की संख्या बदलें ठीक धक्का.
    • चार्ट के ऊपरी बाएँ 2k के बारे में प्रति सेकंड चक्र निर्धारित किया है. के बारे में 500 या 200mv वोल्ट (y-अक्ष) सेट.
    • चार्ट के अधिकार पर एक चैनल पर क्लिक करें. इनपुट एम्पलीफायर पर क्लिक करें. सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स: एकल समाप्त, एसी युग्मित, और पलटना (संकेत अगर जरूरत inverts), और विरोधी उर्फ ​​जाँच कर रहे हैं,.
    • रिकॉर्डिंग प्रेस शुरू शुरू करने के लिए.
    हम 3 Rd जड़ है कि सतही flexor मांसपेशियों (शाखा IIIb) innervates कोशिकी रिकॉर्डिंग के साथ कार्रवाई की क्षमता के आकार की निगरानी की शाखा से रिकॉर्ड कर सकते हैं. बाह्य तंत्रिका आवेगों 'spikes के' के रूप में संदर्भित कर रहे हैं. याद है कि वहाँ पाँच excitor मोटर न्यूरॉन्स और इस जड़ में एक अवरोध करनेवाला मोटर न्यूरॉन (कैनेडी और Takeda, 1965, Velez और Wyman, 1978) हैं. एक ब्रश या neuromodulators के जोखिम के साथ छल्ली की उत्तेजना (35 चित्रा) का उपयोग किया जा सकता है है. तूलिका हाथ से या लगातार उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यह एक micromanipulator पर दबाव और आंदोलन की राशि को नियंत्रित करने के लिए रखा जा सकता है.
    35 चित्रा
    35 चित्रा 3 पहले और खारा (ऊपर) और 100 एनएम 5-HT (नीचे) में cuticular उत्तेजना के दौरान तीसरे जड़ की गतिविधि . छल्ली उत्तेजना के दौरान समय पट्टी द्वारा संकेत है. जब तैयारी 5-HT (Strawn एट अल, 2000 से संशोधित) में नहाया है उत्तेजना के पहले और बाद में बढ़ाया गतिविधि ध्यान दें .
    तंत्रिका की एक अंपैसां रिकॉर्डिंग करके हम 1 या 2 सेंट एन डी जड़ों से रिकॉर्ड कर सकते हैं, या हम VNC और रिकॉर्ड शुद्ध संवेदी इनपुट परिधि जो VNC में संकेत भेजने से उत्पन्न होने वाली से रूट दूर आड़ा काट कर सकते हैं. इस प्रकार, आप transected संवेदी गतिविधि के लिए परिधि प्रमुख जड़ से रिकॉर्ड होगा.
    2 एन डी जड़ में बहुत बड़ी extensor मोटर न्यूरॉन्स (फील्ड्स और कैनेडी, 1965) के लिए प्राथमिक अभिवाही मांसपेशियों रिसेप्टर (एमआरओ) अंगों और efferents के छोटे axons से axons हैं. 1 सेंट और 2 एन डी जड़ों में कई संवेदी axons हैं.
    mechanosensory न्यूरॉन्स सीधे कनेक्शन पार्श्व विशाल axons (एलजी) (; 1972 Zucker Krasne 1969) के साथ विद्युत synapses के द्वारा है. इसके अलावा, mechanosensory न्यूरॉन्स रासायनिक synapses के माध्यम से interneurons उत्तेजित करने के लिए जाना जाता है.
