Summary
懸濁液中で成長して多能性幹細胞は胚様体（EB）に分化する。集合体としての組織を維持しながら、ここでは、胚発生の細胞および分子的側面を研究するための有用な高品質のEBの凍結切片を取得する方法を示します。
Abstract
胚性幹（ES）細胞は胚盤胞段階の初期の哺乳類の胚1の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。 ES細胞の分化に重要な段階は、胚様体（EB）を集約2,3の形成である。 ES細胞は非接着プレートで培養されているときにEBの形成が自発的凝集に基づいています。外胚葉、中胚葉と内胚葉4：三次元EBの反復するには、多くの初期の哺乳類の胚発生の側面とは、三胚葉に分化する。
免疫蛍光法およびin situハイブリダイゼーションは、広く組織部5、6、7の細胞に存在する標的蛋白質とmRNAの検出のための技術を使用している。ここでは、胚様体の高品質の凍結切片を生成する単純な手法を提示する。このアプローチは、凍結切片法に続いて、OCTで埋め込むEBの空間的な向きに依存しています。結果のセクションは、特定のタンパク質、RNAまたはDNAを含む細胞集団を特徴づけるために、分析的手続の多種多様に供することができる。この意味で、EB凍結切片の準備（10μm以下）は組織学的染色の解析に必須のツール（例えば、ヘマトキシリンとエオシン、DAPI）、免疫蛍光（例えばOct4の、ネスチン）またはin situハイブリダイゼーションである。また、この手法は、EBの三次元球状構造の維持にに関してと胚の側面を理解するのに役立ちます。
Protocol
1。固定と凍結保存
多能性幹細胞がマウス胚性線維芽細胞（MEF）マイトマイシンCで不活化し、20％ノックアウト血清代替（KSR）および線維芽細胞増殖因子の8ng / mLの（FGF - 2）を補充したDMEM/F12で維持に培養した。 EBの形成を誘導するために、H9細胞は非接着性の皿に移し、7日間培養、KSR 8〜15％を補足したDMEM/F12中で維持した。
注（！）：この手法は、任意の胚および誘導多能性幹細胞から派生したEBS用に使用することができます。
- ピペットで培養皿からEBSを収集する。
- 15 mLコニカルチューブにEBSを移し、チューブの底に材料のシンクまで待ちます。
- 培養液を除去し、室温で30分間、PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液でEBSを修正。
注（！）：in situハイブリダイゼーションの抗原の回復にはPFA 6,7を使用しているため、抗体によるクロスリンク反応を避けるために行われるべき。 - PFA溶液を除去し、5分間PBSで洗浄する。
- EBは25から28にPBS -バッファショ糖溶液の段階希釈（シーケンス10、20および30％）に配置する必要があります° Cは、それぞれの解決策は30分ごとに交換する必要があります。材料は、OCTで埋め込むステップまで、4で30％のスクロース溶液° Cに貯蔵することができます。
2。組織の埋め込み、ガイダンスと凍結
- 慎重にチューブからEBSを収集する。できるだけ多くの蔗糖液として排出。
注（！）：EBSを収集する前に、ショ糖溶液と先端の内壁を湿らせることが重要です。この手順では、先端に装着されるEBを回避することができます。 - 金型内でEBSを置き、ろ紙で残りのショ糖溶液を取り除く。
注（！）：重複を避けるためにEBSと金型を埋めるためにしないことが重要です。 - EBSを再中断しないように注意しながら、ゆっくりとOCTで金型を埋める。その後、金型の中心にすべてのEBを配置し、ピペットで泡を取り除く。
- 穏やかに15分間振とうする。
- サンプルを凍結する砕いたドライアイスを使用して金型を囲みます。 OCTは完全に凍結して下さい。この時点で、ブロックは少なくとも1年間は、-70℃で保存することができます。
3。 Cryosectioningテクニック
- ° Cと以前に-18と-21の間の温度で冷却するクライオスタット上で場所-70℃から凍結したブロックを削除します。
注（！）：この範囲外の温度は、セクション、カーリング溶融やクラックなどのトラブルを引き起こす可能性があります。 - 金型からのOCTブロックを外し、より多くのOCTを追加することにより、クライオスタットのサポートに配置します。
- それが適切にブロックの向きが重要であるとブレードのエッジには、平行に合わせます。
注（！）：EBSは、他の組織サンプルよりも小さいので、このステップは、材料のロスを最小限に抑えるために極めて重要である。 - 表面の平面が得られるまでのOCTブロックは、表面的に切片化してください。組織標本の薄片（10μm以下）は以前に200ミリグラム/ mLのポリLリジン（スライド当たり10μL）9,10でコートしたスライド採取し、ガラス上にマウントされている必要があります。
注（！）：tornedセクションを避けるためには、ブレードで損害に注意を払う。 - すべてのセクションでは、でなければ空気乾燥、室温で1時間、次に使用するまで使用または-70℃保存をする。
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Discussion
方法は、免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーションアッセイに有用な胚様体のPFA固定薄凍結切片を得るためにわかりやすいプロトコルを提供するここで説明する。集合体としての構造や組織を維持しながら、結果として凍結切片は、ヒト胚性幹細胞の分化の細胞および分子的側面の研究を可能にする。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品はFundaçãoパコデアンパロによってサポートされていたPesquisaエスタードが行う作業リオデジャネイロ（FAPERJ）、ConselhoナシオナルデDesenvolvimento Científico電子モンテ（CNPq）とセルバンテスナシオナルデCiênciaのe Tecnologia（INCTC）。我々は、ブルーナS.ポールセンやEBの画像のアラインM.フェルナンデスに感謝しています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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