Summary
בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.
Abstract
גזע עובריים (ES) התאים הם תאים שמקורם pluripotent מסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט בשלב עוברי מוקדם יונקים 1. שלב מכריע התמיינות של תאים עובריים היא היווצרות של גופים embryoid (EBS) אגרגטים 2, 3. היווצרות EB מבוסס על צבירת ספונטנית כאשר תאים עובריים הם בתרבית צלחות חסיד לא. תלת ממדי משחזר EB היבטים רבים של יונקים embryogenesis מוקדם להתמיין שלוש שכבות נבט: האאקטודרם והמזודרם ואת האנדודרם 4.
Immunofluorescence וב הכלאה באתרו נמצאים בשימוש נרחב בטכניקות לצורך זיהוי של חלבונים היעד הנוכחי mRNA בתאים של קטע רקמה 5, 6, 7. כאן אנו מציגים טכניקה פשוטה ליצירת cryosections האיכות הגבוהה של הגופים embryoid. גישה זו מסתמכת על האוריינטציה המרחבית של הטבעה EB ב אוקטובר ואחריו הטכניקה cryosection. סעיפים שהתקבל יכולה להיות נתונה למגוון רחב של נהלים אנליטיים על מנת לאפיין אוכלוסיות של תאים המכילים חלבונים מסוימים, RNA או DNA. במובן זה, הכנת EB cryosections (10μm) הם כלים חיוניים לצורך ניתוח מכתים היסטולוגיה (למשל Hematoxilin ו Eosin, DAPI), immunofluorescence (למשל Oct4, nestin) או הכלאה באתרה. טכניקה זו יכולה גם לעזור להבין את ההיבטים של העובר ביחס לשמירה על מבנה תלת מימדי כדורית של EBS.
Protocol
1. קיבוע ו cryopreservation
בתאי גזע pluripotent היו בתרבית על fibroblasts העכבר עובריים (MEF) מומת עם mitomycin C ומתוחזק DMEM/F12 בתוספת החלפת בנוקאאוט 20% נסיוב (KSR) ו 8ng / mL של גורם גדילה פיברובלסטים (FGF-2). על מנת לגרום להיווצרות תאים EB H9 הועברו לא חסיד כלים בתרבית למשך 7 ימים, נשמר DMEM/F12 בתוספת 15% KSR 8.
שים לב (!): טכניקה זו ניתן להשתמש EBS נגזר כל עובריים ו המושרה גזע pluripotent.
- אסוף את EBS מצלחת התרבות עם טפטפת.
- העברת EBS על צינור חרוטי 15 מ"ל ולהמתין החומר שוקע לתחתית הצינור.
- הסר בינוני ולתקן EBS עם paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
שים לב (!): עבור התאוששות הכלאה באתרו אנטיגן צריך להיעשות על מנת למנוע תגובה קישור לחצות עם נוגדנים עקב השימוש של PFA 6,7. - הסר פתרון PFA ולשטוף עם PBS עבור 5 דקות.
- EBS יש להציב דילול סדרתי של PBS שנאגרו פתרונות סוכרוז (10, 20 ו ברצף, 30%) ב 25-28 מעלות צלזיוס, כל פתרון חייב להיות מוחלף כל 30 דקות. חומר אז יכול להיות מצויד בפתרון סוכרוז 30% ב 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הטבעה עם אוקטובר
2. הטבעת רקמות, הדרכה הקפאת
- בזהירות לאסוף את EBS מהצינור. ככל פריקה סוכרוז פתרון האפשרית.
שים לב (!): חשוב להרטיב את הקיר הפנימי של קצה עם פתרון סוכרוז לפני איסוף EBS. הליך זה יכול להימנע EB להיות מחוברת בקצה. - המקום EBS במתכונת ולהסיר פתרון סוכרוז שנותרו עם נייר סינון.
שים לב (!): חשוב לא למלא את התבנית עם EBS, כדי למנוע חפיפה. - מלא עובש עם אוקטובר לאט, נזהרת שלא מחדש להשעות את EBS. אחרי זה, במקום כל EB במרכז התבנית ולהסיר בועות עם פיפטה.
- המעטה להתסיס במשך 15 דקות.
- הקף את התבנית עם קרח יבש כתוש להקפיא את המדגם. אוקטובר אמור להיות קפוא לחלוטין. בשלב זה חוסם יכול להיות מאוחסן ב -70 ° C, למשך שנה אחת לפחות.
3. Cryosectioning טכניקה
- הסר את גוש קפוא מ -70 מעלות צלזיוס ומניחים על cryostat מקורר בעבר בין -18 ו -21 בטמפרטורה ° C.
שים לב (!): הטמפרטורות מחוץ לטווח זה עלול לגרום לבעיות כמו קטעי מסתלסל, נמס או פיצוח. - ניתוק לחסום אוקטובר מהתבנית ומניחים אותה לתמוך cryostat ידי הוספת אוקטובר יותר.
- חשוב לכוון את הבלוק שצריך ליישר אותו במקביל קצה הלהב.
שים לב (!): כפי EBS הם קטנים יותר מאשר דגימות רקמות אחרות, שלב זה חשוב מאוד כדי להקטין את איבוד של חומר. - בלוקים אוקטובר אמור להיות מחולק באופן שטחי עד המטוס משטח מתקבל. סעיפים דק (10μm) של הדגימה רקמות חייב להילקח ועלה על שקופיות הזכוכית מצופה בעבר עם 200 מ"ג / מ"ל פולי L ליזין (10 μL לכל שקופית) 9,10.
שים לב (!): כדי להימנע בסעיפים torned לשים לב לנזקים בבית הלהב. - כל הסעיפים צריכים להיות באוויר יבש לשעה 1 בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשמש או מאוחסנים -70 ° C עד השימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מספק קל לעקוב אחר פרוטוקול להשיג PFA סעיפים קבועים cryostat דקה של גופים embryoid שימושי immunofluorescence וב מבחני הכלאה באתרה. Cryosections וכתוצאה מכך לאפשר חקר היבטים תאית ומולקולרית של האדם התמיינות בתאי גזע עובריים, תוך שמירה על המבנה שלהם בארגון כמו אגרגטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Fundação דה Amparo Pesquisa לעשות Estado לעשות בריו דה ז'נרו (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico דואר Tecnológico (CNPq) ואת Instituto Nacional de Tecnologia Ciência דואר (INCTC). אנו מודים ברונה ס פאולסן ואלין מ פרננדס לתמונות EB.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
