Summary
В этой статье описываются процедуры подготовки срезах гиппокампа крыс и трансгенных мышей для изучения синаптических изменений, связанных со старением мозга и возрастных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.
Abstract
Гиппокампа грызунов подготовки срез, пожалуй, наиболее широко используемым инструментом для исследования млекопитающих синаптической функции и пластичности. Гиппокампе может быть извлечен быстро и легко от крыс и мышей и ломтиками остаются жизнеспособными в течение нескольких часов в кислородом искусственной спинномозговой жидкости. Кроме того, основные методы electrophysisologic легки в применении к исследованию синаптической функции в срезах гиппокампа и представили некоторые из лучших биомаркеров для когнитивных нарушений. Гиппокампа ломтик особенно популярен для изучения механизмов синаптической пластичности, участвующих в процессах обучения и памяти. Изменения в индукции длительной потенциации и депрессии (LTP и LTD) синаптической эффективности в срезах гиппокампа (или их отсутствие) часто используется для описания неврологического фенотип когнитивно-нарушенной животных и / или оценить механизм действия ноотропных соединений. В этой статье описываются процедуры мы используем для подготовки срезах гиппокампа крыс и трансгенных мышей для изучения синаптические изменения, связанные с старение мозга и болезнь Альцгеймера (БА) 1-3. Использование старых крыс и мышей AD модель может представить уникальный набор проблем для исследователей привыкли использовать младший крыс и / или мышей в своих исследованиях. Возраст крысы толще черепа и жесткой соединительной ткани, чем молодые крысы и мыши, которые могут задержать извлечения головного мозга и / или рассечение и, следовательно, отрицать или преувеличивать реальные возрастные различия в синаптической функции и пластичности. Старение и амилоида патология может также усугубить повреждение гиппокампа, полученных во время вскрытия процедуру, снова усложняет любые выводы из физиологической оценки. Здесь мы рассмотрим шаги, предпринятые во время вскрытия процедуру, чтобы минимизировать эти проблемы. Примеры синаптических ответов, приобретенных в "здоровой" и "нездоровый" ломтики от крыс и мышей предоставляются, а также представительства синаптической пластичности экспериментов. Возможное влияние других методологических факторов на синаптическую функцию в этих моделях на животных (например, записи компонентов решения, стимулирование параметров) также обсуждаются. Хотя основное внимание в этой статье, на использование старых крыс и трансгенных мышей, новичкам, чтобы нарезать физиологии должны найти достаточно подробно здесь, чтобы начать на своих собственных исследований, с использованием различных грызунов моделей.
Protocol
1. Подготовка Ледяной Кислородсодержащие Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF)
- Подготовка 2 л "Са 2 +-свободные" ACSF. В 2L колбу, добавить около 1,5 л стерильной или дважды дистиллированной H 2 O, и начинают энергично помешивая на мешалки. Добавьте следующие компоненты ACSF (в мм): 124 NaCl, 2 KCl, 1,25 KH 2 PO 4, 2 4 MgSO, 26 NaHCO 3, и 10 декстрозы (см. Таблицу 1). Довести до объема 2 л дистиллированной H 2 O.
- Использование барботер аквариума и трубка прилагается к 95% O 2 / 5% СО 2 баллон с воздухом, кислородом ACSF энергично в течение примерно 20-30 мин. Проверьте рН, а при необходимости, корректировать до 7,4 использованием NaOH или HCl.
- Залить 750 мл кислорода Ca 2 +-свободный ACSF в отдельную колбу, крышка открытия с парафильмом, и трансфер в ultrafreezer (-80 ° С) в течение 20-30 мин. Этот носитель будет использоваться для вскрытия мозга и острой срезах гиппокампа *. Добавьте 2 мМ CaCl 2, чтобы оставшиеся 1,25 л Объем ACSF #, хорошо размешать и возобновить оксигенации с 95% O 2 / 5% СО 2. Этот носитель будет использоваться для хранения мозга ломтиками после вскрытия, так и для перфузии ломтиками во время электрофизиологических записей.
* Ледяной Са 2 + свободные средства массовой информации используется для замедления обмена веществ и свести к минимуму Са 2 +-зависимые эксайтотоксичность во время вскрытия.
# Изменения в Са 2 + регуляции в процессе старения и AD может оказать существенное влияние на индукции Са 2 +-зависимые синаптической пластичности 4-9. Противоречивые сообщения о возрастных различий в ООО может быть отчасти связано с использованием различных ACSF Ca 2 +: Mg 2 + отношения во время среза записей (см. 2,4,10). Важность Са 2 + регулирование и ACSF Са 2 + уровня в старении исследований проблем более подробно в разделе Обсуждение. - В то время как Са 2 +-свободный ACSF замерзает, подготовить проведение камеру для поддержания мозга ломтиками до и во время электрофизиологические записи *. Мы используем пользовательский макрос-холдинг камеры, которая содержит четыре отдельных microchambers (см. Рисунок 2). Macrochamber наполняется стерильной, кислородом H 2 O и microchambers существу островов, которые выступают над поверхностью воды. В рамках каждого микрокамере, ломтики отдых на сетчатой вставкой в мелкий бассейн кислородом ACSF. Ломтики не полностью погружен, но сидеть за интерфейс с увлажненным воздухом. Изолированный нагревательный элемент в macrochamber позволяет регулирования температуры.
