Summary
Pluripotent स्टेम निलंबन में बढ़ कोशिकाओं embryoid निकायों (ईबीएस) में अंतर है. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे उच्च गुणवत्ता EB embryogenesis के सेलुलर और आणविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी cryosections प्राप्त करने के लिए, जबकि समुच्चय के रूप में उनके संगठन के संरक्षण.
Abstract
भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) pluripotent ब्लास्टोसिस्ट चरण जल्दी स्तनधारी एक भ्रूण के भीतर सेल मास से प्राप्त कोशिकाओं रहे हैं. ES कोशिकाओं की भिन्नता में एक महत्वपूर्ण चरण embryoid निकायों के गठन (ईबीएस) समुच्चय 2, 3 है. EB गठन सहज एकत्रीकरण पर आधारित है जब ES कोशिकाओं गैर पक्षपाती प्लेटों में सुसंस्कृत हैं. बाह्य त्वक स्तर mesoderm, और 4 endoderm: तीन आयामी EB recapitulates जल्दी स्तनधारी embryogenesis के कई पहलुओं और तीन रोगाणु परतों में अंतर है .
Immunofluorescence और स्वस्थानी संकरण में व्यापक रूप से लक्ष्य प्रोटीन और mRNA एक ऊतक धारा 5, 6, 7 की कोशिकाओं में मौजूद का पता लगाने के के लिए तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं. यहाँ हम embryoid निकायों के उच्च गुणवत्ता cryosections उत्पन्न करने के लिए एक सरल तकनीक मौजूद है. इस दृष्टिकोण अक्टूबर में EB एम्बेडिंग के स्थानिक उन्मुखीकरण cryosection तकनीक द्वारा पीछा किया पर निर्भर करता है. परिणामस्वरूप वर्गों विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता के अधीन किया जा सकता है क्रम में कुछ प्रोटीन, शाही सेना या डीएनए युक्त कोशिकाओं की आबादी विशेषताएँ. इस अर्थ में, EB cryosections की तैयारी (10μm) ऊतक विज्ञान धुंधला विश्लेषण के लिए आवश्यक उपकरण (जैसे Hematoxilin और Eosin, DAPI), (Oct4 जैसे, nestin) immunofluorescence या स्वस्थानी संकरण में हैं. इस तकनीक को भी त्रि - आयामी ईबीएस के गोलाकार संरचना के रखरखाव के साथ संबंध है embryogenesis के पहलुओं को समझने में मदद कर सकते हैं.
Protocol
1. फिक्सेशन और cryopreservation
Pluripotent स्टेम सेल माउस भ्रूणीय (MEF) fibroblasts mitomycin सी के साथ निष्क्रिय और DMEM/F12 में रखा 20% पीटा सीरम (KSR) प्रतिस्थापन और 8ng / fibroblast वृद्धि कारक के एमएल (FGF-2) के साथ पूरक पर सुसंस्कृत थे. आदेश में EB गठन उत्पन्न करने के लिए H9 कोशिकाओं गैर पक्षपाती व्यंजन के लिए स्थानांतरित कर दिया गया और 7 दिन, 15% 8 KSR के साथ पूरक DMEM/F12 में बनाए रखा के लिए सभ्य.
नोट (!): यह तकनीक किसी भी भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पन्न ईबीएस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक विंदुक के साथ संस्कृति डिश से ईबीएस लीजिए.
- स्थानांतरण ईबीएस एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए और इंतजार जब तक सामग्री ट्यूब के नीचे डूब.
- मध्यम निकालें और एक 4% (पीएफए) कमरे के तापमान में 30 मिनट के लिए paraformaldehyde समाधान पीबीएस के साथ ईबीएस ठीक.
नोट (!): स्वस्थानी संकरण प्रतिजन वसूली में 6,7 पीएफए के उपयोग की वजह से एंटीबॉडी के साथ पार कड़ी प्रतिक्रिया से बचने के क्रम में किया जाना चाहिए. - पीएफए समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धोने.
