Summary
Pluripotenten Stammzellen in Suspension wachsende Differenzierung in Embryoidkörpern (EBS). Hier zeigen wir, wie eine hohe Qualität EB Kryoschnitten nützlich für die Untersuchung zellulärer und molekularer Aspekte der Embryogenese zu erhalten, unter Wahrung ihrer Organisation als Aggregate.
Abstract
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind pluripotente Zellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste-Phase Anfang Säugerembryonen 1 abgeleitet. Eine entscheidende Etappe in der Differenzierung von ES-Zellen ist die Bildung von Embryoidkörpern (EVG) Aggregate 2, 3. EB Bildung ist auf spontane Aggregation basiert, wenn ES-Zellen in nicht haftenden Platten kultiviert. Ektoderm, Mesoderm und Endoderm 4: Dreidimensionale EB rekapituliert viele Aspekte der frühen Embryogenese von Säugetieren und in die drei Keimblätter differenzieren.
Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung sind allgemein Techniken für die Detektion von Target-Proteinen und mRNA in Zellen eines Gewebes § 5, 6, 7 verwendet. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Technik, um qualitativ hochwertige Gefrierschnitte von Embryoidkörpern generieren. Dieser Ansatz stützt sich auf die räumliche Orientierung der EB Einbettung in OCT gefolgt von den Gefrier-Technik. Die daraus resultierenden Abschnitte können auf eine Vielzahl von analytischen Verfahren unterzogen werden, um Populationen von Zellen, die bestimmte Proteine, RNA oder DNA zu charakterisieren. In diesem Sinne sind die Herstellung von EB Kryoschnitten (10 um) wesentliche Instrumente für die Histologie Färbung Analyse (zB Hämatoxilin und Eosin, DAPI), Immunfluoreszenz (zB Oct4, Nestin) oder in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann auch dazu beitragen, Aspekte der Embryogenese in Bezug auf die Aufrechterhaltung des dreidimensionalen sphärischen Struktur des EBs zu verstehen.
Protocol
1. Fixation und Kryokonservierung
Pluripotenten Stammzellen wurden auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) mit Mitomycin C inaktiviert und gepflegt in DMEM/F12 ergänzt mit 20% Knockout Serumersatz (KSR) und 8ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2) kultiviert. Um EB induzieren H9-Zellen wurden auf nicht-haftenden Schalen überführt und kultiviert für 7 Tage, in DMEM/F12 mit 15% KSR 8 ergänzt gepflegt.
Hinweis (!): Diese Technik kann für EBs aus allen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet werden.
- Sammeln Sie die EBs aus der Kulturschale mit einer Pipette.
- Transfer-EBs in ein 15 ml konischen Rohr und warten, bis das Material sinkt auf den Boden des Röhrchens.
- Nehmen Sie mittel-und fix EBs mit 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Hinweis (!): Für in-situ-Hybridisierung Antigen Erholung sollte getan werden, um Cross-Link-Reaktion mit Antikörpern durch den Einsatz von PFA 6,7 zu vermeiden. - Entfernen PFA-Lösung und Waschen mit PBS für 5 min.
- EBs sollte in Verdünnungsreihe PBS-gepufferte Saccharose-Lösungen (10, 20 und 30%, in Folge) bei 25-28 ° C gelegt, jede Lösung muss alle 30 min ersetzt werden. Das Material kann dann in der 30% Saccharose-Lösung bei 4 ° C, bis die Einbettung Schritt mit OCT gelagert werden.
2. Tissue Embedding, Ausrichtungs-und Gefrieren
- Sorgfältig sammeln EBs aus der Tube. Discharge so viel Saccharose-Lösung wie möglich.
Hinweis (!): Es ist wichtig, an der inneren Wand der Spitze mit Saccharose-Lösung vor dem Sammeln der EBs nass. Dieser Vorgang kann zu vermeiden EB an der Spitze befestigt werden. - Legen Sie EBs in der Form und Beseitigung fortbestehender Saccharose-Lösung mit Filterpapier.
Hinweis (!): Es ist wichtig, nicht die Form mit EBs zu füllen, um Überschneidungen zu vermeiden. - Fill Form mit OCT langsam, dabei nicht zu resuspendieren EBs. Danach legen alle EB in der Mitte der Form und entfernen Sie Luftblasen mit der Pipette.
- Mild für 15 Minuten rühren.
- Surround die Form mit zerkleinertem Trockeneis, um die Probe einfrieren. Oktober sollte komplett eingefroren werden. An dieser Stelle Blöcke können bei -70 ° C gelagert werden, für mindestens 1 Jahr.
3. Kryoschneiden Technik
- Entfernen Sie den gefrorenen Block von -70 ° C und am Kryostaten zuvor bei einer Temperatur zwischen -18 und -21 ° C abgekühlt
Hinweis (!): Temperaturen außerhalb dieses Bereichs kann Schwierigkeiten Abschnitte Eisstockschießen, Schmelz-oder Rissbildung. - Trennen Sie das OAT-Block aus der Form und legen Sie sie in den Kryostaten Unterstützung durch Hinzufügen weiterer Oktober
- Es ist wichtig zur Orientierung der Block richtig aufstellen und parallel zum Rand des Blattes.
Hinweis (!): Wie EBs kleiner als andere Gewebeproben, ist dieser Schritt sehr wichtig, um den Verlust von Material zu minimieren. - Oktober Blöcke sollten im Schnitt nur oberflächlich, bis die Oberfläche Ebene erhalten. Dünne Schnitte (10 um) der Gewebeprobe zu achten und montiert werden auf Glas-Objektträger zuvor mit 200 mg / mL Poly-L Lysin (10 l pro Folie) 9,10 beschichtet.
Hinweis (!): Um torned Abschnitte zu vermeiden achten Sie auf eventuelle Schäden an der Klinge. - Alle Abschnitte sollten luftgetrocknet werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend verwendet oder bei -70 ° C bis zur Verwendung.
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Discussion
Die hier beschriebene Methode bietet eine einfach zu folgen Protokoll PFA fixiert dünne Kryostatschnitte von Embryoidkörpern nützlich für Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung Assays zu erhalten. Die daraus resultierende Kryoschnitten erlauben die Untersuchung von zellulären und molekularen Aspekten der menschlichen embryonalen Stammzellen die Differenzierung unter Wahrung ihrer Struktur und Organisation als Aggregate.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Fundação de Amparo unterstützte eine Fortgeschrittenen-do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und dem Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Wir sind dankbar, Bruna S. Paulsen und Aline M. Fernandes für die EB Bilder.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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