* Несколько разновидностей холдинг камеры и имеющиеся в продаже (например, Warner Инструменты делает погружения стиле "Pre палаты # BSC-PC) и должны быть пригодны для использования в процессе старения и трансгенных исследований срез мыши. В крайнем случае, ломтики может поддерживаться в течение несколько часов в маленькой чашке Петри заполнены ACSF. Сделайте небольшое отверстие в крышке Петри для трубки подачи кислорода. Будьте осторожны, чтобы пузырьки кислорода физически не агитировать ломтиков. Ломтики получит достаточное количество кислорода, если доставка трубку поднял только над поверхностью ACSF (газ дисперсия должна вызвать углубление в поверхности жидкости).
2. Удаление мозга и гиппокампа Dissection в возрасте (> 20-месячных-крысы)
- Подготовка * рассечение области, рядом с большим радиатором (см. рисунок 1 и таблицу 2). Нанесите небольшое гильотины животное в раковине и выложить хирургические инструменты и материалы для удаления мозга и гиппокампа рассечение в том числе сложенных бумажных полотенец, # 11 лезвие скальпеля, beebee ножницы, кости rongeurs, "Гиппокамп инструмент" (специализированное двойной шпатель из Изобразительное Хирургические инструменты), небольшие хирургические ножницы, тонкая двусторонняя шпателем, пластиковой пипетки Пастера, 110 мм в диаметре Ватман Фильтровальная бумага крышкой 100 мм стекло чашки Петри со льдом, и пластмассовой ложкой. Также имейте пластиковый пакет рядом по утилизации туш.
* Мозг добыча должна быть завершена как можно быстрее, так что это хорошая идея, чтобы мысленно "пройти через" порядок и заложить свои инструменты в порядке использования. - Удалить Са 2 +-свободный ACSF из морозильной камеры. СМИ должны быть частично, не полностью, заморожены. Налейте около 50 мл ACSF в стеклянный стакан, залить парафильмом, и место рядом с рассечение области. Этот носитель будет использоваться для кратковременно хранить мозг, когда он будет удален. Остальные Са 2 +-свободные средства массовой информации будут использоваться для заполнения водохранилища в Vibratome для среза подготовки. Этот носитель может быть reoxygenated, или просто покрыты парафильмом и помещены в холодильник при температуре 4 ° C.
- Усыпить крысу использованием методов, утвержденных Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC). Наши животные помещаются в небольшой камере оргстекла, который постепенно наполняется на 100% СО 2. Потеря сознания обычно происходит в течение пяти минут и подтверждено отсутствие рефлекторной деятельностиСледующие ног крайнем случае.
- Обезглавьте крысы сразу ростральнее первого шейного позвонка и поместить голову на сложенные бумажные полотенца. Использование # 11 скальпелем, быстро сделать разрез в середине головы, начиная возле носовой кости и работает каудально к затылочной кости. Не забудьте вырезать полностью через кожные мышцы, полностью подвергая Швы на спинной поверхности черепа.
- Избавьтесь от черепа пластинами с beebee ножницами. У молодых крыс и мышей, черепа могут быть быстро удалены с использованием костей rongeurs в одиночку. Тем не менее, в возрасте крыс толще черепа, чем у молодых взрослых крыс и мышей, которые могут сделать эту процедуру сложной. Мы обнаружили, что, проходящем через череп значительно облегчает удаление кости с rongeurs, уменьшает повреждения мозга, а также экономит драгоценные секунды. С головы крысы твердо на столешницы, место передний край нижнего чисто из beebee ножницы в превосходной область затылочного отверстия в задней части черепа. Хранение ниже чистой категорически против внутренней поверхности черепа (и от мозга) *, прорезать затылочной пластине, а затем вдоль средней линии шва теменной пластин. Приступить рострально пока не прорезать фронтальной пластины черепа.
* Крайне важно, чтобы давление направлена от мозга, чтобы предотвратить случайное измерение. - Отдельные затылочной, теменной и височной пластин черепа мозг. Продолжайте удерживать голову твердо столешницы для стабильности и рычаги и слайд нижней челюсти rongeurs под левой теменной пластины поддержания давления на внутренней поверхности черепа. Затем сожмите челюсти rongeurs-н-ролла вместе запястья вверх и к себе, чтобы вытащить теменной и затылочной пластины от головного мозга. Это должно выставить большую часть верхней поверхности левого полушария. Если необходимо, используйте rongeurs снять левой лобной пластины, а также. Повторите эту процедуру для другого полушария. После пластин смещены, быстро проверить на любой вопрос, оболочки, которые могут быть прикреплены к временной пластин и растягивается по всей поверхности мозга. Осторожно потяните этих неприятностей с rongeurs или срезать ножницами *. Теперь, слайд верхней челюсти rongeurs между мозгом и правой височной пластины, снова поддержания давления в сторону черепа и от мозга. Сожмите и крутить временной пластины от головного мозга. Вы должны услышать / почувствовать "кризис", как вы делаете это. Повторите для левой стороны.