- ईबीएस धारावाहिक PBS बफर sucrose के समाधान के कमजोर पड़ने (10, 20 और 30% अनुक्रम में) में 25-28 में रखा होना चाहिए डिग्री सेल्सियस, प्रत्येक समाधान हर 30 मिनट की जगह होना चाहिए. सामग्री तो अक्टूबर के साथ एम्बेड कदम जब तक 30% 4 sucrose के समाधान ° सी में रखता जा सकता है.
2. ऊतक एम्बेडिंग मार्गदर्शन, और बर्फ़ीली
- ध्यान से ट्यूब से ईबीएस इकट्ठा. निर्वहन जितना संभव हो के रूप में sucrose के समाधान.
नोट (!): यह महत्वपूर्ण है पहले ईबीएस एकत्रित sucrose के समाधान के साथ टिप के आंतरिक दीवार गीला. यह प्रक्रिया EB से बचने के लिए टिप करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. - मोल्ड में ईबीएस प्लेस और फिल्टर पेपर के साथ शेष sucrose के समाधान निकालने के.
नोट (!): यह महत्वपूर्ण है ईबीएस के साथ मोल्ड भरने के लिए अतिव्यापी से बचने के लिए नहीं है. - अक्टूबर के साथ मोल्ड धीरे भरें, ध्यान लेने के लिए नहीं ईबीएस फिर निलंबित. उसके बाद, मोल्ड के केंद्र में सभी EB जगह और विंदुक के साथ बुलबुले हटायें.
- 15 मिनट के लिए हल्का आंदोलन.
- मोल्ड कुचल सूखी बर्फ नमूना फ्रीज के साथ चारों ओर. अक्टूबर पूरी तरह से जमे हुए किया जाना चाहिए. इस बिंदु पर ब्लॉक -70 ° सी में संग्रहीत किया जा सकता है कम से कम एक वर्ष के लिए.
3. तकनीक Cryosectioning
- -70 से जमे हुए ब्लॉक निकालें डिग्री सेल्सियस और जगह cryostat पर पहले -18 और -21 के बीच एक के तापमान पर ठंडा डिग्री सेल्सियस
नोट (!): इस सीमा के बाहर तापमान वर्गों की तरह मुसीबतों कर्लिंग, पिघलने या खुर का कारण हो सकता है. - अक्टूबर ब्लॉक आचारण से अलग और अधिक अक्तूबर जोड़कर cryostat समर्थन में जगह.
- यह ब्लॉक ठीक से उन्मुख करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह ब्लेड के किनारे करने के लिए समानांतर संरेखित.
नोट! () के रूप में ईबीएस अन्य ऊतकों के नमूनों की तुलना में छोटे होते हैं, यह अत्यंत महत्वपूर्ण कदम है सामग्री के नुकसान को कम करने के लिए. - अक्टूबर ब्लॉक sectioned अल्पज्ञता होना चाहिए जब तक सतह विमान प्राप्त है. ऊतक के नमूने की पतली वर्गों (10μm) लिया जाना चाहिए और कांच पर घुड़सवार स्लाइड पहले 200 मिलीग्राम / एमएल पाली एल lysine 9,10 (स्लाइड प्रति 10 μL) के साथ लेपित.
(!) नोट: torned वर्गों से बचने के ब्लेड पर किसी भी क्षति के लिए ध्यान देना. - सभी खंड हवा कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सूखे और फिर से इस्तेमाल किया है या उपयोग करें जब तक -70 पर संग्रहीत ° सी हो. होना चाहिए.
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Discussion
विधि यहाँ वर्णित प्रदान करता है एक आसान - का पालन प्रोटोकॉल के लिए पीएफए तय immunofluorescence के लिए और स्वस्थानी संकरण assays में उपयोगी embryoid निकायों की पतली cryostat वर्गों प्राप्त है . परिणामस्वरूप cryosections मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं भेदभाव के सेलुलर और आणविक पहलुओं के अध्ययन की अनुमति है, जबकि उनके संरचना और समुच्चय के रूप में संगठन के संरक्षण.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम Fundação डे Amparo द्वारा समर्थित किया गया था एक Pesquisa एस्टाडो रियो डी जनेरियो (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico ई (CNPq) Tecnologico और Instituto Nacional de Ciência ई TECNOLOGIA (INCTC). हम Bruna एस Paulsen और EB छवियों के लिए Aline एम. फर्नांडीस के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