    संवेदी इनपुट की जांच कैसे एक संवेदी सीएनएस - मोटर न्यूरॉन सर्किट के माध्यम से मोटर न्यूरॉन गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, हम एक मांसपेशी में synaptic प्रतिक्रिया को रिकॉर्ड कर सकते हैं. सर्किट हम प्रयोग करेंगे के विभिन्न पहलुओं की जांच किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम अकेले संवेदी तंत्रिका जड़ या VNC में बरकरार संवेदी इनपुट कील आवृत्ति रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करने के साथ या बिना मोटर जड़ से रिकॉर्ड कर सकते हैं, एक अवधि के समय पर अलग अलग परिस्थितियों में गिन सकते हैं. उपायों से पहले बनाया जा सकता है और समय की एक निश्चित राशि (35 चित्रा) के लिए ब्रश उत्तेजना के दौरान उत्तेजना ब्रश. एक शर्तों 5 बार दोहराने के लिए और तुलना करने के लिए एक उपाय के रूप में आवृत्ति में औसत प्रतिशत परिवर्तन प्राप्त कर सकते हैं.
    एक भी सेरोटोनिन (Strawn एट अल., 2000) या (ACH) acetylcholine, निकोटीन या ग्लूटामेट जैसे exogenous यौगिकों लागू कर सकते हैं. विभिन्न व्यवहार क्रियाओं अकशेरूकीय में निकोटीन के लिए में वर्णित किया गया है. यह निकोटिनिक रिसेप्टर्स की उपस्थिति (Tsunoyama और Gojobori, 1998) का सुझाव जाएगा. ग्लूटामेट NMJ और ACH पर एक प्रमुख सबसे अकशेरूकीय में उत्तेजक neurotransmitter है CNS के भीतर प्रमुख उत्तेजक neurotransmitter (. वाटकिंस, एट अल, 1990 Monoghan एट अल, 1989) है.
    एक heptanol कोशिश या सीओ 2 खारा bubbled के बाद से यह सर्किट के भीतर क्रेफ़िश septate जंक्शनों (या अंतराल के) संबंध तोड़ना डा. Sonya एम. Bierbower (केंटकी के विश्वविद्यालय) के रूप में उसे शोध प्रबंध के अनुसंधान में दिखाया गया है सकते हैं. यह क्रिया बदल पूरी पशुओं के व्यवहार के लिए खाते में जब वातावरण में उच्च सीओ 2 (Bierbower और कूपर, 2010) के संपर्क में हो सकता है. जब आप एक ब्रश और ड्राइव संवेदी इनपुट के साथ छल्ली उत्तेजित और मोटर न्यूरॉन्स में एक प्रतिक्रिया को रिकॉर्ड करने के लिए, ध्यान दें अगर वहाँ पहले गतिविधि में और heptanol या सीओ 2 जोखिम के दौरान एक फर्क है. यह सुझाव या संवेदी सीएनएस - मोटर न्यूरॉन सर्किट में एक भूमिका है हो सकता है नहीं अंतराल जंक्शनों.

