Summary
Плюрипотентных стволовых клеток, растущих в виде суспензии дифференцироваться в эмбриоидных тел (ЭТ). Здесь показано, как получить высокое качество EB cryosections полезны для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза, сохраняя при этом свою организацию как агрегаты.
Abstract
Эмбриональных стволовых (ЭС) клеток плюрипотентные клетки, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты ранней стадии эмбрионов млекопитающих 1. Важный этап в дифференцировку ЭС клеток образование эмбриоидные тела (ЭТ) агрегатов 2, 3. Е. Б. Формирование на основе спонтанной агрегации, когда ES клетки культивируют в не сторонник пластин. Трехмерная резюмирует Е. Б. многие аспекты раннего эмбриогенеза млекопитающих и дифференцироваться в трех зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы 4.
Иммунофлуоресценции и гибридизация широко используются методы выявления целевых белков и РНК присутствуют в клетках тканей раздел 5, 6, 7. Здесь мы приведем простой метод для получения высоких cryosections качество эмбриоидных органов. Этот подход опирается на пространственную ориентацию EB вложения в октябре следуют cryosection техники. В результате разделов может быть подвергнут широкий спектр аналитических процедур для характеристики популяции клеток, содержащих определенные белки, РНК или ДНК. В этом смысле подготовка EB cryosections (10 мкм) являются необходимыми инструментами для анализа окрашивания гистологии (например, гематоксилином и эозином, DAPI), иммунофлюоресценции (например Oct4, нестин) или на месте гибридизации. Эта техника также может помочь понять аспекты эмбриогенеза в отношении поддержания три-мерной сферической структуры ЭТ.
Protocol
1. Фиксация и Криоконсервация
Плюрипотентные стволовые клетки культивировали на эмбриональных фибробластов мыши (MEF) инактивированные митомицином С и поддерживается в DMEM/F12 дополнена с 20% нокаут сыворотке замены (КСР) и 8ng / мл фактора роста фибробластов (FGF-2). Для того, чтобы вызвать образование EB H9 клетки были переданы не соблюдают блюд и культивировали в течение 7 дней, поддерживаться в DMEM/F12 дополнена с 15% КСР 8.
Обратите внимание (!): Этот метод может быть использован для ЭТ получена в результате любого эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
- Сбор ЭТ от культуры блюдо с пипеткой.
- Передача ЭТ в 15 мл коническую трубку и ждать, пока материал опускается на дно трубки.
- Удаление средних и исправить ЭТ с 4% параформальдегида (PFA) решение в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
Обратите внимание (!): Для восстановления на месте антиген гибридизации должно быть сделано для того, чтобы избежать перекрестной реакции с антителами ссылку в связи с использованием PFA 6,7. - Удалить PFA раствора и промыть PBS в течение 5 мин.
- ЭТ должны быть помещены в серийное разведение PBS-буферных растворах сахарозы (10, 20 и 30%, в последовательности) при 25-28 ° С, каждое решение должно быть заменено каждые 30 мин. Материал может быть в наличии в 30% растворе сахарозы при температуре 4 ° С до вложение ногу с октября
2. Ткань вложения, руководство и морозильные
- Осторожно собрать ЭТ из тюбика. Разряд столько раствора сахарозы насколько это возможно.
Обратите внимание (!): Очень важно, чтобы смочить внутреннюю стенку наконечник с раствором сахарозы перед сбором EBS. Эта процедура может избежать EB быть присоединены к концу. - Место ЭТ в форму и удалить остатки раствора сахарозы с фильтровальной бумаги.
Обратите внимание (!): Очень важно, чтобы не заполнить форму с ЭТ, чтобы избежать дублирования. - Заполните форму с октября медленно, стараясь не повторно приостанавливать EBS. После этого, поместите все EB в центре плесени и удаления пузырьков с пипеткой.
- Умеренно агитировать за 15 минут.
- Surround плесень с дробленым сухой лед, чтобы заморозить пробы. Октября должны быть полностью заморожены. На данный момент блоки могут храниться при температуре -70 ° С, в течение не менее одного года.
3. Cryosectioning Техника
- Удалить замороженных блоков от -70 ° C и место на криостате ранее охлаждают при температуре от -18 до -21 ° C.
Обратите внимание (!): Температура вне этого диапазона может привести к неприятности, как разделы керлинг, плавки или трещин. - Отсоедините блок октября из формы и поместите его в криостате поддержки за счет добавления новых октября
- Важно, чтобы ориентировать блок должным образом и привести его в соответствие параллельно краю лезвия.
Обратите внимание (!): Как ЭТ меньше, чем другие образцы тканей, этот шаг является чрезвычайно важным, чтобы минимизировать потери материала. - Октябрь блоки должны быть секционного поверхностно, пока поверхность плоскости получается. В шлифах (10 мкм) из ткани образца должны быть приняты и установлены на стеклах ранее окрашенных с 200 мг / мл поли L лизин (10 мкл на слайд) 9,10.
Обратите внимание (!): Чтобы избежать torned разделы обратить внимание на какой-либо ущерб на лезвие. - Все разделы должны быть воздушно-сухой в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем использоваться или храниться при температуре -70 ° С до использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод обеспечивает простой в последующей протокол для получения PFA фиксированных тонких срезов криостат эмбриоидные тела полезно для иммунофлуоресценции и на месте гибридизации. В результате cryosections позволяют изучать клеточные и молекулярные аспекты человеческой эмбриональной дифференциации стволовых клеток, при сохранении их структуры и организации, агрегатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Fundação де Ампаро Pesquisa сделать Estado-ду-Риу-де-Жанейро (FAPERJ), Conselho Насьональ де Desenvolvimento Científico электронной Tecnológico (CNPq) и Национальным институтом Ciencia электронной Tecnologia (INCTC). Мы благодарны Бруно С. Паулсен и Алине Фернандес М. Б. для изображений.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
