Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Membrane Potentials, Synaptic svar, neurala kretsar, Neuromodulering och Muscle histologi Använda Kräftor: Student Laborationer

Published: January 18, 2011 doi: 10.3791/2322
Automatic Translation
*1, *1, *2, *1
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Experimenten visar ett enkelt sätt för studenter att få erfarenhet av att granska muskel struktur, synaptiska svar, effekterna av jon gradienter och permeabilitet på membran potential. Dessutom är en sensorisk-CNS-motor-muskeln krets som presenteras för att visa ett sätt att testa effekterna av föreningar på en neuronal krets.

Abstract

Syftet med denna rapport är att bidra till att utveckla en förståelse för de effekter som orsakas av jon gradienter över ett biologiskt membran. Två aspekter som påverkar cellens membran potential och som vi tar upp i dessa experiment är: (1) Ion koncentration av K + på utsidan av membranet, och (2) permeabiliteten i membranet till specifika joner. Kräftorna buken extensor musklerna i grupperingar där vissa är tonic (långsam) och andra phasic (snabb) i deras biokemiska och fysiologiska fenotyper, liksom i sin struktur, de motoriska nervceller som innerverar dessa muskler är motsvarande olika i funktionella egenskaper. Vi använder dessa muskler samt ytliga, tonic buken flexor musklerna för att visa fastigheter i synaptisk transmission. Dessutom introducerar vi en sensorisk-CNS-motorneuron-muskeln krets för att visa effekten av cuticular sensorisk stimulering samt påverkan av neuromodulators om vissa aspekter av kretsen. Med de tekniker som erhållits i denna övning, kan man börja svara på många frågor finns kvar i andra experimentella preparat samt i fysiologiska applikationer relaterade till medicin och hälsa. Vi har visat nyttan av preparat modell ryggradslösa ta itu med grundläggande frågor som är relevanta för alla djur.

Protocol

1. Inledning

Målen för dessa laborationer är att förstå egenskaperna hos retbara membran, den joniska grunden för vila membran potential och metoder för att mäta membranpotential. Dessutom är färgning och histologi av muskel presenteras, som kan användas för att lära muskel struktur. Dessutom är två olika typer av dissekerade preparat som används för att visa egenskaper för synaptisk transmission i olika muskelgrupper. En komplett sensorisk-centrala nervsystemet (CNS)-motorneuron-muskel krets i kräftor buken är också används för att presentera en förberedelse för att undersöka sensorisk stimulering och påverkan från neromodulators och signalsubstanser på olika aspekter av en krets.

Den första delen av denna rapport presenteras de metoder som använts för att mäta vila membran potential och påverkan av extracellulära K + på membranpotential. Vi kommer också att introducera muskel struktur. I den andra delen av detta arbete presenterar vi olika sätt att mäta synaptiska svar från olika typer av neuromuskulära korsningar (NMJs). Den första övningen använder kräftorna buken extensor muskler och den andra använder buken ytliga flexor musklerna. Dessutom presenterar vi en neural krets (den ventrala nerv ur kräftorna med sensoriska in-och utgångar motor) som är lätt att underhålla, och som kan användas för undervisning samt för forskning inom olika aspekter av en sensorisk-CNS -motorneuron-muskel krets. Efter genomgången förklaring av den inledande övningar, presenterar vi fysiologi NMJs och CNS krets.

Den jon övertoning på ett biologiskt membran kan leda till en potentiell skillnad. För en cell i vila, är denna skillnad i elektrisk laddning genom cellmembranet kallas cellens vila membranpotential. Det finns två huvudsakliga faktorer vi kommer att ta upp som påverkar cellens membran potential. Den första är jonkoncentration på båda sidor av membranet. Den andra är joniska permeabiliteten i membranet. Det är viktigt att komma ihåg att i en levande cell finns det ett antal olika joner med olika koncentrationer i och utanför cellen. Det viktiga joner vi kommer att behandla är natrium (Na +), kalium (K +) och klorid (Cl-). De kvantiteter och transport av dessa joner i en muskel membran bestämmer membranpotential. Från denna grund kan vi ta itu med elektriska potentialer som observerats under elektrisk excitation och inhibition av ett membran från synaptiska svar och undersöka effekterna av farmakologiska medel. Vi kan också bygga biofysiska modeller för att representera dessa processer till experimentella testa koncept (Robinson et al., 2010).

Användningen av glas kapillär microelectrodes tillåter inspelning av membran potential. Elektroden kan föras in genom cellmembranet utan skador, ger spetsen är tillräckligt liten och ett rättvisande mått på transmembrana potential kan erhållas. Tekniken är särskilt tillämpligt på stora celler, som är mindre benägna att skadas av införandet av den intracellulära elektroden. Detta är en av de grundläggande teknikerna i fysiologi.

Balansen mellan Na + och K + över membranet upprätthålls av Na-K ATPas pump under fysiologiska förhållanden. Under normala förhållanden pumpen går i genomsnitt tre Na + ut ur cellen och två K + in i cellen. Som en sida noterar, var ett Nobelpris i kemi tilldelades 1997 för denna upptäckt gjordes redan i slutet av 1950-talet. Grunderna i upptäckten erhölls från forskning med axoner från en krabba (Skou, 1965, 1998).

Denna pump anses också electrogenic eftersom den har en större förmåga att pumpa när membranet är depolarized (Skou, 1989a, b). I många celler, hastigheter pumpen när en cell är elektriskt aktiveras av depolarisation.

Kalium kan även röra sig genom kalium "läcka" kanaler medan en cell är i vilotillstånd. På grund av dessa kalium läcker kanaler, är cellmembranet i vila mer genomsläpplig för kalium än för andra joner. Således är cellens vila membranpotential närmare jämvikt potential för kalium än för natrium. Den vilar membranpotential kan sedan undersökas för att se om det beror på kalium balans potential.

1) Muscle variabilitet

Kräftdjur muskelfibrer visa större variation av strukturella drag, membran elektriska egenskaper och kontraktila egenskaper än gör ryggradsdjur muskelfibrerna. Phasic muskelfibrer i kräftdjur är modifierade för att rycka typ sammandragningar. De kännetecknas av korta sarcomere längder (2-4 mikron), tunna, raka Z-linjer, en låg andel av tunna till tjocka myofilamenten, och väl utvecklade system för T-tubuli och sarkoplasmatiskanätmagen. Phasic muskelfiber membran kan generera graderas eller allt-eller-inget aktionspotentialer. Tonic muskelfibrer, å andra sidan är anpassad för långvarig underhåll av spänning. De har ofta sarcomere längder på 10 till 15 mikrometer, tjock, vågig Z-linjer, en hög andel tunna till tjocka myofilamenten och mindre väl utvecklade system för T-tubuli och sarkoplasmatiska nätmagen. Tonic muskelfiber membran är ofta elektriskt inexcitable, eller de kan ge graderas elektriska svar ("graderas spikar"). Ett brett utbud av mellanliggande fibertyper finns i kräftdjur musklerna.

2) Ekvationer

Ekvationer som vanligtvis används för att bestämma balansen potentialen hos en jon och vila membranpotential är Nernsts ekvation och Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) ekvation respektive. En viktig skillnad mellan de två ekvationerna är att Nernsts ekvation används endast för en specifik jon att bestämma jämvikt potential för att jon, medan GHK ekvation används för att bestämma vilopotential genom att överväga att permeabiliteten av flera joner och deras gradienter över ett cellmembran (Nernsts, 1888, 1889, Goldman, 1943; Hodgkin och Huxley, 1952; Hodgkin et al, 1952;. Hodgkin och Katz, 1949, se Hille, 1992).

Nernsts ekvation anses allmänt för joner över ett membran som genererar en elektrisk spänning som ofta visas som:

V = (RT / ZF) ln ([X] ut / [X] i)

X = ion av intresse
V = jämvikt spänning för X jon över membranet
R = gaskonstanten [8,314 J / (mol • K)]
T = absolut temperatur [Kelvin]
Z = valens av jon
F = Faradays konstant [9,649 x 10 4 C / mol]

För K + jon vid 20 ° C och omvandlingen av Ln att logga 10 tillsammans med att fylla i konstanterna, kommer man till:

Potentiella = 58 log ([K] / [K ut]), uttryckt i mV

Låt oss anta att det bara K + är permeant genom diffusion. [K i] är K + koncentration på insidan av cellen och [K ut] är K + koncentrationen på utsidan av cellen.

Som en övning uppskattning [K i]. ______________

Antag för denna beräkning är membranpotential enbart beroende av K + jämvikt potential.

Med tanke på [K ut] = för den använda saltlösning är 5,4 mm. Dessutom antar membranpotential är-70mV.

Potentiella = 58 log ([K] / 5,4).

I experimentet kommer vi att mäta en cells vila membran potential och bestämma hur den påverkas genom att förändra [K ut]. Lutningen på den hypotetiska linjen om membran potential och [K ut] är 58. Efter insamling av data om den vilande membranpotential på olika [K ut] (varierar från 5,4 mm till 100 mm) kommer vi att rita de observerade värdena för att avgöra om det är en match med den hypotetiska linje. Vi kommer att använda den genomsnittliga vila membranpotential erhållas från 5,4 mm [K ut] för att initiera den hypotetiska och observerade linjer för jämförelse.