* Длительность может быть трудно обнаружить, особенно если животное было transcardially озарен ACSF. Однако, если длительность не удаляются, они будут срез мозга (и, скорее всего гиппокамп), как бритва, когда временная пластины удаляются. Ножницы оболочки прочь рядом временных пластин позволит свести к минимуму вероятность колоть мозга. - Извлечение мозга *. Быстро удалить парафильмом от Са 2 +-свободный ACSF "мокрый". Теперь слайд широкая голова шпателем из гиппокампа инструмент между вентральной поверхности мозга и нижней пластин черепа, пока она полностью находится под мозгом. Перемещение лопаточкой сбоку из стороны в сторону, а затем вперед и назад несколько раз, чтобы разорвать нетронутыми черепных нервов. Теперь совок мозга с гиппокампа инструмент и погрузиться в Са 2 +-свободный ACSF и накрыть парафильмом. Пусть мозг охладить в течение примерно одной минуты. Это подходящее время, чтобы счистить гильотины, распоряжаться туши, и реорганизовать рассечение области.
* Для шаги 2.3-2.7, скорость имеет существенное значение. Мы стараемся для выполнения этой процедуры (от обезглавливания мозга погружение в ACSF) в 30-35 сек. По нашему опыту, удаление занимает больше времени, чем за минуту по всей видимости, отрицательно влияют на здоровье срез гиппокампа, особенно для старых крыс. Использование этих процедур, мы не обнаружили различий в добыче раз между престарелых и молодых крыс для наших исследований. - Извлечение гиппокампе. Место Whatman фильтровальной бумаги на крышке ледяной чашку Петри и смочите бумагу с ACSF использованием пластиковой пипетки передачи. Получить мозг от ACSF помощью ложки и место на смоченной ватмане. Использование лезвие скальпеля, удалить мозжечка и примерно четверть ростральной лобных долей. Выполнить лезвие скальпеля через внутриполушарные трещина полностью отделить два полушария. Место одного полушария обратно в ACSF слякотной и "стоять" другие на стадии вскрытия, что корональные плоскости лобной доли направлена вниз. Вы должны четко уметь отличать ствола мозга и среднего мозга (которые, белая) от вышележащих коры (что розовый / серовато). Найдите высших и низших холмов на средний мозг, они будут выглядеть как два белых "ручки", и будет на "верху" мозг в этой ориентации. Использование хирургических ножниц, мягко держать средний мозг на месте и слайд весом шпателем в щели будетмежду холмов и неокортекса. Очень нежно, продолжают скользить вниз шпатель и вытащить ствол мозга / мозга / таламус от выявления внутри бокового желудочка и медиальной поверхности гиппокампа. Используйте острый край лопаточку, чтобы плавно разорвать свода; белый расслоение расположен на передней / спинной части гиппокампа. С ножницами, осторожно продолжать тянуть мозга / мозга / таламус прочь без полного разрыва его от остальной части мозга. Коры с гиппокамп должен теперь лежать свободно обратно из ствола мозга *. Затем очередь рассекает этапе, с тем, что вы смотрите на медиальной гиппокампе и коре вышележащих как будто это было сагиттальном сечении (минус таламус). Теперь вы должны увидеть белые волокна бахромки, которые формируют мелкие гиперболы в нижней части гиппокампа в этой плоскости. Использование пластиковой пипетки передачи, мягко шприц некоторые ACSF в зазор под бахромки, чтобы помочь отдельным гиппокамп из коры головного мозга. Аккуратно вставьте шпателем в этот пробел, так, что длинная сторона шпателя идет параллельно с длинной оси гиппокампа. Как только шпателем полностью находится под гиппокампе, удерживая ствол мозга / мозга / таламус крепко ножницы-н-ролл шпателем от тела, чтобы физически разделить гиппокампа от остальной части мозга. Как только гиппокамп свободно, осторожно обрежьте все оставшиеся мозга, кровеносных сосудов и белого вещества. Совок небольшое количество ACSF слякотной на дальней стороне рассекает сцену. Аккуратно позиции гиппокампе рядом с слякоти и потушить с несколько миллилитров ACSF использованием пластиковой пипетки передачи. Затем удалите другом полушарии и повторить рассечение.
* Вам может понадобиться ножницы, чтобы отрезать от дополнительных соединительных тканей, белое вещество, или сосудистая сеть, которая предотвращает отделение коры от ствола мозга. Точки вашего ножницами будет очень близко к гиппокамп, так что не забудьте поставить очень точный ножницы (острые ножницы должны).
3. Удаление мозга и гиппокампа Dissection в возрасте трансгенных мышей
- Эвтаназии и обезглавить мыши и сделать срединный разрез на коже головы, как описано в разделе 2.3. Мыши имеют гораздо тоньше, чем у крыс, черепах что значительно упрощает извлечение мозга. Резка через череп ножницами, следовательно, ненужными. Используйте кости rongeurs с меньшими челюстями (табл. 2) вырваться затылочной, теменной и височной пластин черепа. Как и крысы, помните об использовании контролируемых движений и твердо потяните нижнюю челюсть rongeurs на внутренней поверхности черепа и от мозга, как вы удалите пластин. Как только пластины удалить, используйте узкий конец гиппокампа инструмент разорвать оставшихся черепных нервов и совок мозга в ледяную Са 2 +-свободный ACSF.