Discussion

झिल्ली संभावित

के रूप में 1902 के रूप में में जल्दी, Bernstein एक विद्रूप के अक्षतंतु में एक आराम की क्षमता के मुद्दों के साथ काम कर रहा था. यह पेचीदा है पर विचार करने के लिए कैसे इन जल्दी Berstein (1902) और नेर्न्स्ट (1888) के विचारों और टिप्पणियों के बाद झिल्ली शरीर क्रिया विज्ञान में अनुसंधान को प्रभावित. (Malmivuo और Plonsey, 1995 द्वारा समीक्षा देखो, भी www पर उपलब्ध http://www.bem.fi/book/ ). वहाँ अब भी कर रहे हैं, इस दिन के लिए, सफलताओं आयन चैनल समारोह और जैविक झिल्लियों है कि सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान है जो ऊतकों, अंगों और प्रणालियों के समारोह से संबंधित समझ में बहुत महत्वपूर्ण हैं के गुणों के बारे में बनाया जा रहा है.

बाहरी की प्रयोगात्मक और सैद्धांतिक रूप से व्युत्पन्न प्रभाव की तुलना [+ K] आराम झिल्ली क्षमता पर झिल्ली क्षमता पर आयनों के प्रभाव को इंगित करता है. अतिरिक्त प्रयोगों का उपयोग कर इस एक ही तैयारी करने के लिए मौलिक शारीरिक सवालों के पते के लिए प्रदर्शन किया जा रह है. कुछ वापस 1968 में प्रकाश डाला गया और एटवुड और Parnas द्वारा अभी तक पूरी तरह से घेरने की कोशिश करने के लिए. इस अभ्यास में प्राप्त तकनीक के साथ, एक करने के लिए कई सवालों के जवाब के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शारीरिक चिकित्सा और स्वास्थ्य से संबंधित अनुप्रयोगों में अन्य प्रयोगात्मक तैयारी में शेष आगे बढ़ सकते हैं. हम एक मॉडल invertebrate तैयारी के लिए सभी पशुओं को उचित मौलिक सवालों के पते की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है.

के साथ इस ऊपर अभ्यास में आयनों की विद्युत gradients पर ज्ञान प्राप्त की, अब आप क्रेफ़िश में neuromuscular तैयारी पर synaptic प्रसारण का परीक्षण करके झिल्ली के excitability के लिए अग्रिम कर सकते हैं.

Synaptic प्रतिक्रियाएँ मापना

इस प्रयोगशाला का पहला हिस्सा है, और संबद्ध फिल्म के लिए उपलब्ध कराई गई जानकारी, झिल्ली क्षमता रिकॉर्डिंग और मांसपेशियों संरचना की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रदान की है. इस प्रयोगशाला के दूसरे भाग में, विच्छेदन के प्रदर्शन रिकॉर्डिंग और phasic और टॉनिक मोटर इकाइयों के NMJs पर synaptic प्रसारण शरीर क्रिया विज्ञान में मौलिक अवधारणाओं के लिए एक जोखिम प्रदान की है. एक तंत्रिका सर्किट, जो भाग में कर सकते हैं बरकरार जानवर में जुड़े व्यवहार समझाने की एक अच्छी तरह से में उनकी प्रयोगशाला व्यायाम के भीतर विभिन्न खुले समाप्त सवाल की जांच के छात्रों के लिए न केवल लेकिन यह भी neuronal सर्किट पर भविष्य के अनुसंधान के लिए क्षमता है के लिए इस्तेमाल किया प्रदर्शन स्थापित invertebrate तैयारी (कैनेडी एट अल, 1969; Antonsen और एडवर्ड्स, 2003)

ये तैयारियाँ भी synaptic सुविधा, अवसाद और लंबी अवधि के plasticity के (इस प्रयोगशाला अध्ययन में जांच नहीं की) की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके प्राकृतिक वातावरण, क्रेफ़िश के कुछ प्रजातियों के भीतर भी, neuronal plasticity प्रयोगात्मक उत्तेजना (कूपर एट अल, 1998 मर्सिए और Atwood, 1989) शर्तों पर निर्भर करता है. किस हद तक synaptic प्रभावकारिता और मांसपेशियों की गतिशीलता को बदलने की क्षमता में कार्य करता है जानवर के लिए जांच की जा रहता है. चूंकि क्रेफ़िश मौसमी भिन्नता और गिरना चक्र के संबंध में उनके व्यवहार को बदल नहीं है, वहाँ अपेक्षाकृत लंबी अवधि के उनके neuromuscular प्रणाली में गतिविधि मतभेद हैं. यह दिखाया गया है कि phasic पंजा करीब मांसपेशियों की मोटर तंत्रिका टर्मिनलों सर्दियों के दौरान प्रदर्शन क्लासिक phasic आकारिकी, लेकिन फूल और टर्मिनल की लंबाई के साथ गर्मियों के महीनों के दौरान अधिक वैरिकाज़ (1993 Lnenicka; Lnenicka और Zhao, 1991) बन.