Med tanke på att ett membran kan vara genomsläpplig för mer än en jon i vila, samt vid olika depolarized stater, använder en av GHK ekvation för att ta hänsyn till permeabiliteten (P i ekvationen) för olika joner. Den GHK ekvationen kommer att minska till Nernsts ekvation om ett membran släpper igenom endast en jon.

Här är en generaliserad GHK ekvation för Na +, K + och Cl - joner:

Ekvation

Sedan Cl - har en negativ laddning, är koncentrationen termen inverterade i denna ekvation för insidan och utsidan. Detta gör att Z (jon avgift) skall falla bort.

3) Mål av denna övning

I detta experiment kommer vi att mäta membranpotential av en kräfta muskelcellen och tillämpa de principer som diskuteras ovan för adress:

  1. Hur man mäter en potentiell cellmembran med lämplig instrumentering och teknik.
  2. Ion permeabilitet muskeln cellmembranet och hur det bidrar till membranpotential.

    Dessutom kommer vi att göra en förstudie av muskel struktur:
  3. Använd fläckar för att markera anatomi musklerna i rygg aspekt av kräftor buken, som används för att utföra dessa elektrofysiologiska experiment.
  4. Undersök histologi av olika typer muskelfibrer.

I denna laboration kommer vi att använda kräftorna buken extensor muskler. Detta preparat har använts tidigare för att undervisa dessa principer i fysiologi end anatomi (Atwood och Parnas, 1968). Vi har använt många av de förfaranden från denna källa och modifierade andra för att tillgodose nuvarande instrument och att fullfölja de mål i en enda 3-timmars studerande laboratorium period. Dessa övningar är en grund för andra experiment som används i djurfysiologi kurs vid institutionen för biologi vid University of Kentucky (Instructor Dr RL Cooper, 2010).

4) Varför denna modell djur

Det finns flera goda skäl för att använda kräftor buken extensor muskler i det här experimentet:

  1. Kräftor är allmänt tillgängliga och är relativt billig och lätt att underhålla i laboratoriemiljö.
  2. Den dissektion är relativt lätt för studenter att lära dissektion tekniker för live förberedelser.
  3. Muskeln är stabilt i flera timmar i en minimal fysiologisk koksaltlösning som fungerar bra för eleverna att lära elektrofysiologiska tekniker. Muskeln preparatet är ganska robust när extern [K +] ändras under korta tidsperioder.
  4. Olika synaptiska svar lätt kan erhållas genom att stimulera motoriska nervceller.
  5. Den anatomiska placeringen av extensor muskler är lätt att urskilja, och på grund av sin storlek är det relativt lätt att få stabila intracellulära inspelningar.
  6. De muskler och innervationen mönster kan observeras enkelt med metylenblått färgning. Dessutom kan viss muskel fibertyper vara lätt behandlas för histologi att observera sarcomere struktur.
  7. Inget djur protokoll behövs vid denna tid för ryggradslösa djur beredningar i laboratorieexperiment i många institutioner inom USA.

2. Metoder

1) Material

  • Saxar (1)
  • Pincett (1)
  • Silvertråd för jordledning (1)
  • Mikroskop (1)
  • Elektrod Probe (1)
  • Petriskål med Sylgard på botten (1)
  • Koksaltlösning (1)
  • Kalium Solutions: 5.4mm (fysiologisk koksaltlösning), 10, 20, 40, 80, 100 mm
  • Bleach (liten mängd, användning för toppen av silvertråd att bygga Ag-Cl)
  • Glaspipett (1), ta bort och lägga till lösningar
  • Spruta (1)
  • Förstärkare / Förvärv System (1)
  • Faradays bur (1)
  • Desktop / Laptop (1)
  • Dissection stift (4)
  • Kräftor

2) Metoder

2,1) Förberedelse / Dissection:

  1. En kräfta cirka 6-10 cm i kroppslängd bör erhållas (eller en hanterbar storlek). Håll kräftor på baksidan av huvudet eller ungefär en centimeter från baksidan av ögonen. Se till att klorna av kräftor eller munnen inte kan nå den enskilde hanterar kräftor. (Kräftorna kan placeras i krossad is i 5 minuter att söva den före skära av huvudet.)
  2. Använd den stora saxen att snabbt ta bort huvudet. Gör en ren och snabb klipp från bakom ögonen på kräftor. Kasta huvudet och bihang.
    Figur 1
    Figur 1. Bilden visar placering av snittet för att ta bort huvudet av kräftor.
  3. I ben och klor av kräftor kan avlägsnas i detta skede för att undvika skador. Stylets på hanar och swimmerets på både hanar och honor kan även tas bort (Figur 2). Nästa, separat buken från bröstkorgen. Gör ett snitt längs med ledade membran som går med i buk och thorax (figur 3). Spara buken delen av kräftor och avyttra bröstkorgen.
    Figur 2
    Figur 2. Saxen skär den stylets. Dessa kan tas bort från kräftor.
    Figur 3
    Figur 3. Bilden visar placeringen av snittet för att ta bort bröstkorgen från buken.
    Figur 4
    Figur 4. Borttagning av bröstkorgen från buken. Snittet bör göras i runda sätt längs linjen i sammanfogning av segmenten.
    Figur 5
    Figur 5. Den översta bilden visar buken med swimmeret bihang. Nedre bilden visar buken utan swimmeret bihang.
  4. Med buken, bör en minskning ske i skalet längs undre, sido-gräns på varje sida av buken. Försiktighet bör iakttas att inte skära för djupt i kräftor. Att hjälpa till i arbetet med att minska skalet ska skära göras med saxen pekande förolämpa ner mot ventrala sidan och i vinkel. Följ den naturliga skal mönster av linjer kräftor som kör längden av varje segment (Figur 6).
    Figur 6
    Figur 6. Saxar placeras i vinkel och följ den naturliga anpassningen av skalet. Klipp inte för djupt och förstöra förberedelserna. Den pilar pekar på den naturliga linjen längs varje segment som bör följas för nedskärningar.
  5. Ta bort den ventrala delen av skalet. Se till att inte förstöra magmusklerna. Använd pincett för att ta bort den ventrala delen. När den ventrala delen av skalet tas bort kan en vit massa av vävnad ses på toppen av den djupa Flexor muskler. Denna vävnad kan tas bort försiktigt med pincett.
    Figur 7
    Figur 7. Ta bort den ventrala delen av skal med pincett. Dra upp och tillbaka på den ventrala delen att ta bort. Förstör inte musklerna under ventrala skalet.
    Figur 8
    Figur 8. Dra tillbaka på den ventrala delen av skalet som ska kasseras.
    Figur 9
    Figur 9. Skär den ventrala delen av preparatet med sax och kasta.
  6. Mag-tarmkanalen, ett litet rör som löper längs mittlinjen av den djupa Flexor muskler, kan tas bort från kräftor. Nyp upp i tarmkanalen med pincett och dra bort från buken. Skär ner på tarmkanalen - i slutet av svansen. Skölj dissekering med koksaltlösning för att säkerställa fekal avfallet inte störa förberedelserna.
    Figur 10
    Figur 10. Bilden visar avlägsnande av mag-tarmkanalen från beredningen.
  7. Använd dissekering stift för att säkra förberedelserna till petriskål. De övre och nedre hörn av preparatet bör nålas ner i skålen. Koksaltlösning bör hällas i petriskål och omfatta förberedelse helt förrän intracellulära inspelningar utförs.
    Denna dissektion maträtt bör ha en Sylgard (Dow Corning) beläggning på undersidan (1 cm tjock) så att insekten stift kan fastna i den.
    Dissekerade förberedelser badar i vanliga kräftor saltlösning, modifierad från Van Harreveld lösning (1936), som är gjord med 205 NaCl, 5.3KCl, 13,5 CaCl 2, 2H 2 O, 2,45 MgCl 2, 6H 2 O, 5 HEPES och justeras till pH 7,4 (i mm).

2,2) Intracellulär inspelning

Figur 11
Figur 11. Övergripande inställning i färdskrivaren.

  1. Den petriskål med beredningen bör placeras under mikroskop och säkras med vax i botten av skålen för att förhindra rörelser.
    Figur 12
    Figur 12. Placering av preparatet i mikroskop. Använd vax för att säkra petriskål och förberedelse.
  2. Två kablar med vardera en kort längd av silvertråd fäst ena änden bör erhållas. Den silvertråd ska doppas i en liten mängd blekmedel i ca 20 minuter att få en Ag-Cl beläggning. Tvätta tråd med vatten innan du använder. Ett glas intracellulära pipett ska inhämtas och försiktigt återfylls med en lång nål fäst vid en spruta fylld med en 3M KCl lösning. Pipetten bör avslås (med öppningen mot golvet) och fylld med lösningen. Detta kommer att säkerställa att eventuella överskott KCl kommer att rinna ut på baksidan av elektroden. Var säker på att ingen KCl löper längs glaspipett som kommer in i saltlösning bad. Vänd pipetten upprätt när den är klar att fylla med kaliumkloridlösning. Den silvertråd kan sedan placeras i pipetten. Den andra änden är ansluten till + (positiv) polen på förstärkaren huvudet scenen. Pipetten är då säkrad på elektroden sonden. Försiktighet bör inte bryta elektroden spetsen. En tredje tråd fäst vid Faradays bur bör placeras i den gröna stolpen av huvudet scenen. Slutligen Ag tråd av resterande bly bör placeras i badet och den andra änden ansluten till - (negativ) polen visas nedan. En tråd bör också placeras på Faradays bur till marken del av AD-omvandlare Powerlab. Huvudet skede är ansluten till "input-probe" på förvärv / förstärkare (Powerlab).
    Figur 13
    Figur 13. Chef skede konfiguration. Tråden är ansluten till den gröna ingången av huvudet scenen är jordad till förstärkaren eller Faradays bur. Tråden anslutas till den röda ingången är kopplad till elektroden tråd. Den svarta ingång används för att ansluta till bad lösning.
    Figur 14
    Figur 14. "Test växla" är i den nedersta raden att testa elektrod resistance.The "grov"-ratten också återfinnsi DC-offset som bör omvandlas motsols. Gain är satt till 50, vilket förstärker signaler med en faktor av femtio. Marken tråd från huvudet scenen placeras i "GND" pin uttaget öppning.
  3. Den LabChart programvara bör öppnas på skrivbordet eller bärbar dator. Justera diagrammet för att bara visa en kanal genom att klicka på "Inställningar" och sedan "Kanalinställningar". Under "Kanalinställningar", ändra antal kanaler till en. Klicka på "OK". På toppen av tabellen, vänstra hörnet, bör cykler per sekund vara 2K. Ställ volt (y-axel) till ca 200mV till 500 mV. Klicka på "Kanal 1" på den högra delen av skärmen. Klicka på "Input förstärkare." Se till att Differential är markerad.

