Summary
Células-tronco pluripotentes de crescimento em suspensão se diferenciar em corpos embrióides (EBs). Aqui demonstramos como obter criosecções de alta qualidade EB útil para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, preservando a sua organização como agregados.
Abstract
-Tronco embrionárias (ES) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna do blastocisto estágio precoce de embriões de mamíferos 1. A fase crucial na diferenciação de células-tronco embrionárias é a formação de corpos embrióides (EBs) agregados 2, 3. EB formação é baseada na agregação espontânea, quando as células ES são cultivadas em placas não aderente. Recapitula tridimensional EB muitos aspectos da embriogênese de mamíferos cedo e se diferenciam em três camadas germinativas: ectoderma, mesoderma e endoderma 4.
Imunofluorescência e hibridização in situ são amplamente utilizadas técnicas para a detecção de proteínas-alvo e mRNA presente nas células de uma secção de tecido 5, 6, 7. Aqui nós apresentamos uma técnica simples para gerar criosecções alta qualidade dos corpos embrióides. Esta abordagem baseia-se na orientação espacial do EB incorporação em outubro seguido pela técnica cryosection. As seções resultante pode ser submetida a uma ampla variedade de procedimentos analíticos, a fim de caracterizar as populações de células que contêm certas proteínas, RNA ou DNA. Neste sentido, a preparação da EB criosecções (10μm) são ferramentas essenciais para análise histológica coloração (por exemplo, Hematoxilina e Eosina, DAPI), imunofluorescência (por exemplo, Oct4, nestina) ou hibridização in situ. Esta técnica pode também ajudar a compreender aspectos da embriogênese no que diz respeito à manutenção da estrutura tri-dimensional esférica de EBs.
Protocol
1. Fixação e Criopreservação
Células-tronco pluripotentes foram cultivados em fibroblastos de rato embrionárias (MEF) inativados com mitomicina C e mantidos em DMEM/F12 suplementado com a substituição knockout 20% de soro (KSR) e 8ng / mL do fator de crescimento de fibroblastos (FGF-2). , A fim de induzir a formação de células H9 EB foram transferidos para a não-aderente pratos e cultivadas por 7 dias, mantidos em DMEM/F12 suplementado com 15% KSR 8.
Nota (!): Esta técnica pode ser usada para EBs derivado de uma célula embrionária e induziu-tronco pluripotentes.
- Recolher as EBs da placa de cultura com uma pipeta.
- EBs transferência para um tubo cônico de 15 mL e espere até que o material se deposita no fundo do tubo.
- Remova o meio e corrigir EBs com paraformaldeído a 4% (PFA) em solução de PBS por 30 minutos em temperatura ambiente.
Nota (!): Para a recuperação de hibridização in situ antígeno deve ser feito para evitar a reação de ligação cruzada com anticorpos, devido à utilização de PFA 6,7. - Remoção da solução de PFA e lavar com PBS por 5 min.
- EBs deve ser colocado em diluição em série da PBS-buffered soluções de sacarose (10, 20 e 30%, em seqüência) a 25-28 ° C, cada solução deve ser substituído a cada 30 min. O material pode ser estocado em solução de sacarose 30% a 4 ° C até a etapa de incorporação com outubro
2. A incorporação de tecido de Orientação e Congelamento
- Cuidadosamente recolher os EBs do tubo. Descarga da solução de sacarose, tanto quanto possível.
Nota (!): É importante para molhar a parede interna da ponta com a solução de sacarose antes de coletar a EBs. Este procedimento pode evitar EB para ser acoplado à extremidade. - EBs lugar no molde e remoção da solução de sacarose restante com papel de filtro.
Nota (!): É importante para não encher o molde com EBs de evitar sobreposições. - Preencha o molde com outubro lentamente, tomando cuidado para não re-suspender EBs. Depois disso, coloque todas as EB no centro do molde e remover as bolhas com a pipeta.
- Ligeiramente agitar por 15 minutos.
- Cercam o molde com gelo seco moído para congelar a amostra. Outubro deve ser totalmente congelado. Neste ponto, os blocos podem ser armazenadas a -70 ° C, durante pelo menos um ano.
3. Cryosectioning Técnica
- Remover o bloco congelado entre -70 ° C e colocar no criostato previamente resfriado a uma temperatura entre -18 e -21 ° C.
Nota (!): Temperaturas fora dessa faixa podem causar problemas como seções curling, derretimento ou rachaduras. - Retire o bloco de outubro do molde e coloque-o no suporte de criostato, adicionando outubro mais.
- É importante orientar o bloco corretamente e alinhá-la paralelamente à borda da lâmina.
Nota (!): Como EBs são menores do que outras amostras de tecido, esta etapa é extremamente importante para minimizar a perda de material. - Blocos de outubro deve ser seccionado superficialmente até que o plano de superfície é obtida. Cortes finos (10μm) da amostra de tecido devem ser tomados e montados em lâminas de vidro previamente revestido com 200 mg / mL poli L lisina (10 mL por slide) 9,10.
Nota (!): Para evitar seções torned prestar atenção a qualquer danos na lâmina. - Todas as seções devem ser secas ao ar por 1 hora à temperatura ambiente e depois ser usado ou armazenado a -70 ° C até o uso.
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Discussion
O método descrito aqui fornece um fácil de seguir o protocolo para obter PFA seções fixas criostato fina de corpos embrióides útil para imunofluorescência e em ensaios de hibridização in situ. O criosecções resultando permitir o estudo de aspectos celulares e moleculares da embrionárias humanas diferenciação de células-tronco, preservando a sua estrutura e organização como agregados.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo Pesquisa um do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Somos gratos a Bruna Paulsen e S. M. Aline Fernandes para as imagens EB.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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