- Подготовка мозга ломтиками. Из-за меньшего размера мозга мыши, рассекая гиппокампе может быть немного сложнее (хотя, конечно выполнимо), чем при использовании крыс. Таким образом, чтобы упростить процесс, мы удаляем мозжечка и ростральной советы лобных долей, но не препарировать из гиппокампе. Вместо полушарий мозга физически разделенных лезвие скальпеля и оставил нетронутыми для секционирования Vibratome (см. раздел 4 ниже).
4. Раздел мозговой ткани на дольки использованием вибрационный Микротом (Vibratome) и трансфер в холдинг палаты *
- Заполните резервуар Vibratome ледяной Са 2 +-ACSF свободный, такой, что этап резки и лезвия они полностью погружены. Для изготовления крысы ломтиками, отрезать ростральной и хвостовой концы каждого гиппокамп с лезвие скальпеля. Эти сокращения позволят вам вертикально положение гиппокампе тесно вместе, как две колонки. Это работает лучше всего, если зубчатой извилине гиппокампа каждого есть друг против друга и СА3 регионов ориентированы в одном направлении. Для изготовления мыши ломтиками, вертикально положение каждого полушария в тесном сотрудничестве с лобных долей вниз. Клей мозговой ткани на монтажный блок и трансфер в секционирования этапе Vibratome. Как правило, мы подготовить ~ 400 мкМ разделы для синаптической экспериментов физиологии. Растворитель разделы должны быть подготовлены, если флуоресцентные изображения будут проводиться (например, исследования Са 2 + уровня и переходных процессов). Сбор ломтики с широким горлом пипеткой или кистью # и трансфер в небольшой чашке Петри содержащие ледяной Са 2 +-свободный ACSF.
* Использование Vibratome свести к минимуму ущерб верхней и нижней поверхности среза и, безусловно, рекомендуется исследованиях, требующих анализа клеток близ среза поверхности (например, зажим напряжения и Са 2 + визуализации исследований). Тем не менее, более дешевые альтернативы, и подходит для создания срезы для внеклеточных экспериментов физиологии. Мы использовали небольшой тяжести контролируемые вертолет 2,11 и Chopper McIlwain ткани 12 с хорошим успехом. Для Тхис процедурой гиппокампе размещаются на постановочную и секционные с вертикальными вертолет. Кисть используется для передачи ломтиками (по одному за раз) на небольшое блюдо проведение заполнены ледяной Са 2 +-свободный ACSF. Одна из проблем такого подхода заключается в том, что гиппокампе могут перемещаться между отбивные в результате неравномерного разделов. Кроме того, будьте осторожны, чтобы удалить как можно больше белого вещества, а тем более, что много сосудистую, а возможно, прежде чем измельчать. Этот материал будет прилипать к кисти, лезвие бритвы, или оба, делая срез передачи очень трудным и повышает вероятность растяжения или повреждения тканей.
# При использовании кисти, попробуйте отдохнуть срез длиной стрелки по всей щетиной. Упаковка ломтик вокруг кисти может вызвать излишнюю ткань растяжки. - Передача мозга ломтики с проведением камеру, где они купались в кислородом Са 2 +-содержащих ACSF. Постепенно довести камере температура от 27 ° до 32 ° C (+1 ° каждые пять минут). Разрешить ломтиками для инкубации в течение 1-1,5 ч до электрофизиологических экспериментов.
5. Выявить и запись СА3-CA1 Synaptic Ответы
- Для основных внеклеточных записей в острой ломтиками, электрофизиологии вашей станции нужно будет включить *: запись камеры; перфузии системы; микроскоп с> 4X возможностью увеличения; записи, стимулирующие, и наземные электродов; макро-и микроманипуляторами; жесткие вибростойкий настольные и клетка Фарадея, стимулятор, усилитель и аналого-цифровые (A / D) преобразователя; осциллографа (желательно); и личный компьютер с соответствующим программным обеспечением приобретения.
* Керр Scientific Instruments предлагает фантастический и недорогой электрофизиологии системы (т.е. запись Керр тканей System) для проведения разнообразных базовых экспериментов электрофизиологии срез. Эта система имеет небольшие размеры, портативные стимуляторы и усилителей, и может быть использован на стандартных лабораторных скамейке без необходимости громоздких клетку Фарадея.
Конечно, мозг ломтиками также может быть использован для выполнения многочисленных разработки электрофизиологических и методов визуализации, которые потребуют дополнительного оборудования и материалов. Например, наши главные станции электрофизиологии содержит усилитель с быстрым напряжения и тока-зажим возможности, люминесцентная система освещения, а также цифровой фотоаппарат. Эта станция используется для внеклеточных полевых записей в мозге ломтиками, а также патч-зажим записей и флуоресцентные изображения в срезах и клеточных культур 3,12,13. См. Таблицу 3 для полного списка оборудования и комплектующих. - Использование широким горлом пипетки или маленькой кистью краску, передача одного или нескольких ломтиков для записи камеры * позволяет ему акклиматизироваться в течение 10-15 мин до стимуляции / записи. Для нашего исследования, ломтики погружены в ACSF и отдых на сетку вставляется в RC-22 камеры Warner Instruments (см. Рисунок 3). ACSF является самотечных через регулятор для регулировки расхода, и предварительно нагретого до 32 ° С, встроенный микро-нагревателя до достижения записи камеры. Центральной линии вакуум используется для удаления ASCF.