    Förstärkaren Produktionen skall i kanal ett. Följande inställningar ska användas med förstärkaren:
    • High Pass-DC
    • Notchfilter-OFF
    • Low Pass-20kHz
    • Kapacitet Comp .- moturs
    • DC Offset Fin och kurs knopp-moturs
    • DC Offset (+ OFF-) - OFF
    • Gainratten-50
    • Ingång (DIFF MONO GND) - DIFF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. Som ett mått på elektroden motstånd, bör spänningen delas av den nuvarande, vilket är 2,0 nA (dvs R = V / I, eller Ohms lag). Det resulterande värdet är motståndet i glaselektrod. Motståndet bör vara 20 till 60 MegaOhms. Lägre (<20) och hög resistens (> 100) är inte acceptabelt. När motståndet har bestämts, kan intracellulära inspelningar börja. Placera toppen av glaset elektroden i saltlösning bad. Se till att en jordkabel är även i saltlösning badet.
    Till att börja inspelningen, tryck på start längst ner på skärmen. Se till att förstärkningen är satt till 5 V / div. Använd kursen ratten på förstärkaren för att flytta linjen på LabChart till noll innan du sätter elektroden. Det växla ratten ska vridas på och sedan stänga flera gånger för att testa elektroden motstånd. Därefter bör amplituden av den resulterande värden skall mätas. Placera en markör på den stadiga baslinjen och sedan placera den andra på topp för att få elektroden motstånd.
  5. Använd elektrod sond och mikroskop för att sätta in elektroden i den längsgående muskler (mark eller DEL1 eller DEL2) av preparatet (se diagram 16). Elektroden bör knappt sättas in i muskeln. Inte tränga igenom muskeln. Använd mikroskop och inställningar sond för att hitta de längsgående muskler och att sätta elektroderna i en muskel. Den höga intensiteten belysningen ska anpassas till tydligt se de muskler som elektrod förs in. När peta muskelfibrer i denna beredning kan man ofta stöter på utrymmen och klyftor i muskeln. Detta är anledningen till att membranpotential kan dyka upp, sedan försvinner sedan igen.
    Figur 15
    Figur 15. Införande av elektroden i muskeln.
  6. För att mäta membranpotential, använd grova ratten på förstärkaren för att flytta linjen på LabChart till noll innan du sätter elektroden. Peta en muskelfiber. Därefter mäta amplituden av den resulterande värdena. Placera en markör på den stadiga baslinjen och registrera mätvärdet.
    Skillnaden i markör och den aktiva markören visas på höger sida av skärmen. Värdet ger spänning. De inspelade spänning kan behöva divideras med den mängd förstärkning används på förstärkaren (dvs 10x och 100x förstärkning). Spänningen bör omvandlas från volt till millivolt (1 V = 1000 mV) om värdena redovisas på programvaran som volt.
  7. Försiktigt använda mikroskop och manipulatorer för att ta bort elektroden från muskeln. Poke annan muskelfiber och notera vila membranpotential. Man bör ta flera inspelningar och vara bekväm med åtgärder samt styra intercellulära elektroden i muskelfibrer av intresse.
    Elektroden förmodligen inte kommer att bo i en muskelfiber under byte av alla de olika ändrats [K +] ut lösningar. Det är bäst att dra tillbaka elektroden, ändra sedan lösningen, då tränger igen för att undvika skador på muskeln. Det bästa är att få tre avläsningar per lösning från olika muskelfibrer och använda ett genomsnitt för att undvika falska avläsningar.
  8. Använd en spruta för att ta bort och kasta saltlösning från petriskål. Petriskålen bör fyllas med nästa högre koncentration av kaliumklorid saltlösning, som omfattar förberedelse helt. Samma process upprepas med varje Kalium och förändringarna i spänning / potential bör noteras och registreras. Den serie av [K +] ut kräftor saltlösningar vi använder är: 5,4, 20, 40, 60, 80, 100 mm.

2,3) Anatomi

Nu när fysiologi är klar kan vi undersöka de tillhörandeanatomi av muskelfibrer och innervation mönster. Överför förberedelse till färgning skålen och tillsätt metylenblått (1 gram metylenblått blandas med 100 ml kräftor koksaltlösning). Låt saltlösning bada förberedelse i 5 minuter och sedan ta bort och lägga till färska kräftor koksaltlösning utan fläcken. Anatomi dessa muskler har beskrivits i detalj över åren (Huxley, 1880, Pilgrim och Wiersma, 1963). Först nyligen har några av de muskler som har beskrivits anatomiskt, fysiologiskt och biokemiskt (et al Cooper, 1998;. Griffis et al, 2000;. Sohn et al, 2000.).

Den allmänna anatomiska utformning av musklerna visas i Figur 16 (höger siffra för detta ändamål). Leta efter de viktigaste nerv som innerverar främst musklerna inom ett segment. Skissa innervation mönster till SEM, DEL2, DEL1 och mark muskler i ett segment. Buken behöver sträckas ut helt genom att fästa beredningen i skålen ordentligt. Nästa bort salt och tillsätt Fixeringslösning. Den fixa lösningen är en Bouins lösningen (beredd med mättade pikrinsyra, formaldehyd och ättiksyra, Sigma-Aldrich Co).

VARNING. Bli inte denna lösning på huden eller i ögonen. Undvik ångorna av lösningen genom att arbeta under dragskåp. Om dina ögon börjar brinna tvätta ögonen omedelbart vid ögonspolning.

Låt Bouins lösning kvar på förberedelserna i ca 10 minuter och sedan använda en pipett och utbyte lösningen för koksaltlösning. Skär en tunn bit DEL1 eller DEL2 muskler ut och placera på en glasplatta. Märk bilden. Upprepa proceduren för SEM muskeln. Visa sarcomere ränder mönster i såväl mjukpapper beredningar. Du kan använda det sammansatta mikroskopet och justera målen därför att se ränder mönster. Om möjligt ta ett digitalfoto genom ögat-bit av mikroskop (OBS! Vissa mobiltelefon kameror fungerar bra för detta förfarande).

Figur 16
Figur 16. Schematisk ritning från en ventral bild av ryggdelen av kräftor buken visar extensor muskulatur i varje segment. Den dorsala membran buken muskler (DMA) och ytliga extensor tillbehöret muskel huvudet (SEAcc) förekommer i segment 1 till 5 av buken med en annan inriktning för varje segment. Med undantag av del 1, dessa muskler har sin infästning webbplatser på deras främre änden till förkalkad tergite och vid den bakre änden i artikulära membran. I del 1, homolog muskler har sina främre infästning platser till artikulär membranet ligger mellan bröstkorgen och buken. Bilden var baserad på fotografiska montage metylenblått färgade preparat. På den vänstra sidan av figuren alla djupa extensor muskler har tagits bort för att visa rygg ytliga extensor muskler. Skala = 2,35 mm. (Utdrag ur Sohn et al. 2000).

3. Resultat

Följande frågor och databehandling illustrera de viktigaste principerna och målen för detta laboratorium förfarande.

  1. Plotta de åtgärder som erhålls för vila membran potential i varje [K +] ut används. Se om det observerade och hypotetiska linjer matchas i sin sluttning. För att rita värdena använda en semi-log tomt med x-axeln av varierande [K +] ut som en stock och y-axeln av membranet potentialer (enligt nedan, Figur 17). (Ladda ner gratis rutat papper om det behövs http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
    Figur 17
    Figur 17. Rutat papper
    Använd den genomsnittliga vila membranpotential erhållas från 5,4 mm [K +] ut för att inleda hypotetiska och observerade linjer för jämförelse.
    Om linjerna inte stämmer överens diskutera varför detta kan vara.
  2. Om du ändrat den externa nivån av Na + joner, skulle du förvänta dig samma typ av förändringar som observerats för byte av K + koncentration?
  3. Hur väl har metylenblått fläcken musklerna jämfört med nerverna? Varför kan det finnas skillnader? Är metylenblått som idag används för identifiering av vävnader eller kontrast i levande mänskliga celler? Vilken relation är där med Sigmund Freud och fläckar används i kräftor?
  4. Notera eventuella skillnader i sarcomere mönster mellan DEL och SEM muskler. Om så är fallet, vad kan vara orsaken? Har alla muskler har samma vilande sarcomere avstånd? Rita muskeln banding mönstret du observerats med mikroskop och etikett så mycket av bilden som möjligt (i förhållande till kända sarcomere muskler anatomi).