कुछ जल्दी वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड के भीतर क्रेफ़िश पार्श्व विशाल interneurons (एलजी) में किए गए अध्ययनों अंतराल के जंक्शनों (; वातानाबे और Grundfest, 1961 जॉनसन, 1924) की उपस्थिति का प्रदर्शन किया. यह सर्वविदित है कि सीओ 2 अंतराल जंक्शनों (Arellano एट अल, 1990) uncoupling द्वारा विद्युत संचार पर एक प्रभाव है. यह हाल ही में दिखाया गया था कि तंत्रिका सर्किट संवेदी सीएनएस मोटर मांसपेशियों, जैसा कि इस रिपोर्ट में बताया है, के भीतर गर्भनाल संचार भी संवेदनशील सीओ 2 जोखिम, अंतराल के जंक्शनों (Bierbower, 2010 की उपस्थिति का संकेत; Bierbower और कूपर, 2010)

3 Rd मोटर रूट की सहज गतिविधि एक विषय दिया गया है के बाद से 1960 जब Eckert (1961) की जांच अगर एक या पड़ोसी खंड के भीतर स्थिर मांसपेशियों रिसेप्टर अंग (एमआरओ) फायरिंग टॉनिक सहज मोटर ड्राइव के लिए खाते सकता है. इन पहले के अध्ययनों में यह स्पष्ट हो गया कि गतिविधि वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (VNC) के भीतर संभवतः उच्चतर केन्द्रों (Eckert, 1961, कैनेडी और Takeda, 1965a, ख, Strawn एट अल, 2000) से प्रेरित किया गया था. सीओ 2 की उपस्थिति के बाद से सहज गतिविधि बंद कर दिया, एक ड्राइव में मोटर न्यूरॉन्स को कहीं मान अंतराल जंक्शनों या glutamatergic उत्तेजक ड्राइव हो सकता है. NMJs अवरुद्ध कर रहे हैं या एक्ज़िबिट संवेदनशीलता कम करने सीओ 2 की उपस्थिति में ग्लूटामेट, और वे गुट हो सकता हैसीएनएस के भीतर के रूप में अच्छी तरह से ked के (Bierbower, 2010; Bierbower और कूपर, 2010, यह भी देख Badre एट अल, 2005.).

विभिन्न neuromodulators की कार्रवाई भी आसानी से NMJs के विभिन्न प्रकार (Griffis, एट अल, 2000; Southard एट अल, 2000;. Strawn एट अल, 2000 कूपर और कूपर, 2009) में अध्ययन किया. इसके अलावा, विभिन्न प्रभावों CNS circuitry पर neuromodulators द्वारा exerted हैं. यह सुझाव दिया है कि 5-HT और octopaminergic न्यूरॉन्स 'लाभ setters' के रूप में neuronal सर्किट के उत्पादन में (मा एट अल, 1992 में फेरबदल में कार्य कर सकते हैं, Schneider एट अल, 1996;. Horner एट अल, 1997; एडवर्ड्स अल एट, 2002). ज्यादातर काम करने के लिए किया जाना बना रहता है इससे पहले कि हम पूरी तरह से व्यक्तिगत लक्ष्य कक्षों पर neuromodulators के प्रभाव को समझ सकता हूँ. देखते हुए कि अलग neuromodulators संगीत समारोह में एक दूसरे के साथ काम कर सकते हैं, उनके मिश्रित कार्रवाई का विश्लेषण भविष्य के अनुसंधान (Djokaj एट अल., 2001) के लिए एक क्षेत्र है. इसके अलावा, कुछ अध्ययनों से, विशेष रूप से रीढ़ में, पूरे रास्ते जो एक विशिष्ट व्यवहार को विनियमित कर सकते हैं पर neuromodulators के प्रभाव का पता है. संवेदी सीएनएस - मोटर इस इकाई तैयार करने में एक दोनों संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स (कैनेडी एट अल., 1969) की गतिविधि पर इनपुट neuromodulators के प्रभाव की जांच कर सकते हैं .

