Summary
Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.
Abstract
Madre embrionarias (ES) son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna del blastocisto en fase inicial, los embriones de mamíferos 1. Una etapa crucial en la diferenciación de células madre embrionarias es la formación de cuerpos embrioides (EBS) agregados 2, 3. La formación de EB se basa en la agregación espontánea cuando las células ES se cultivaron en placas no adherente. Tridimensional recapitula EB muchos aspectos de la embriogénesis temprana de mamíferos y se diferencian en las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo 4.
Inmunofluorescencia e hibridación in situ se utilizan mucho las técnicas para la detección de proteínas diana y el ARNm presente en las células de una sección de tejido 5, 6, 7. Aquí presentamos una técnica sencilla para generar cryosections alta calidad de los cuerpos embrioides. Este enfoque se basa en la orientación espacial de la incorporación de EB en octubre seguido por la técnica cryosection. Las secciones resultantes pueden ser objeto de una amplia variedad de procedimientos analíticos para caracterizar las poblaciones de células que contienen ciertas proteínas, ADN o ARN. En este sentido, la preparación de cryosections EB (10μm) son herramientas esenciales para el análisis de la tinción histológica (por ejemplo, hematoxilina y eosina, DAPI), inmunofluorescencia indirecta (por ejemplo, Oct4, nestin) o hibridación in situ. Esta técnica también puede ayudar a comprender aspectos de la embriogénesis en lo que respecta al mantenimiento de la estructura esférica tridimensional de EBS.
Protocol
1. La fijación y criopreservación
Las células madre pluripotentes fueron cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEF) inactivados con mitomicina C y se mantiene en DMEM/F12 complementado con el reemplazo de octavos de final 20% de suero (KSR) y 8ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2). Con el fin de inducir la formación de EB H9 células fueron transferidas a no adherentes platos y cultivadas durante 7 días, mantenida en DMEM/F12 complementado con un 15% KSR 8.
Nota (!): Esta técnica se puede utilizar para EBs derivadas de cualquier célula pluripotente madre embrionarias e inducidos.
- Recoge los EBs de la placa de cultivo con una pipeta.
- Transferencia de EBs a un tubo de 15 ml y esperar hasta que el material se hunde al fondo del tubo.
- Quitar medio y fijar EBS con un 4% de paraformaldehído (PFA) en la solución de PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Nota (!): Para la recuperación in situ antígeno hibridación se debe hacer para evitar la reacción de entrecruzamiento con anticuerpos debido a la utilización de la PFA 6,7. - Eliminar la solución de PFA y lavar con PBS durante 5 min.
- EBS se debe colocar en serie de dilución de PBS buffer soluciones de sacarosa (10, 20 y 30%, en la secuencia) a 25-28 ° C, cada solución debe ser reemplazado cada 30 minutos. El material puede ser almacenado en la solución de sacarosa al 30% a 4 ° C hasta el paso de la incrustación de octubre
2. Incorporación de los tejidos, Orientación y de congelación
- Recoger cuidadosamente el EBS del tubo. Descarga de sacarosa como mucho una solución posible.
Nota (!): Es importante que se orinan en la pared interna de la extremidad con solución de sacarosa antes de recoger el EBS. Este procedimiento se puede evitar la EB que se adjunta a la punta. - EBs lugar en el molde y retirar la solución restante de sacarosa con papel de filtro.
Nota (!): Es importante no llenar el molde con EBS para evitar la superposición. - Colocar el molde con octubre lentamente, con cuidado de no volver a suspender EBS. Después de eso, coloque todos los EB en el centro del molde y eliminar las burbujas con la pipeta.
- Agitar suavemente durante 15 minutos.
- Rodean el molde con hielo picado en seco para congelar la muestra. Octubre debe estar completamente congelado. En este punto, los bloques pueden ser almacenadas a -70 ° C, por lo menos un año.
3. Muestras criostáticas Técnica
- Retire el bloque congelado desde -70 ° C y colocarlos en criostato previamente enfriado a una temperatura entre -18 y -21 ° C.
Nota (!): Las temperaturas fuera de este rango puede causar problemas como secciones curling, fusión o formación de grietas. - Separar el bloque de octubre del molde y se coloca en el soporte del criostato, añadiendo más octubre
- Es importante orientar correctamente el bloque y alinearla paralela al borde de la hoja.
Nota (!): Como EBs son más pequeñas que las muestras de otros tejidos, este paso es muy importante para minimizar la pérdida de material. - Bloques de octubre se debe seccionar superficialmente hasta que el plano de la superficie se obtiene. Secciones delgadas (10μm) de la muestra de tejido se deben tomar y montados en portaobjetos de cristal previamente recubierto de 200 mg / ml de poli L-lisina (10 l por diapositiva) 9,10.
Nota (!): Para evitar que las secciones torned prestar atención a los daños y perjuicios a la hoja. - Todas las secciones deben ser secadas al aire durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se utilizan o almacenan a -70 ° C hasta su uso.
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Discussion
El método descrito aquí proporciona una forma fácil de seguir el protocolo para obtener PFA fijo secciones de criostato delgada de cuerpos embrioides útil para inmunofluorescencia y en los ensayos de hibridación in situ. El cryosections resultante permitirá el estudio de aspectos celulares y moleculares de la madre de embriones humanos diferenciación de células, mientras que preserva su estructura y organización de los agregados.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Amparo un Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y el Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Estamos muy agradecidos a Bruna S. Paulsen y Aline M. Fernandes para las imágenes EB.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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