4. Mätning Synaptic Responses

1) INLEDNING

Buken extensor muskler preparat som används för att demonstrera vila membranpotential är också idealisk för att visa induktion av synaptiska svar på NMJs från de olika musklerna. Vissa muskler i kräftdjur selektivt innerveras av antingen en phasic eller en tonic motorneuron, även om vissa enstaka fibrer kan innerveras av både phasic och tonic excitatoriska motoriska nervceller, till exempel för extensor muskulatur i kräftor gå ben (Atwood, 2008, se JUPITER produktion ID # 2319-Wu och Cooper, 2010) och de flesta andra muskler lem (Wiersma, 1961 a). Genom att selektivt stimulera phasic och tonic motoriska nervceller kan fysiologiska skillnader i EPSPS mätas. Phasic motoriska nervceller producerar snabba ryckningar i muskelfibrer och framkalla EPSPS på order av 10-40 mV. Den phasic svar kan sänka snabbt med 5-10-Hz tåg av stimulering. Den tonic motoriska nervceller ger upphov till mindre EPSPS som kan underlättas i närvaro av en högre frekvens (10-50 Hz) av stimulering. Strukturellt, det presynaptiska phasic och tonic terminaler vid NMJs är olika (Atwood och Cooper, 1996; Bradacs et al, 1997;.. Cooper et al, 1998).

Överraskande fenotypen av phasic fysiologiska reaktioner kan genomgå en omvandling till en tonic-liknande tillstånd med elektriskt konditionering phasic nervceller i ett par timmar dagligen under 7 dagar (Cooper et al, 1998;. Mercier och Atwood, 1989). Även känsligheten för neuromodulering i förvandlas NMJs är utmärkt för att undersöka regleringen av receptorer (Griffis et al., 2000).

I denna relativt robusta förberedelse (kräftor magmuskler), är båda tonic och phasic svar enkelt registreras och undersökas för att underlätta och / eller depression av synaptiska svar med varierande stimulans paradigm. Med dessa förberedelser kommer studenterna kunna känna igen allmänna ordalag om phasic och tonic synaptiska svar genom att stimulera en nerv bunt.

En ytterligare NMJ förberedelse presenteras används för övervakning inneboende motorisk aktivitet och sinnesretning inducerade motorisk aktivitet från CNS. Detta är den ytliga flexor musklerna på den ventrala sidan av kräftor buken. Denna förberedelse kommer också att användas för att övervaka sensoriska-CNS-motor-muskel krets och effekterna av neuromodulators (Strawn et al., 2000).

I varje buken segment (utom den sista) Det finns tre funktionella grupper av muskler: (1) de som kontrollerar pleopod (swimmerets) rörelse, (2) tre extensor muskler och (3) tre muskler flexor. Den flexors och extensorer är antagonistiska muskelgrupper som medför antingen buken flexion eller förlängning genom att orsaka rotation om intersegmental gångjärn. Den phasic muskulatur upptar större delen av volymen av buken, medan toniska musklerna består tunna blad av fibrer som spänner över rygg (extensorer) och ventrala (flexors) aspekt av varje buken segment.

I kräftor, är de tonic buken flexor musklerna kräftor innerveras i varje halva segment av fem motoneurons och genom en perifer hämmande neuron. Den excitatoriska motoneurons använder glutamat som signalsubstans. Glutamat depolarizes muskelfibrer genom att orsaka en ökning av permeabilitet främst natriumjoner. Den hämmande nervceller ut gamma-amino smörsyra (GABA), som vanligtvis hyperpolarizes muskelfibrer genom att orsaka en ökad permeabilitet för kloridjoner. I vissa kräftdjur muskler (främst i benen), den perifera hämmande nervceller göra synaptiska kontakter med motorneuron terminaler samt med muskelfibrer och minska mängden sändare släpptes av motor neuron (presynaptisk hämning) (Dudel och Kuffler, 1961 ). Detta fenomen är inte närvarande i tonic flexor musklerna av kräftor.

Den ventrala nerv ur kräftor är ett bilateralt symmetrisk struktur kör längden på djuret. Det finns ett ganglion per kropp segment. I buken (6 segment), innehåller varje ganglion flera hundra neuroner, och varje av de två konnektiv består av några tusen axoner. Nervcellen kroppar bildar ett lager flera cell organ tjockt på den ventrala ytan på varje ganglion. Omedelbart ovanför cellkroppen lagret är en fin meshwork av neuronala processer, neuropile. Alla synaptiska interaktioner inträffa här, cellens organ saknar synapser.

Varje buken ganglion (utom den sista) har tre rötter på varje sida. Den första roten innehåller axoner av nervceller innervating de pleopod muskulatur och sensoriska axoner, den andra roten innehåller axoner innervating phasic och tonic extensor muskulatur och sensoriska axoner, och den tredje roten, vilket gör att nerven sladden flera millimeter caudal till ganglion, innehåller axoner innervating phasic och tonic flexor muskulatur. Det finns två grenar av den tredje roten. Den djupa grenen (IIIa) innerverar bara phasic flexor musklerna. Den ytliga grenen av den tredje roten (III b) i varje halv-segmentet innehåller sex axoner som innerverar tonic flexor musklerna.

Nervceller innervating de tonic flexor är spontant aktiva, till skillnad från phasic efferent nervceller, och i en bra förberedelse, kommer de att fortsätta att skjuta i många timmar efter att buken har tagits bort från djuret. För en översikt av den historiska karaktären av de upptäckter som gjorts i dessa buken förberedelser se Atwood (2008). Cellen organ fyra av de motoriska nervceller och perifera inhibitoriska neuron innervating de tonic flexor musklerna på något halv segment finns i ganglion i detta segment. Cellkroppen av den återstående motor neuron ligger i nästa caudal ganglion. Dessa nervceller kan tillförlitligt särskiljas från varandra på grundval av extracelluarly inspelade spik amplituder. Om tonic flexor muskler från en halv segment tas bort tillsammans med de två ganglier som innehåller de nervceller innervating denna muskel, fem nervceller brukar visa en viss grad av spontan aktivitet. Dessa nervceller är numrerade på grundval av relativa extracellulärt spik amplitud, i stigande ordning. F1 till F4 är motoneurons och F5, den största spontant aktiva neuron, är den perifera flexor-hämmare. F6, den största motor neuron, är en excitatoriska motorneuron som sällan spontant aktiv.

Den spontana natur tonic motorneuron aktivitet kan moduleras av exogena tillämpning av föreningar eller genom att ge en sensorisk stimulans för nagelbanden inom samma segment som övervakas för motor nervaktivitet.

2) Dissection

För att få buken extensor beredningen samma procedur som beskrivs ovan för att pröva vilande membranet potentialen i förhållande till extracellulära kalium. Skillnaden är att ta hand om segmentell nervknippen som löper längs sidan av ryggskölden. Denna nerv kommer att dras in i ett sug elektrod som kommer att fungera som stimulerande elektrod. Stimulera vid 1 Hz för övervakning phasic svar. Stimulera med korta skurar av pulser 10Hz i 10 till 20 stimuli medan du övervakar tonic svar.

Det experimentella förfaranden för vård experiment på flexor kräftor tonic muskler är olika och man måste lämna ventrala nerven sladden intakt. Ett preparat som består av flera buken segment görs. Detta erhålls på följande sätt:

  1. En kräfta cirka 6-10 cm i kroppslängd bör erhållas (eller en hanterbar storlek). Skaffa kräftor genom att hålla den från baksidan av huvudet eller ungefär 2 eller 3 centimeter från baksidan av ögonen. Se till att klorna av kräftor eller munnen inte kan nå försöksledaren vid hantering av kräftor. Kasta huvudet och bihang först ta bort dem.
  2. Använd sax för att snabbt ta bort huvudet. Gör en ren och snabb klipp från bakom ögonen på kräftor.
    Figur 18
    Figur 18. Bilden visar placering av snittet för att ta bort huvudet av kräftor.
    I ben och klor av kräftor kan avlägsnas i detta skede för att undvika skador. Stylets på hanar och swimmerets på både hanar och honor kan även tas bort (Figur 19 och 20). Nästa, separat buken från bröstkorgen. Gör ett snitt längs med ledade membran som går med i buk och thorax (figur 20).
  3. Spara buken delen av kräftor och avyttra bröstkorgen.
    Figur 19
    Figur 19. Bilden visar placeringen av stylets som kan tas bort från kräftor.
    Figur 20
    Figur 20. Bilden visar placeringen av snittet för att ta bort bröstkorgen från buken.
    Figur 21
    Figur 21. Borttagning av bröstkorgen från buken. Snittet bör göras i runda sätt längs linjen för sammanfogning av segmenten.
    Figur 22
    Figur 22. Den översta bilden visar buken med bihang. Nedre bilden visar borttagning av buken bihang.
  4. Placera den isolerade svansen beredningen i saltlösning i en stor petriskål. Pin ner svansen och övre delen av preparatet i skålen. Se till att beredningen är säker. Använd en skalpell för att ta bort en kvadrat del av den ventrala sidan av förberedelserna mellan revbenen.
    Figur 23
    Figur 23.Visar var snittet ska göras för att ta bort den ventrala dryck av preparatet.
  5. En liten skär bör göras (kan också göras med sax). En flik ska klippas och lyfts uppåt. Luckan kan sedan tas bort med en sax, utsätta de djupa flexor musklerna. Mikroskopet bör användas under denna process för att säkerställa precision i att ta bort ventrala delen av preparatet.
    Figur 24
    Figur 24. Skärning förberedelser med sax för att exponera muskler.
    Figur 25
    Figur 25. Översta bilden visar att greppa i luckan med pincett. Nedre bilden visar bort luckan från förberedelserna med mikroskop.
    Figur 26
    Figur 26. Exponering av ytliga Flexor muskler.