चूंकि यह माने किया गया है कि 5-HT क्रेफ़िश के व्यवहार, राज्य lobsters को विनियमित करने में एक भूमिका निभाता है, और केकड़ों (लिविंगस्टोन एट अल, 1980;. Sneddon एट अल, 2000), कई प्रयास में किया गया है के लिए अपनी एकाग्रता का निर्धारण किया VNC, hemolymph, और lobsters (लिविंगस्टोन एट अल, 1980; हैरिस - Warrick और Kravitz 1984; Fadool एट अल, 1988) के अलग ganglia में. हालांकि, वहाँ काफी भिन्नता दर्ज की माप में किया गया है, विशिष्ट खुराक - प्रतिक्रिया रिश्तों जो व्यवहार कार्यों के लिए खाते सकता है precluding.

एक उठाया स्थिति में और अपने पेट के नीचे tucked पूंछ के साथ आयोजित पंजे के साथ एक क्रेफ़िश के लिए एक मुद्रा पर हावी प्रदर्शन (लिविंगस्टोन एट अल., 1980) लगा दिया गया है. क्रेफ़िश में पेट बल के राज्य के लिए आसन है कि प्रमुख क्रेफ़िश, एक जोड़ी के भीतर, सामाजिक बातचीत के दौरान प्रदर्शन या, जबकि एक प्रमुख पदानुक्रमित स्थिति (Listerman एट अल, 2000) को बनाए रखने के लिए प्रकट नहीं होता है. विनम्र क्रेफ़िश भी स्वयं के तहत अपने पेट टक के रूप में वे एक प्रतिद्वंद्वी से पीछे हटना. इस तरह पूंछ लपेटने भी एक बचाव मुद्रा (Listerman एट अल, 2000) के रूप में देखा जाता है. इन कार्यों को आसानी से किया गया है क्षेत्र में और प्रयोगशाला सेटिंग में मनाया (Bovbjerg, 1953, 1956, Bruski और Dunham, 1987, ली एट अल, 2000;. Listerman एट अल, 2000 ). दिलचस्प है, व्यवहार आसन lobsters (लिविंगस्टोन एट अल, 1980) में व्यक्त किया 5-HT और ऑस्ट्रेलियाई क्रेफ़िश, Cherax नाशक (McRae, 1996) में octopamine इंजेक्शन के लिए उलट कर रहे हैं. शायद, पूरी तरह से अलग प्रतिक्रिया ऑस्ट्रेलियाई क्रेफ़िश में सतही flexor तैयारी में मनाया जाएगा. इसके अलावा, के बाद से प्रभुत्व आम तौर पर आकार क्रेफ़िश के बीच संबंधित है, एक बहुत तेजी से बदल सामाजिक स्थिति (Strawn एट अल., 2000) के लिए प्लास्टिक प्रतिक्रिया प्रणाली की उम्मीद करेंगे. अकशेरूकीय में neuromodulators के लिए जवाबदेही में plasticity के जांच के एक खुले क्षेत्र है.

Wyttenbach, जॉनसन, और बजरा (1999) डिजिटल मीडिया और विभिन्न क्रेफ़िश ही अन्य क्रेफ़िश की तैयारी के अलावा इस रिपोर्ट में प्रस्तुत पेशी शामिल experimentations के लिए एक प्रयोगशाला पुस्तिका का उत्पादन किया है. इस छात्र के अभ्यास के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

केंटकी के विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, कला और विज्ञान के स्नातक अध्ययन और कॉलेज के कार्यालय द्वारा समर्थित है.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. Bouin’s fixative solution was used directly and methylene blue is made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. Sylgard-bottomed glass dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Model 3000 AC/DC amplifier for intracellular as well as extracellular recordings can be used.
  8. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  9. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. Intracellular electrodes were filled with 3 M KCl.
  10. A suction electrode is used to record extracellular signals.
  11. Faraday cage.
  12. High Intensity Illuminator (light source).
  13. Micromanipulator

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References

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Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322, doi:10.3791/2322 (2011).

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