* Многие разновидности погружных и интерфейс стиле камер записи имеются в продаже. Мы заметили, что ломтики демонстрируют более надежную синаптических ответов в интерфейс камеры (то есть часть сидит на интерфейс с увлажненным воздухом и ACSF) 2,11. Тем не менее, чувствительность, как правило, более стабильны, когда ломтики погружены в ACSF. Наркотиками перфузии также более эффективно погружение камер. - Позиция стимулирования и записи электродов. С стимулятор или стимул изолятора включен, но выходной набранных до 0, должность раздражающего электрода над сектором в регионе слой radiatum Са2 возле СА3 границе (см. рисунок 4). Мы используем витая иридий платина поставлять 50-100 мкс двухфазных импульсов СА3 Шаффер залога (SC) волокон. Использование платиновой проволоки иридия и двухфазных импульсов может помочь минимизировать поляризации электродов. Нижняя записи электрода в СА1 слой radiatum, просто нарушение поверхности среза. Наши записи электрод Ag / AgCl проволоки в ACSF заполненные стеклом микропипетки (совет сопротивления ~ 7 МОм). Включите выход на стимулятор до умеренного уровня (мы установили наш стимул изолятор до ~ 150 мкА) и начать управляющие импульсы и стимулы приобретения деятельности с использованием приобретение программного обеспечения, таких как CLAMPEX от Axon Instruments, Inc Медленно опустите стимулирующих электродов в малом интервалами до стимулом artificact записывается в СА1. Далее, продолжает медленно опустите как стимулирующее и записи электродов в интервалы при приобретении СА1 ответов пока волокна залп (FV) и возбуждающих постсинаптических потенциала (ВПСП) амплитуды достигает максимального уровня (см. рисунок 4B).
- Создание синаптических кривой силы и исследовать синаптической пластичности. Для формирования синаптических кривой силы, доставить стимул импульсы СК при более высокой интенсивности и записывать йэлектронной соответствующей деятельности в СА1. Диапазон и количество интенсивности раздражения уровней, используемых может меняться, но должно быть достаточным для создания сигмоидального кривой, когда заговор против либо FV или ВПСП значений (рис. 5). Ф. В. амплитуда обеспечивает надежную оценку доли пресинаптического волокна активирован, а наклон ВПСП обеспечивает чистый мера моносинаптических СА3-CA1 токов. Построение ВПСП склоне против FV различных уровней интенсивности стимула таким образом, отражает размер ВПСП в число активированных афферентов и обеспечивает отличную оценку СА3-CA1 синаптической силы. Как правило, синаптические уровни силы значительно снижаются в области СА1 пожилых крыс и мышей APP/PS1, относительно молодых крыс и подобранных по возрасту мышей дикого типа см., например, 4,14.
- Фрагменты, которые показывают признаки плохого здоровья (т.е. максимальная амплитуда ВПСП <1 мВ) или повышенная возбудимость (например, появление в 2 и более шипов населения) во время синаптической кривой силы исключены из статистического анализа (см. Рисунок 4C). Мы обнаружили, что эти кусочки редко выставку стабильные ответы через 60 мин период и / или показать, сильно варьирует ответы следующие индукции синаптической пластичности. Он заслуживает, отметив, что "нездоровый ломтики" составляют лишь около 10-20% всех ломтиков переданы записи камеры. Более того, по нашему опыту, частота выявления нездоровых срез очень схожи возраста, вида и генотипа.
- Вызвать долгосрочного потенцирования (LTP) или длительная депрессия (LTD) в ломтиками. LTP и LTD длятся увеличивается (LTP) и уменьшается (ООО) в синаптической функции в ответ на различные модели синаптической активации. Оба процесса широко распространенному мнению, отражают критические механизмы обучения и memory15 и содержат полезные критерии оценки для исследования клеточных механизмов нейронной дисфункции и / или для оценки фармакологических стратегий для смягчения дефицита памяти и нейродегенеративных 16.
Для синаптической пластичности экспериментов, сброс интенсивности раздражения для всех ломтиков до 1 мВ * и начать базовой стимуляции на частоте 0,033 Гц. Значения ВПСП наклон должен быть стабильным в течение по крайней мере 20 минут до индукции LTP или LTD. Внимательно следить за ВПСП в это время и сброса интенсивности раздражения, если склон колеблется более чем на 10% и начать новые исследования. Вызвать LTP использованием одной секунды поезд 100 Гц стимуляции или несколько коротких очередей (~ 10 импульсов) 100 Гц стимуляции, каждые 200 мс. Для индукции LTD, доставить 900 импульсов стимула в размере 1 Гц. После индукции LTP или ООО, собирать синаптических ответов на дополнительные 60 минут или больше. ВПСП склоне значений, полученных до и через 60 мин после высоких / низких частот стимуляции сравниваются для определения наличия или LTP LTD.