3) Intracellulär inspelning:

Figur 27
Figur 27. Övergripande inställning i färdskrivaren.

  1. Den petriskål med beredningen bör placeras under mikroskop och säkras med vax i botten av skålen för att förhindra rörelser.
    Figur 28
    Figur 28. Visar placering av preparatet i mikroskop. Använd vax för att säkra petriskål och förberedelse.
  2. Två kablar med korta längd av silver fäst vid ena änden bör erhållas. Den silvertråd ska doppas i en liten mängd blekmedel i ca 20 minuter att få en Ag-Cl beläggning. Tvätta tråd med vatten innan du använder. Ett glas intracellulära pipett ska inhämtas och försiktigt fylld med en KCl (3 M) lösning. Pipetten bör avslås (med öppningen mot golvet) och fylld med lösningen. Den senare kommer att säkerställa att eventuella överskott KCl kommer att droppa ut på baksidan av elektroden. Var säker på att ingen KCl löper längs glaspipett som kommer in i saltlösning bad. Vänd pipetten upprätt när den är klar att fylla med kaliumkloridlösning. Den silvertråd kan sedan placeras i pipetten. Den andra änden är ansluten till + (positiv) polen på huvudet scenen. Pipetten är då säkrad på elektroden sonden. Försiktighet bör inte bryta elektroden pipetten. En tredje tråd fäst vid Faradays bur bör placeras i den gröna stolpen av huvudet scenen. Slutligen Ag tråd av resterande bly bör placeras i badet och den andra änden ansluten till - (negativ) polen visas nedan. En tråd bör också placeras på Faradays bur till marken del av AD-omvandlare Powerlab. Huvudet steget är ansluten till "input-probe" på förvärv / förstärkare (Powerlab).
    Figur 29
    Figur 29. Chef skede konfiguration. Tråden är ansluten till den gröna delen av huvudet scenen är jordad till förstärkaren eller Faradays bur. Tråden anslutas till den röda delen är kopplad till elektroden tråd. Den svarta delen används för att ansluta till bad lösning.
    Figur 30
    Figur 30. "Test växla" är i den nedersta raden att testa elektrod motstånd. Den "grova" knoppen är också hittas under DC-offset som bör omvandlas motsols. Gain är satt till 50, vilket förstärker signaler med en faktor av femtio. Marken tråd från huvudet scenen placeras i "GND" pin uttaget öppning.
  3. Den LabChart programvara bör öppnas på skrivbordet eller bärbar dator. Justera diagrammet för att bara visa en kanal genom att klicka på "Inställningar" och sedan "Kanalinställningar". Under "Kanalinställningar", ändra antal kanaler till en. Klicka på "OK". På toppen av tabellen, vänstra hörnet, bör cykler per sekund vara 2K. Ställ volt (y-axel) till ca 200mV till 500 mV. Klicka på "Kanal 1" på den högra delen av skärmen. Klicka på "Input förstärkare." Se till att Differential är markerad.

    Förstärkaren Produktionen skall i kanal ett. Följande inställningar ska användas med förstärkaren:
    • High Pass-DC
    • Notchfilter-OFF
    • Low Pass-20kHz
    • Kapacitet Comp .- moturs
    • DC Offset Fin och kurs knopp-moturs
    • DC Offset (+ OFF-) - OFF
    • Gainratten-50
    • Ingång (DIFF MONO GND) - DIFF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
  4. För att mäta elektroden motstånd, bör spänningen delas av den nuvarande, vilket är 2,0 NA. Det resulterande värdet är motståndet i glaselektrod. Motståndet bör vara 20 till 60 MegaOhms. När motståndet har bestämts, kan intracellulära inspelningar börja. Placera toppen av glaset elektroden i saltvatten badet. Se till att en jordkabel är även i saltlösning badet.
    Till att börja inspelningen, tryck på "start" längst ner på skärmen. Se till att förstärkningen är satt till 5 V / div. Använd kursen ratten på förstärkaren för att flytta linjen på LabChart till noll innan du sätter elektroden. Det växla ratten ska vridas på och sedan stänga flera gånger för att testa elektroden motstånd. Därefter bör amplituden av den resulterande värden skall mätas. Placera en tillverkare den stadiga baslinjen och sedan placera den andra på topp för att få elektroden motstånd.
  5. Använd elektrod sond och mikroskop för att sätta in elektroden i en muskel. Inte tränga igenom muskeln. Använd mikroskop och inställningar sond för att hitta det tunna lagret av muskelfibrer och att sätta elektroderna i fibrerna. Den höga intensiteten belysningen kan användas som en ljuskälla då tränga in i muskeln.
    Figur 31
    Figur 31. Införande av elektroden i muskeln.
  6. Försiktighet måste vidtas för att undvika skador på nervrötter i ytliga muskler.
    Det är lämpligt att hålla saltlösning bad förberedelserna svalt (10-15 grader) och väl syresatt vid utförandet av den experimentella procedurer. Om kylaggregat finns inte ersätta saltlösning med färsk, kyld saltlösning regelbundet. Syrgas, eller åtminstone luften bör bubblas genom koksaltlösning.
  7. Anteckna spontana aktivitet EPSPS. Notera de olika storlekarna av EPSPS och om IPSPs är närvarande.
  8. Mycket noga att ta en liten färg buske och för hand stimulera längs nagelbanden kanten inom samma segment som en följer den spontana aktiviteten. Notera en förändring i frekvensen av svaren och om olika storlek EPSPS verkar som inte fanns före stimulera nagelbanden.
    Figur 32
    Figur 32. Beredningar stimulerande pensel och nervrötter. (Modifierad från Strawn et al., 2000)
  9. Stimuleringen kan upprepas efter noggrant byta ut saltlösning bad med en som innehåller en neuromodulator som serotonin (1 microM) eller saltlösning bubblade med CO 2. Notera effekt på aktiviteten profilen för en viss stimulans. Notera också om utbyte av koksaltlösning tillbaka till färsk koksaltlösning återgår verksamheten till dess ursprungliga skick.
  10. Därefter kan man följa neural aktivitet i sensoriska-CNS-motorneuron krets på olika sätt. Vi kan använda en sug elektrod i stället för en intracellulär elektrod (Figur 33) för att övervaka motorneuron aktivitet. På toppen av glaset sug elektroden är plaströr placeras som har en öppning av rätt storlek för att dra nerven i spetsen. Öppningen bör inte vara för stor, eftersom nerven skulle falla ut, eller för liten, eftersom nerven skulle skadas av trycket från elektroden. Den plastslang dras över en låga och trimmat tillbaka till krävs storlek.
    Figur 33
    Figur 33. Installera med sug elektrod inspelning arrangemang.
    Placera mikromanipulator i en position där sug-elektroden har enkel tillgång till salta bad. Sug upp koksaltlösning tills den är i kontakt med silver inuti sug elektroden. Ordna den andra kabeln på cut-sidan av sug elektrod nära spetsen av elektroden, så båda ledningarna kommer i kontakt med koksaltlösning badet.
    När det gäller elektriska övervakning anslut AC / DC differentialförstärkare (förstärkare) till 26T Ström Lab. Gör detta genom att ansluta den rätta kabeln från ingång 1 på PowerLab 26T till utgången på förstärkaren.
    • Förstärkaren instrumentet kontroller bör sättas till följande inställningar:
      • High Pass-DC
      • Notchfilter-OFF
      • Low Pass-20kHz
      • Kapacitet Comp .- moturs
      • DC Offset Fin och kurs knopp-moturs
      • DC Offset (+ OFF-) - OFF
      • Gainratten-50
      • Ingång (DIFF MONO GND) - DIFF
      • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
      • ΩTEST-OFF
    Anslut huvudet scenen till "input-sond" på förstärkaren.
    Anslut den elektriska kablarna från sug elektroden till huvudet scenen. Ledningarna skall anslutas med den röda (positiva) längst upp till vänster, grön (jord) i mitten, svart (negativ längst ner. Detta indikeras i Figur 34. Jordledningen bara kan läggas i saltlösning badet.
    Figur 34
    Figur 34. Chef skede konfiguration
  11. Nu ansluter USB-sladden från PowerLab 26T till den bärbara datorn. Kontrollera att både förstärkaren och PowerLab26T är inkopplad och påslagen innan du öppnar LabChart7 på datorn.
  12. Öppna LabChart7.
    • Den LabChart Welcome Center ruta poppar öppna. Stänga det. </ Li>
    • Klicka på Inställningar
    • Klicka på kanal inställningar. Ändra antal kanaler till 1 (nedre vänstra hörnet av rutan) tryck på OK.
    • Längst upp till vänster i diagrammet anger cykler per sekund till cirka 2k. Ställ volt (y-axeln) till omkring 500 eller 200mV.
    • Klicka på Kanal 1 till höger i diagrammet. Klicka på Input förstärkare. Se till att inställningarna: single-ended, AC kopplade, och invertera (inverterar signalen om det behövs), och anti-alias, kontrolleras.
    • Till att börja starta inspelningen trycker på.
    Vi kan spela in från den gren av den 3: e roten som innerverar de ytliga flexor musklerna (filial IIIb) att övervaka storlek aktionspotentialen med extracellulära inspelning. Den extracellulära nervimpulser kallas "spikes". Minns att det finns fem Excitor motoriska nervceller och en hämmare motorneuron i roten (Kennedy och Takeda, 1965, Velez och Wyman, 1978). Stimulering av nagelbanden med en borste eller exponering av neuromodulators kan användas (Figur 35). Den pensel kan användas för hand eller för konsekvent stimulering kan det vara monterad på en mikromanipulator att kontrollera mängden av tryck och rörelse.
    Figur 35
    Figur 35. Aktivitet i 3: e roten före och under cuticular stimulans i saltlösning (överst) och i 100 nM 5-HT (botten). Tiden under nagelbanden stimulering indikeras av baren. Notera ökad aktivitet före och efter stimulering då preparatet badar i 5-HT (modifierad från Strawn et al., 2000).
    Vi kan spela in från den 1: a eller 2 rötter a genom att göra en en passant inspelning av nerv, eller vi kan transekt roten bort från VNC och spela in rena sinnesintryck som härrör från periferin som skulle sända signaler till VNC. Således skulle du spela in från transected roten leder till periferin för sensorisk aktivitet.
    Den 2: a roten innehåller mycket stora primära afferenta axon från organ muskel-receptorn (MRO) och mindre axoner av efferents till extensor motoriska nervceller (Fält och Kennedy, 1965). Det finns många sensoriska axoner i 1 och 2 rötter ND.
    Den mechanosensory nervceller har direkta förbindelser, av elektriska synapser med laterala gigantiska axoner (LG) (Krasne 1969, Zucker 1972). Dessutom är mechanosensory nervceller kända för att excitera interneuronen via kemiska synapser.
    Att undersöka hur sinnesintryck kan påverka motorneuron aktivitet, genom en sensorisk-CNS-motorneuron krets, kan vi spela in synaptiska svar i en muskel. Olika aspekter av kretsen vi kommer att använda kan undersökas. Till exempel kan vi spela in från de sensoriska nervrot ensam eller motorn roten med eller utan intakt sensorisk input i VNC Att analysera spetsen frekvens inspelningar, kan man räkna med under en viss tid i olika förhållanden. Åtgärderna kan göras före borsta stimulering och under penseln stimulering för en viss tid (Figur 35). Man kan upprepa villkor 5 gånger och få den genomsnittliga procentuella förändringen i frekvens som en åtgärd för att göra jämförelser.
    Man kan också ansöka exogena ämnen som serotonin (Strawn et al., 2000) eller acetylkolin (ACH), nikotin eller glutamat. Olika beteendemässiga åtgärder har beskrivits för nikotin i ryggradslösa djur. Detta tyder på förekomst av nikotinreceptorer (Tsunoyama och Gojobori, 1998). Glutamat är en stor excitatoriska neurotransmittorn i de flesta ryggradslösa djur på NMJ och ACH är den viktigaste excitatoriska neurotransmittorn i CNS (Monoghan et al, 1989;. Watkins, et al, 1990).
    Man kan prova heptanol eller CO 2 bubblade koksaltlösning eftersom det kommer att koppla bort kräftor septate (eller gap) junctions inom kretsen som Dr Sonya M. Bierbower (University of Kentucky) har visat i sin avhandling forskning. Denna åtgärd kan stå för förändrade hela djurens beteende när de utsätts för höga CO 2 i miljön (Bierbower och Cooper, 2010). När du stimulerar nagelbanden med en borste och kör sinnesintryck och spela in ett svar i den motoriska nervceller, notera om det finns en skillnad i verksamheten före och under heptanol eller CO 2 exponering. Detta kan eller inte kan föreslå gap-junctions att ha en roll i den sensoriska-CNS-motorneuron krets.

Discussion

Membranpotential

Så tidigt som 1902, var Bernstein behandlar frågan om en vilande potential i axonet av en bläckfisk. Det är spännande att fundera på hur dessa tidiga idéer och observationer av Berstein (1902) och Nernsts (1888) senare påverkas forskning i membranet fysiologi. (Se recension av Malmivuo och Plonsey 1995, även tillgänglig på www http://www.bem.fi/book/ ). Det finns fortfarande, till denna dag, genombrott görs om jonkanal funktion och egenskaper hos biologiska membraner som är mycket betydelsefulla för att förstå cellens fysiologi som rör funktionen hos vävnader, organ och system.

En jämförelse mellan de härledda experimentella och teoretiska effekterna av yttre [K +] i vila membranpotential indikerar påverkan av joner på membranet potential. Ytterligare försök med samma preparat återstår att utföras för att ta itu med grundläggande fysiologiska frågor. Några lyftes fram redan 1968 av Atwood och Parnas och har ännu inte helt itu. Med de tekniker som erhållits i denna övning, kan man fortsätta att svara på många frågor finns kvar i andra experimentella preparat samt i fysiologiska applikationer relaterade till medicin och hälsa. Vi har visat nyttan av en modell ryggradslösa förberedelse för att ta itu med grundläggande frågor relevanta för alla djur.

Med de kunskaper som förvärvats på elektrokemiska gradienter av joner i ovanstående övning kan du avancera nu till retbarhet av membran genom att undersöka synaptisk transmission vid neuromuskulära förberedelser i kräftor.

Mätning Synaptic Svar

Uppgifterna ges för första delen av detta laboratorium och tillhörande filmen, har gett viktiga stegen för inspelning membran potential och undersöka muskel struktur. I den andra delen av detta laboratorium, förutsatt att påvisa dissektion och inspelning synaptisk transmission vid NMJs av phasic och tonic Motorenheterna en exponering för grundläggande begrepp inom fysiologin. Exponeringen för en neural krets, som kan delvis kan användas för att förklara samband beteenden, i det intakta djuret har potential inte bara för studenter att undersöka olika öppna frågor inom sin laboration, men också för framtida forskning om neuronala kretsar i en väl etablerade ryggradslösa förberedelse (Kennedy et al, 1969;. Antonsen och Edwards, 2003)

Dessa preparat kan också användas för att undersöka synaptiska underlättande, depression och långvarig plasticitet (ej undersökts i detta laboratorium studie). Även inom vissa arter av kräftor, beror neuronal plasticitet på den experimentella stimulering villkoren (Mercier och Atwood, 1989;. Cooper et al, 1998) samt deras naturliga miljö. I vilken utsträckning möjligheten att förändra synaptisk effekt och dynamik muskler tjänar djuret återstår att undersöka. Eftersom kräftor ändrar sitt beteende i förhållande till säsongsvariation och molt cykeln, finns det relativt långsiktig verksamhet skillnader i neuromuskulära system. Det har visat att phasic motoriska nervändslut klons närmare muskler uppvisar den klassiska phasic morfologi under vintern, men sväller och blir mer åderbråck längs terminalen under sommarmånaderna (Lnenicka 1993, Lnenicka och Zhao, 1991).

Några tidiga studier på kräftor laterala jätte (LG) interneuronen inom ventral nerven sladden påvisat gap-junctions (Johnson, 1924, Watanabe och Grundfest, 1961). Det är väl känt att CO 2 har en effekt på elektrisk kommunikation genom frånkoppling gap junctions (Arellano et al, 1990). Det har nyligen visat att nerven sladden och kommunikation inom sensorisk-CNS-motor-muskel krets, som beskrivs i denna rapport är också känslig för CO 2 exponering, tyder på förekomst av gap-junctions (Bierbower, 2010, Bierbower och Cooper, 2010)

Den spontana aktiviteten av den 3: e motorn roten har varit ett ämne sedan 1960-talet när Eckert (1961) undersökte om tonic bränning statiska orgel muskel-receptorn (MRO) inom samma eller angränsande segment kan stå för det spontana motordrift. I dessa tidigare studier visade det sig att verksamheten drevs i ventrala nerv sladd (VNC) eventuellt från högre centra (Eckert, 1961, Kennedy och Takeda, 1965a, b;. Strawn et al, 2000). Eftersom förekomsten av CO 2 stoppade spontan aktivitet, kan man anta någonstans i enheten till motoriska nervceller kan det finnas gap-junctions eller glutamaterg excitatoriska enhet. Den NMJs är blockerade eller uppvisar minskad känslighet för glutamat i närvaro av CO 2, och de kan vara blockKed såväl inom CNS (Bierbower, 2010, Bierbower och Cooper, 2010, se även Badre et al, 2005.).