Возраст крыс и мышей APP/PS1 как правило, показывают недостаточный LTP и расширенные LTD (см. Рисунок 5), и эти изменения были предложены внести свой вклад в нарушение познания в этих моделях на животных 6,16. Однако, в отличие APP/PS1 мышей, изменения в LTP / LTD в возрасте крыс варьируется лабораториях. Возраст крысы обычно имеют аналогичные уровни LTP по сравнению с взрослыми в ответ на "интенсивной" (то есть 100 Гц) стимуляции, но показать дефицита, когда мягкие параметры стимуляции используются (т.е. ниже, стимул или меньше частоты импульсов стимула) (см. обзор 4,6, 16). Кроме того, некоторые лаборатории, в том числе наши, наблюдается повышенная восприимчивость к индукции LTD в старых крыс 2,17-19, в то время как другие группы не было выявлено различий или сниженной чувствительностью в их возрасте животных. Как уже говорилось кратко ниже (см. Обсуждение), тонкие, но очень важных различий в протоколе исследования могут объяснить эти расхождения.
* Интенсивность стимуляции и амплитуду ВПСП могут влиять LTP индукции и может быть важной причиной противоречивые результаты в литературе. Это будет более подробно рассмотрен в разделе Обсуждение.
6. Представитель Результаты
Наша работа, и работа с другими группами, предполагает, что изменения астроцитов основе воспалительных сигнализации может вызвать и / или ускорить неврологических дисфункций в процессе старения и AD 13,20,21. В последнее время мы использовали синаптической силы, LTP и LTD в качестве конечной точки меры по расследованию эффективности и механизмов действия ряд новых противовоспалительных реагентов в середине возрасте APP/PS1 мышей (см. 22 для описания этой модели) и в возрасте Фишер 344 крыс. Результаты приведены ниже были получены с использованием протоколов, описанных в этой статье.
Один из романа противовоспалительное адено-ассоциированные вирусные (AAV) реагентов разработан нашей лаборатории было показано в экспериментальных исследованиях значительно увеличить синаптической силы (р <0,05) и не допустить дефицита LTP (р <0,05) среднего возраста (16 -месячная) APP/PS1 мышей (п = 4-6 ломтика на курс лечения состояние). Представитель синаптических кривые силы и LTP эксперименты с двух разных ломтиками, сбected из того же 16-месячного APP/PS1 мыши, показаны на рисунке 5A-C. Один кусочек был извлечен из полушарии лечение с нашими роман AAV (реагента), а другой срез обрабатывают реагентом контроль AAV (Управление). LTP вызывали в обоих ломтики с помощью двух 1 сек поезда 100 Гц стимуляции (10 сек intertrain интервал). Обратите внимание, что синаптические кривой силы для реагента обработанные срез смещается слева от контрольный раздел, что свидетельствует о большей синаптической силы. Также отметим, что, характерных для среднего возраста APP/PS1 мышей, LTP распались быстро базовой линии в контрольный раздел (например, 23). И наоборот, LTP распались мало срез обрабатывают наши роман реагента.
Во втором недавнем исследовании, мы наблюдали значительное LTD в автомобильных обработанных старых крыс (85% от предварительно ООО базовой, р <0,05). С другой стороны, не LTD наблюдался в возрасте крыс, получавших роман противовоспалительное "наркотиками" (97% от предварительно ООО базовой линии, не имеет значения). Нет ни одного лекарства воздействие на синаптической силы не наблюдалось. Представитель ООО экспериментов из этого набора данных (п = 8-10 крыс в группе) показаны на рисунке 5D-F.
Рисунок 1. Инструменты и материалы, используемые для вскрытия мозга., Бумажные полотенца. B, лезвие скальпеля. С Beebee ножницами. D, костные rongeurs (для крыс). Е, кости rongeurs (для мышей / крыс). F, пластиковые ложки. G, пластиковые пипетки передачи. H, гиппокампа инструмент. Я, шпателем. J, хирургические ножницы. К стеклянной чашки Петри.
Рисунок 2. Custom срез мозга холдинг камеры., Macrochamber. В, крышка. C, H 2 O резервуар с перфорированной трубкой силикона. D, микрокамере. Е, ACSF доставка трубы (полиэтилен). F, O 2 поставка труб. G, портом для контроля температуры. H, сетчатой микрокамере вставки.
Рисунок 3. RC22 погружения камеры., Запись камеры. B, первый электрод. С, аспирационная биопсия.
Рисунок 4. Гиппокампа иллюстрация ломтик и внеклеточных сигналов., Мультфильм поперечной гиппокампа раздел, используемый в экспериментах электрофизиологии. CA = Корню Ammonis. DG = зубчатой извилины. SC = Шаффер залогов. S = radiatum слой radiatum. B, Электрическая стимуляция SC (СА3 Аксон-кишечного тракта) вызывает стимул артефакт, и почти незамедлительно пресинаптического спайка населения, или волоконно-волейбол (FV). Амплитуда FV прямо пропорционально количество волокон SC активирован. Наклон спадающему фазы поля возбуждающих постсинаптических потенциала (ВПСП) соответствует непосредственно к активации деполяризующих синаптических токов в СА1 пирамидных нейронов в ответ на выброс глутамата из SC терминалов. С Перекрытие представитель внеклеточных сигналов, записанные в СА1 слой radiatum в ответ на девяти различных уровней интенсивности раздражения (30-500 мкА) в «здоровой» (слева), "опасное" и "гипервозбудимых" срез. Пять сигналы были усреднены за уровень. Здоровый ломтиками динамически реагировать на эту стимул диапазоне и имеют единственный положительный текущих населения шип (отражающий CA1 нейронов разряда) на более высоких уровнях стимула. В RC22 погружения камеры, максимальное ВПСП обычно находится в пределах от 1,5 до 3 мВ по амплитуде. Нездоровый ломтиками (средняя панель) часто демонстрируют большое Ф.В., но небольшой максимальной ВПСП (<1 мВ) и обычно показывают бедных пластичности. Гипервозбудимых ломтиками (справа) показаны два или более регенеративной шипы населения в восходящей ветви ВПСП. Ответы в гипервозбудимых ломтиками, часто лабильное и переменно, пострадавших от ООО / ДП стимуляции.
Рисунок 5. Представитель электрофизиологии экспериментах на острые ломтики от среднего возраста (16 мес) APP/PS1 мышей и в возрасте (22 мес) Fisher 344 крыс. Панели AB показывают данные, собранные в APP/PS1 мышей, получавших контроль адено-связанный (AAV) вирусные построить (управления) или роман реагента AAV (реагента), которая была разработана нашей лаборатории группы. По сравнению с контролем срез, срез обрабатывают реагентом экспонаты отмечены сдвига влево в ВПСП: Ф. В. кривой () свидетельствует о большей синаптической силы. Реагент-обработанные срез показывает также, надежный и стабильный LTP (В) после доставки из двух 1 сек, 100 поездов Гц стимула, а контрольный раздел экспонатов недостаточно LTP, характерные для данной животной модели. Панели DF показывают данные, собранные из двух человек в возрасте крыс, получавших хронический (4 недели) intrahippocampal перфузии транспортного средства или новый противовоспалительный препарат (наркотиками). Базальной синаптической силы был относительно устойчивым к воздействию наркологических(D). Тем не менее, наркотиками была очень эффективна для предотвращения индукции ООО (E). Панели C и F-шоу представитель ВПСП сигналов записаны от отдельных ломтиков до (предварительно) и 60 мин после (пост) доставка LTP / ООО стимуляции. Обратите внимание, что стимулом артефакты не отображаются.
Discussion
Действия, описанные в этом протоколе поможет гарантировать, что мозг вскрытия проводятся по крайней мере так же быстро и эффективно в возрасте, как у молодых взрослых крыс. Мы также предоставляем достаточно подробно для начинающих создавать свои собственные исследования слайса на LTP и LTD. Если дальнейшие исследования старения и AD изменения в синаптической пластичности функции и является одной из ваших целей, Есть по крайней мере, два других методологических вопросов, было указано выше, которые заслуживают дальнейшего рассмотрения. Во-первых, несколько лабораторий, показали, что Са 2 +: Mg 2 + отношение в записи ACSF может иметь заметное влияние на индукции синаптической пластичности в срезах гиппокампа 2,10,24,25. В млекопитающих CSF, Ca 2 +: Mg 2 + соотношение примерно один (см., например, 26). Тем не менее, ACSF Ca 2 +: Mg 2 + отношения ближе к 2 обычно используются в часть исследования синаптической функции и пластичности. В ранних исследованиях, эта практика, вероятно, приспособлена для оптимизации индукции LTP, то впоследствии стали обычным делом для всех пластичности исследований. Однако эта практика может быть проблематичным в процессе старения и AD исследованиям, потому что хорошо характеризуется различиями в нейронных Са 2 + регулирования. В частности, Са 2 + притока и / или Са 2 +-индуцированной Са 2 +-релиз повышен у старых крыс и / или мыши во время нашей эры модель нейронной активации 3,27-31. Индукция ООО особенно чувствительны к тонким изменениям в ACSF Са 2 + уровня. Наш протокол, который использует 2 мМ Са 2 + и 2 мМ Mg 2 +, который обычно приводит к ООО для престарелых, но не молодых взрослых животных 2, в то время как исследования с использованием Ca 2 +: Mg 2 + соотношение ближе к двум, наблюдали надежный LTD у взрослых в отсутствие разницы в возрасте 2,10 или в сочетании с пониженным LTD в старых крыс 32. Эти наблюдения указывают на необходимость внимательно рассмотреть ACSF Са 2 + и Mg 2 + при сравнении уровней Са 2 +-зависимой пластичности в возрасте и молодых взрослых животных.
Вторая методологическая проблема касается сильной зависимости от LTP на постсинаптической деполяризации 33 и возможно старения / генотип различия в синаптической силы. В типичном эксперименте LTP, исходные и LTP интенсивности стимуляции, как правило, отрегулированным для половины максимального (или три четверти максимального) ВПСП амплитудой. Потенциальной проблемой является то, что в возрасте крыс и мышей APP/PS1 обычно показывают снижение синаптической силы по отношению к своим младшим и / или диких коллегами типа, что означает, что значения базовой ВПСП также будет меньше старых крыс и мышей APP/PS1. Меньшие ВПСП могут перевести на менее деполяризации во время стимуляции LTP, в результате чего снижается вероятность для стимуляции LTP 33. Из-за этого потенциальные тупик, трудно определить, являются ли эти животные обладают пропускной дефицита, пластичности дефицита или то и другое. То есть, LTP механизмы индукции в возрасте и / или APP/PS1 мышей могут быть частично без изменений (не пластичности дефицит), но недостаточно стимулировал (пропускная дефицит) в этих условиях. Это различие имеет решающее значение, как механизмы пропускной способности и механизмов пластичности может работать очень по-разному для специфического лечения фармакологическими. Мы стараемся свести к минимуму воздействие снижается пропускная способность по индукции LTP нормализации ВПСП амплитудой до того же уровня (например, 1 мВ) во всех ломтиков до стимуляции LTP. Другие стратегии могут быть эффективными, а также (например, использование напряжения или тока зажим для выравнивания мембранного потенциала всей группы во время стимуляции LTP), и должны быть рассмотрены при исследовании ЛТП в этих моделях на животных.
Disclosures
Производство видео-статья была организована Leica Microsystems.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке гранта NIH AG027297, награду от штата Кентукки спинного мозга и травма головы Research Trust, и подарок от Клберг Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| KH2PO4 (monobasic) | Sigma-Aldrich | P5379-100G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| CaCl2 (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3306-250G | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | |
| C6H12O6 (dextrose) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| Table 1. Reagents required | |||
| Erlenmeyer Flasks | Fisher Scientific | FB-500-2000 FB-500-1000 | |
| Aquarium Bubbler | Used for oxygenating media. Available at most pet stores | ||
| 50 mL Glass beaker | Fisher Scientific | 02-540G | For brain storarge in ACSF |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Small Animal Guillotine | World Precision Instruments, Inc. | DCAP-M | |
| Flat paper towel | |||
| #11 Feather surgical blade | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| Beebee bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Lempert Rongeurs | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8321 | Use for rats |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16020-14 | Use for mice or rats |
| Hippocampus tool | Fine Science Tools | 10099-15 | |
| Spoon | A plastic teaspoon will do | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | Spatula |
| Surgical iris scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| plastic transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-43 | |
| 110mm Whatman filter paper | Fisher Scientific | 09-805E | Whatman cat. 1001-110 |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | ||
| Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome | Vibratome | VT1000P | |
| 0.1mm FA-10 Feather S blade | Ted Pella, Inc. | 121-9 | 0.1mm FA-10 Feather S blade |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) | Fisher Scientific | 13-678-20A | For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening |
| 35 mm Polysterine Culture dish | Corning | 430588 | Used for collecting slices after dissection |
| Table 2. Tools and materials for dissection | |||
| Holding chamber | Custom Made | ||
| P-97 Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday cage | Custom Made | ||
| Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm | Corning | 1220-1L | |
| Gravity-contolled IV set with regulator | Baxter Internationl Inc. | 2C8891 | |
| Central Vacuum Line | Available in most modern labs | ||
| 95% O2 / 5% CO2 Gas Mix | Scott-Gross Co. | ||
| TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery | Fisher Scientific | Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes. | |
| Eclipse E600FN Microscope | Nikon Instruments | with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters | |
| Cool Snap ES Digital Camera | Photometrics | Cool Snap ES Digital Camera | |
| X-Cite Fluorescent Illuminator | EXFO | X-Cite Fluorescent Illuminator | |
| Microscope Platform | Siskiyou, Inc. | Custom assembled | |
| RC-22 Submersible recording chamber | Warner Instruments | 64-0228 | Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner) |
| TC2BIP 2/3Ch Temperature controller | Cell Microcontrols | ||
| 4 Axis Manual Miniature manipulator | Siskiyou, Inc. | ||
| Platinum Iridium Wire (0.002 in) | World Precision Instruments, Inc. | PTT0203 | |
| A365 Stimulus Isolator | World Precision Instruments, Inc. | A365 Stimulus Isolator | |
| Multiclamp 700b Amplifier | Axon Instruments | ||
| Digidata 1322A A/D converter | Axon Instruments | ||
| PClamp software | Axon Instruments | ||
| Personal Computer (Pentium 4) | Dell | ||
| Table 3. Electrophysiology equipment and materials | |||
References
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging. J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).
- Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging. J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).
- Norris, C. M. Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging. Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).
- Burke, S. N., Barnes, C. A. Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics. Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).
- Foster, T. C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain. Aging Cell. 6, 319-325 (2007).
- Foster, T. C., Norris, C. M. Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity. Hippocampus. 7, 602-612 (1997).
- Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell. 6, 307-317 (2007).
- Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease. J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).
- Green, K. N., LaFerla, F. M. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron. 59, 190-194 (2008).
- Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1. J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels. J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
- Norris, C. M., Scheff, S. W. Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).
- Sama, M. A. Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity. J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).
- Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice. Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).
- Bear, M. F., Malenka, R. C. Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).
- Foster, T. C. Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline. Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).
- Foster, T. C., Kumar, A. Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats. Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).
- Hsu, K. S. Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation. Hippocampus. 12, 787-802 (2002).
- Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. 17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats. Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).
- Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. NFATs and Alzheimer's Disease. Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).
- Abdul, H. M. Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling. J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).
- Anantharaman, M. Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).
- Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice. PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).
- Stringer, J. L., Lothman, E. W. In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses. Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).
- Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats. J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).
- Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE. J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).
- Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release. J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).
- Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity. J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).
- Thibault, O., Landfield, P. W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science. 272, 1017-1020 (1996).
- Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability. J Neurosci. 24, 508-513 (2004).
- Stutzmann, G. E. Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).
- Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
- McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).