Den handling av olika neuromodulators är också lätt studeras på olika typer av NMJs (Cooper och Cooper, 2009; Griffis et al, 2000;. Southard et al, 2000;.. Strawn et al, 2000). Dessutom finns olika influenser som utövas av neuromodulators på CNS kretsar. Det har föreslagits att 5-HT och octopaminergic nervceller kan fungera som "vinna-setters" i att ändra produktionen av neuronala kretsar (Ma et al, 1992;. Schneider et al, 1996;. Hörner et al, 1997;. Edwards et al., 2002). Mycket arbete återstår innan vi kan fullt ut förstå effekterna av neuromodulators på enskilda målceller. Med tanke på att olika neuromodulators kan fungera i samklang med varandra, är analys av deras blandad verksamhet ett område för framtida forskning (Djokaj et al., 2001). Dessutom har få studier, särskilt i ryggradsdjur, adress effekter neuromodulators på hela vägar som kan reglera ett specifikt beteende. I denna sensoriska-CNS-motorenhet förberedelse man kan undersöka påverkan av både sinnesintryck och neuromodulators på aktiviteten av motoriska nervceller (Kennedy et al., 1969).

Eftersom det har postulerade att 5-HT spelar en roll i regleringen av beteendemässiga tillstånd av kräftor, humrar och krabbor (Livingstone et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000) har flera försök gjorts för att bestämma dess koncentration i VNC, den hemolymph och i isolerade ganglier av hummer (Livingstone et al, 1980;. Harris-Warrick och Kravitz 1984;. Fadool et al, 1988). Däremot har det varit stor variation i det inspelade mätningar, utgör hinder specifika dos-respons-relationer som skulle kunna förklara beteendemässiga handlingar.

En kräftor med klorna hålls på en upphöjd position och med svansen tucked under dess buk har tänkt att ställa ut en dominera kroppsställning (Livingstone et al., 1980). Tillståndet för buken flexion i kräftor verkar inte vara den kroppshållning som dominerande kräftor, inom ett par, utställning under sociala interaktioner eller samtidigt behålla en dominerande hierarkisk status (Listerman et al., 2000). Undergiven kräftor kommer även att stoppa deras magar i sig själva som de retirera från en motståndare. En sådan svans tucking ses också som ett försvar kroppshållning (Listerman et al., 2000). Dessa beteenden har varit lätt observerats i fält och i laboratoriemiljö (Bovbjerg, 1953, 1956, Bruski och Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). Intressant, noterade beteendemässiga ställningar i hummer (Livingstone et al., 1980) återförs till 5-HT och oktopamin injektioner i den australiensiska kräftor, Cherax destructor (McRae, 1996). Möjligen skulle helt olika reaktioner observeras i den ytliga flexor beredning i den australiska kräftor. Dessutom, eftersom dominans i allmänhet storlek relaterad bland kräftor, skulle man förvänta sig en mycket plast respons system för snabbt förändrade sociala förhållanden (Strawn et al., 2000). Den plasticitet i lyhördhet för neuromodulators i ryggradslösa djur är ett öppet område utredning.

Wyttenbach, Johnson och Hoy (1999) har tagit fram digitala medier och ett laboratorium handbok för olika kräftor experimenterande och samma muskel som presenteras i denna rapport utöver andra kräftor förberedelser. Detta är en utmärkt resurs för eleven övningar.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Med stöd av University of Kentucky, Institutionen för biologi, Office studierektor och College of Arts & Sciences.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. Bouin’s fixative solution was used directly and methylene blue is made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139).
  4. Sylgard-bottomed glass dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Model 3000 AC/DC amplifier for intracellular as well as extracellular recordings can be used.
  8. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  9. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA). The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. Intracellular electrodes were filled with 3 M KCl.
  10. A suction electrode is used to record extracellular signals.
  11. Faraday cage.
  12. High Intensity Illuminator (light source).
  13. Micromanipulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Differential dye coupling reveals lateral giant escape circuit in crayfish. J. Comp. Neurol. 466, 1-13 (2003).
  2. Arellano, R. O., Rivera, A., Ramón, F. Protein phosphorylation and hydrogen ions modulate calcium-induced closure of gap junction channels. Biophys. J. 57, 363-367 (1990).
  3. Atwood, H. L. γ -aminobutyric acid and crab muscle fibres. Experientia (Basel). 20, 161-163 (1964).
  4. Atwood, H. L. Variation in physiological properties of crustacean motor synapses. Nature. 215, 57-58 (1967).
  5. Atwood, H. L. Peripheral inhibition in crustacean muscle. Experimentia. 24, 753-763 (1968).
  6. Atwood, H. L. An attempt to account for the diversity of crustacean muscles. Am. Zool. 13, 357-378 (1973).
  7. Atwood, H. L. Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems. Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).
  8. Atwood, H. L. Synapses and neurotransmitters. The Biology of Crustacea. Sandeman, D. C., Atwood, H. L. 3, Academic Press, Inc. New York. 105-150 (1982).
  9. Atwood, H. L. Parallel 'phasic' and 'tonic' motor systems in the crayfish abdomen. J. Exp. Biol. 211, 2193-2195 (2008).
  10. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Functional and structural parallels in crustaceans and Drosophila neuromuscular systems. Am. Zool. 35 (6), 556-565 (1995).
  11. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Assessing ultrastructure of crustacean and insect neuromuscular junctions. J. Neurosci. Meth. 69, 51-58 (1996).
  12. Atwood, H. L., Cooper, R. L. Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions. Invertebrate Neurosci. 1, 291-307 (1996).
  13. Atwood, H. L., Parnas, I. Recording from the crayfish abdominal extensor muscle preparation with microelectrodes. In: Experiments in physiology and biochemistry. Kerkut, G. A. , Academic. London. 307-330 (1968).
  14. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila larvae. Comparative Biochemistry and Physiology A. 140, 363-376 (2005).
  15. Bernstein, J. Untersuchungen zur Thermodynamik der bioelektrischen Ströme. Pflüger Arch. ges. Physiol. 9, 521-562 (1902).
  16. Bernstein, J. Elektrobiologie. , Viewag. Braunschweig. 215 (1912).
  17. Bierbower, S. M. Environmental effects on behavior and physiology in crayfish. , Department of Biology, University of Kentucky. (2010).
  18. Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The effects of acute carbon dioxide on behavior and physiology in Procambarus clarkii. J. Exp. Zool. , In press (2010).
  19. Boistel, J., Fatt, P. Membrane permeability change during inhibitory transmitter action in crustacean muscle. J. Physiol. (Lond.). 144, 176-191 (1958).
  20. Bovbjerg, R. V. Dominance order in the crayfish Orconectes 6irilis (Hagen). Physiol. Zool. 26, 173-178 (1953).
  21. Bovbjerg, R. V. Some factors affecting aggressive behavior in crayfish. Physiol. Zool. 29, 127-136 (1956).
  22. Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle. J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).
  23. Bruski, C. A., Dunham, D. W. The importance of vision in agonistic communication of the crayfish Orconectes rusticus, I. an analysis of bout dynamics. Behaviour. 63, 83-107 (1987).
  24. Burke, W., Ginsborg, B. L. The electrical properties of the slow muscle fibre membrane. J. Physiol. 132, 586-598 (1956).
  25. Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595 (2009).
  26. Cooper, R. L., Warren, W. M., Ashby, H. E. Activity of phasic motor neurons partially transforms the neuronal and muscle phenotype to a tonic-like state. Muscle & Nerve. 21, 921-931 (1998).
  27. Djokaj, S., Cooper, R. L., Rathmayer, W. Effects of octopamine, serotonin, and cocktails of the two modulators on synaptic transmission at crustacean neuromuscular junctions. J. Comp. Physiol. A. 187 (2), 145-154 (2001).
  28. Dudel, J., Kuffler, S. W. Mechanism of facilitation at the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (Lond.). 155, 540-542 (1961).
  29. Eckert, R. O. Reflex relationships of the abdominal stretch receptors of the crayfish. J. Cell. Comp. Physiol. 57, 149-162 (1961).
  30. Edwards, D. H., Yeh, S. R., Musolf, B. E., Antonsen, B. L., Krasne, F. B. Metamodulation of the crayfish escape circuit. Brain Behav Evol. 60 (6), 360-369 (2002).
  31. Fadool, D. A., Cobb, S. J., Kass-Simon, G., Brown, P. R. Liquid chromatographic procedures for the analysis of compounds in the serotonergic and octopamine pathways of lobster hemolymph. J. Chromatogr. 452, 491-501 (1988).
  32. Fatt, P., Katz, B. The electrical properties of crustacean muscle fibers. J. Physiol. 120, 171-204 (1953).
  33. Fields, H. L., Kennedy, D. Functional role of muscle receptor organs in crayfish. Nature. 206 (990), 1235-1237 (1965).
  34. Fisher, L., Florey, E. Modulation of synaptic transmission and excitation-contraction coupling in the opener muscle of the crayfish, Astacus leptodactylus, by 5-hydroxytryptamine and octopamine. J. Exp. Biol.. 102, 187-198 (1983).
  35. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Anzeiger Akad. 18, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 275 (1881).
  36. Freud, S. Über den Bau der Nervenfasern und Nervenzellen beim Flußkrebs. Sitzungsber. Akad. 85, Math.-Naturwiss. Kl. Wiss. Wien. 9-46 (1881).
  37. Goldman, D. E. Potential, impedance, and rectification in membranes. J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943).
  38. Griffis, B., Bonner, P., Cooper, R. L. Sensitivity of transformed (phasic to tonic) motor neurons to the neuromodulator 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology A. 127, 495-504 (2000).
  39. Grundfest, H., Reuben, J. P. Neuromuscular synaptic activity in lobster. Nervous Inhibition. Florey, E. , Pergamon Press. Oxford. 92-104 (1961).
  40. Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Cellular mechanisms for modulation of posture by octopamine and serotonin in the lobster. J. Neurosci. 4, 1976-1993 (1984).
  41. Hagiwara, S., Chichibu, S., Naka, K. I. The effects of various ions on resting and spike potentials of barnacle muscle fibers. J. Gen. Physiol. 48, 163-179 (1964).
  42. Hille, B. Ionic Channels of Excitable Membranes. , 2nd, Sinauer Assoc. Sunderland, Mass. (1992).
  43. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. (Lond.). 117, 500-544 (1952).
  44. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F., Katz, B. Measurement of current-voltage relations in the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. (Lond.). 116, 424-448 (1952).
  45. Hodgkin, A. L., Katz, B. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid. J. Physiol. (Lond.). 108, 37-77 (1949).
  46. Hodgkin, A. L., Rushton, W. A. H. The electrical constants of a crustacean nerve fibre. Proc. Roy. Soc. 133, 444-479 (1946).
  47. Hörner, M., Weiger, W. A., Edwards, D. H., Kravitz, E. A. Excitation of identified serotonergic neurons by escape command neurons in lobsters. J. Exp. Biol. 200, 2017-2033 (1997).
  48. Huxley, T. H. The crayfish. , C. Kegan Paul and Co. London. (1880).
  49. Johnson, G. E. Giant nerve fibers in crustaceans with special reference to Cambaus and Palaemonetes. J. Comp. Neurol. 36, 323-373 (1924).
  50. Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramon, F. Interaction of anaesthetics with electrical synapses. Nature (Lond.). 286, 498-500 (1980).
  51. Katz, B., Miledi, R. The role of calcium in neuromuscular facilitation. J. Physiol. (Lond.). 195, 481-492 (1968).
  52. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of abdominal flexor muscles in the crayfish: the twitch system. J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).
  53. Kennedy, D., Takeda, K. Reflex control of the abdominal flexor in the crayfish: the tonic system. J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).
  54. Kennedy, D., Selverston, A. I., Remler, M. P. Analysis of restricted neural networks. Science. 164, 1488-1496 (1969).
  55. Krasne, F. B. Excitation and habituation of the crayfish escape reflex: the depolarizing response in lateral giant fibres of the isolated abdomen. J. Exp. Biol. 50, 29-46 (1969).
  56. Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate measures in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comp. Biochem. Physiol A. 127, 55-70 (2000).
  57. Listerman, L., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Measures of heart rate during social interactions in crayfish and effects of 5-HT. Comp. Biochem. Physiol A. 125, 251-264 (2000).
  58. Livingstone, M. S., Harris-Warrick, R. M., Kravitz, E. A. Serotonin and octopamine produce opposite postures in lobsters. Science. 208, 76-79 (1980).
  59. Lnenicka, G. A. Seasonal differences in motor terminals. Comp. Biochem. Physiol A. 104, 423-429 (1993).
  60. Lnenicka, G. A., Zhao, Y. Seasonal differences in the physiology and morphology of crayfish motor terminals. J. Neurobiol. 22, 561-569 (1993).
  61. Ma, P. M., Beltz, B. S., Kravitz, E. A. Serotonin containing neurons in lobsters: their role as 'gainsetters' in postural control mechanisms. J. Neurophysiol. 68, 36-54 (1992).
  62. Malmivuo, J., Plonsey, R. Bioelectromagnetism-Principles and Applications of Bioelectric and Biomagnetic Fields. , Oxford University Press. New York. (1995).
  63. McRae, T. On the postural effects induced in female Cherax destructor (Clark) by serotonin and octopamine. Freshwater Crayfish. 11, 293-298 (1996).
  64. Mercier, A. J., Atwood, H. L. Long-term adaptation of a phasic extensor motoneurone in crayfish. J. Exp. Biol. 145, 9-22 (1989).
  65. Monaghan, D. T., Bridges, R. J., Cotman, C. W. The excitatory amino acid receptors: their classes, pharmacology, and distinct properties in the function of the central nervous system. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 365-402 (1989).
  66. Moody, W. Gradual increase in the electrical excitability of crayfish slow muscle fibers produced by anoxia or uncouplers of oxidative phosphorylation. J. Comp. Physiol. 125, 327-334 (1978).
  67. Nernst, W. H. Zur Kinetik der Lösung befindlichen Körper: Theorie der Diffusion. Z. Phys. Chem. 3, 613-637 Forthcoming.
  68. Nernst, W. H. Die elektromotorische Wirksamkeit der Ionen. Z. Phys. Chem. 4, 129-181 Forthcoming.
  69. Pilgrim, R. L. C., Wiersma, C. A. G. Observations on the skeleton and somatic musculature of the abdomen and thorax of Procambarus clarkii (Girard), with notes on the thorax of Panulirus interruptus (Randall) and Astacus. J. Morphol. 113, 453-587 (1963).
  70. Robinson, M. M., Martin, J. M., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2325 (2011).
  71. Schneider, H., Budhiraja, P., Walter, I., Beltz, B. S., Peckol, E., Kravitz, E. A. Developmental expression of the octopamine phenotype in lobsters. J. Comp. Neurol. 371, 3-14 (1996).
  72. Skou, J. C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 439-446 (1989).
  73. Skou, J. C. The identification of the sodium-pump as the membrane-bound Na+/K+-ATPase: a commentary on 'The Influence of Some Cations on an Adenosine Triphosphatase from Peripheral Nerves. Biochim. Biophys. Acta. 1000, 435-438 (1989).
  74. Skou, J. C. Enzymatic basis for active transport of Na+ and K+ across cell membrane. Physiol. Rev. 45, 596-617 (1965).
  75. Skou, J. C. Nobel Lecture. The identification of the sodium pump. Biosci Rep. 18, 155-169 (1998).
  76. Sneddon, L. U., Taylor, A. C., Huntingford, F. A., Watson, D. G. Agonistic behavior and biogenic amines in shore crabs Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 203, 537-545 (2000).
  77. Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen. J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2000).
  78. Southard, R. C., Haggard, J., Crider, M. E., Whiteheart, S. W., Cooper, R. L. Influence of serotonin on the kinetics of vesicular release. Brain Res. 871, 16-28 (2000).
  79. Stefani, E., Steinbach, A. B. Resting potential and electrical properties of frog slow muscle fibers. Effect of different external solutions. J. Physiol. 203, 383-401 (1969).
  80. Strawn, J. R., Neckameyer, W. S., Cooper, R. L. The effects of 5-HT on sensory neurons, CNS command, and neuromuscular junctions of the crayfish abdominal superficial flexor. Comp. Biochem. Physiol B. 127, 533-550 (2000).
  81. Takeuchi, A., Takeuchi, N. Anion permeability of the inhibitory post-synaptic membrane of the crayfish neuromuscular junction. J. Physiol. (London). 191, 575-590 (1967).
  82. Tsunoyama, T., Gojobori, S. Evolution of Nicotinic Acetylcholine receptor Subunits. Mol. Biol. Evol. 15 (5), 518-527 (1998).
  83. Van Harreveld, A., Mendelson, M. Glutamate-induced contractions in crustacean muscle. J. Cell Comp. Physiol. 54, 85-94 (1959).
  84. Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustaceans. Proc. Soc Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).
  85. Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. The Triple Innervation of the Crayfish Muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22 (11), 667 (1936).
  86. Vélez, S. J., Wayman, R. J. Synaptic connectivity in a crayfish neuromuscular system. I. Gradient of innervations and synaptic strength. J. Neurophysiol. 41, 75-84 (1978).
  87. Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. J. Gen. Physiol. 45, 267-308 (1961).
  88. Watkins, J. C. L-Glutamate as a central neurotransmitter: Looking back. Biochemical Society Transactions. 28, 297-310 (2000).
  89. Wiersma, C. A. G. The neuromuscular system. The Physiology of Crustacea. Waterman, T. H. II, Academic Press. New York. (1961).
  90. Wiersma, C. A. G. Reflexes and the central nervous system. The physiology of Crustacea. II, Academic Press. New York. 241-279 (1961).
  91. Wine, J. J., Mittenthal, J. E., Kennedy, D. The structure of tonic flexor motoneurons in crayfish abdominal ganglia. J. Comp. Physiol. 93, 315-335 (1974).
  92. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle. J. Vis. Exp. (45), e2319 (2010).
  93. Wyttenbach, R. A., Johnson, B. R., Hoy, R. R. Crawdad. A CD-ROM Lab manual for neurophysiology. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (1999).
  94. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. 3. Electrical junctions and dendrite spikes in fast flexor motoneurons. J. Neurophysiol. 35, 638-651 (1972).
  95. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. II. Physiological mechanisms underlying behavioral habituation. J. Neurophysiol. 35 (5), 621-637 (1972).
  96. Zucker, R. S. Crayfish escape behavior and central synapses. I. Neural circuit exciting lateral giant fiber. J. Neurophysiol. 35 (5), 599-620 (1972).

Tags

Neurovetenskap ryggradslösa djur kräftor neurofysiologi muskler anatomi elektrofysiologi
Membrane Potentials, Synaptic svar, neurala kretsar, Neuromodulering och Muscle histologi Använda Kräftor: Student Laborationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baierlein, B., Thurow, A. L.,… More

Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322, doi:10.3791/2322 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter