Summary
钙离子释放活化钙全细胞膜片钳记录（CRAC）外周血单核细胞衍生的人类T淋巴细胞中的电流，我们提供了一步一步的协议。
Abstract
T淋巴细胞，耗尽的Ca 2 +从细胞内Ca 2 +存储信息激活质膜钙离子通道，被称为钙释放激活钙（CRAC）通道。 CRAC通道中的T细胞增殖和基因表达调控中发挥重要作用。 T细胞异常的CRAC通道的功能已被链接到重症联合免疫缺陷和自身免疫性疾病1，2。在人类T细胞研究的CRAC通道功能调节正常的免疫反应，可能会发现新的分子机制，并揭开有关人类疾病的原因。膜电流的电生理记录功能通道特性及其调控提供最准确的评估。然而，在正常的人体T细胞的CRAC电流测量，人类白血病T细胞株，Jurkat T细胞的CRAC通道电流的电生理评估是第一次执行超过20年，前3仍然是一个具有挑战性的任务。在录音中正常T细胞的CRAC通道电流的困难加剧的事实，血源性T淋巴细胞Jurkat T细胞的大小比要小得多，因此，全细胞内源性的CRAC电流幅度非常低。在这里，我们给一步一步的过程，我们经常使用记录的 Ca 2 +或Na +通过在休息从健康志愿者的外周血中分离的人类T细胞的CRAC通道的电流。这里描述的方法记录在Jurkat T细胞的CRAC电流激活人体T细胞4-8所使用的程序获得通过。
Protocol
1。准备休息的人T淋巴细胞
- 使用RosetteSep人类T细胞富集鸡尾酒和RosetteSep密度中等，净化T细胞从人体血液样本，根据制造商的指示。由此产生的细胞群，应含有95％的CD3 +静止T细胞。我们净化人类T淋巴细胞，从外周血中，从健康志愿者按照由加州大学戴维斯分校的内部审查委员会批准的协议采集的样本。
- 隔离后，重新悬浮静止T细胞在细胞培养液中中含有谷氨酰胺和HEPES的RPMI - 1640培养基的密度在0.5 × 10 6细胞/ mL，辅以10％小牛血清，2％GlutaMAX，我，1％的RPMI 1640维生素溶液，1％的RPMI 1640氨基酸溶液，1％丙酮酸钠，0.03％β-巯基乙醇。
- 放入细胞培养瓶中的细胞悬液，并保持在37 ° C的培养箱在5％的CO 2至24小时之前的实验。
2。录音商会的制备
- 以下是需要以准备录音商会：一个）硅Ø -环，b）轮，70％乙醇和蒸馏水H 2 Ø，彗星清洗25毫米盖玻片）混合Sylgard184，根据制造商的指示编写，和D）两个60 × 15毫米的培养皿中。
- 地点〜0.5毫升混合Sylgard184成60x15毫米的培养皿。
- O形圈的下部浸入Sylgard184使用镊子。
- 放置在一个干净的表面，如另一个培养皿中，O型环O形圈的边缘删除多余的Sylgard184。
- 盖玻片上环和按下来。
- 在85 ° C是40-60分钟或直到Sylgard184聚合的加热商会治愈Sylgard184。
- 无尘埃的容器存放在录音室。
3。制备补丁移液器
- 在实验的当天，拉1〜2微米的提示使用玻璃毛细管的直径和吸管拉马的移液器。我们用长丝的高硼硅管（外径：1.5 mm和ID：1.10毫米）。在无灰尘的位置的商店移液器。
- 大衣枪头Sylgard184或HIPEC R6101半导体防护涂层，按照标准程序9。
- 轻轻地火抛光实验前的移液器。
4。膜片钳安装准备
- 配置并保存在控制你的膜片钳放大器软件gigaseal形成的宏。我们使用Windows XP和脉冲数据采集软件的支持下，EPC - 10放大器。我们设置的“设置”，“细胞”，和“全细胞”宏根据EPC - 10手动和所有的实验中使用它们。
- 实验前准备洗澡的解决方案和表1中列出的吸管解决方案，并储存于4 ° C 1周。
| 化学品 | 沐浴解决方案（MM） | 移液器解决方案（毫米） | ||
| ＃1 | ＃2 | ＃3 | ||
| CH 3 SO 3娜 | 130 | 110 | 125 | - |
| 氯化钠 | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca（OH）2的 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2的 | 3 | 1 | - | 5 |
| 硫酸镁 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| CS - Aspartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| 血糖 | 10 | 10 | 10 | - |
表1。全细胞CARC当前的录音解决方案。
均购自Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州的所有化学品。
- 确定液体的交界处之间补丁吸管的解决方案，并每个液10的电位（ LJ）。保存在适当的地方使用采集软件的LJ值。例如，脉冲程序中插入的“LJ”控制的“放大器”窗口中的LJ值。
- 配置和刺激的协议，在适当的地方采集软件之前的实验，如图1所示，保存。在脉冲程序，我们在“脉冲产生”窗口中设置了收购协议。
图1。刺激协议从-120到100毫伏的持续时间在50毫秒的电压斜坡是每0.2 - 2秒（5 - 0.5赫兹） 。斜路之间的电位（V H）维持在30毫伏。
5。显微镜舞台上安装的细胞
- 大衣与聚- L -赖氨酸〜20分钟，洗净与H 2 O，然后在电镀前的细胞与汉克的平衡盐溶液（HBSS）的录音室。
- 板500μL进入会议厅和20分钟的孵育的细胞悬液，含0.2-0.5 × 10 6细胞在37 ° C 。
- 凭借一腔持有人的贴壁细胞的录音室。我们使用一个特制的商会持有人，基地支持盖玻片的底部，而上面的部分轻轻地对盖玻片上方的印刷机。
- 放置在倒置显微镜下阶段的商会持有。
- 细胞集中在透射光。我们使用了40X的油浸物镜。
- 放入浴缸的Ag / AgCl参比电极。
- 将多管，重力驱动灌注系统。流入管的尖端应放在45 °角，以盖玻片接近视野。
- 吸痰管流入管的尖端对面的位置。
- 灌注室与磷酸盐缓冲液（PBS）或HBSS洗去细胞培养基和松散贴壁细胞。
6。 CRAC通道电流记录
- 找到一个牢固地附着在盖玻片的细胞。我们通常会选择一个平均大小的圆形细胞，具有光滑的外表面。
- 灌注与Ca 2 +，3 mM的Mg 2 +的含液＃1（表1）含有0.5-1块SERCA泵为8-10分钟微米毒胡萝卜素的录音室。我们执行这一步gigaseal形成之前消耗存储。
- 使用的Eppendorf microloader和一个P - 20位移移液器，填充液（见表1）补丁吸管和放大器探头插入吸管持有的补丁吸管。的Ca 2 +螯合剂BAPTA液，被动地消耗商店和减少的Ca 2 +依赖的CRAC通道的失活。
- 应用补丁吸管内再入浴少量的正压（〜3英寸的H 2 O）。我们使用一个特制的压力吸气的设备连接到加压的空气和真空线，以创建补丁吸管内的积极或消极的压力。
- 通过显微镜下的可视化控制，降低到洗澡的补丁吸管。在“示波器”窗口中，你应该看到一个电流流经吸管。在电流幅值的一个阶梯状的变化应引起一个小幅度的电压脉冲，通过预设的宏中的应用（测试脉冲）。这时，你应该能够确定吸液管电阻值。我们移液器的电阻通常为5-6MΩ的。
- 纠正“抵消”吸管和参比电极之间产生的潜在。
- 通过显微镜的视觉控制下，把枪头更接近，直到它触及到细胞的细胞膜。
- 应用补丁吸管内的负压（20-40英寸的H 2 O） 。
- 监视器在“示波器”窗口gigaseal形成。你会看到目前的幅度，测试脉冲，减少和吸液管电阻增加值> 5GΩ的诱导。在FE的通常gigaseal形式瓦特秒，但它可能需要1-2分钟，以达到稳定gigaseal。
- 补偿吸管电容（“快”）。
- 申请额外的负面压力，用20毫升注射器打破补丁膜。
- 设置到30毫伏电位。了积极的控股潜力，有助于防止钙依赖性的CRAC通道的失活。
- 补偿细胞膜电容（“慢”）;保存或记录的C -慢的价值。
- 检查访问电阻“R S”值。在我们的实验中，R S通常是7-20兆欧。
- 开始申请一个0.5赫兹的频率在Ca 2 +免费3毫米Mg 2 +的含液＃1（图1）一系列电压斜。在这个解决方案，机房空调的电流是可以忽略不计小的“泄漏”目前由于Mg 2 +的通透性差的CRAC通道相比。保存和使用沐浴液＃1“泄漏”的电流记录在未来的分析当前的痕迹。 “泄漏”目前在-100 mV的绝对幅度应小于或等于5 pA的。如果细胞是“漏”，停止对使用一个新的补丁吸管和一个新的单元格的实验，并开始。
- 要记录的Ca 2 +电流通过的CRAC通道（CA - CRAC）， 通过切换灌注阀，取代20 毫米的Ca 2 +含液＃2（表1）的Ca 2 +免费3毫米Mg 2 +的含液＃1 。这允许的Ca 2 +通过的CRAC通道的流量，产生内向电流。在“示波器”窗口中，你会看到内向整流我CA机房空调（图2）的发展。目前在负电压的振幅将继续增加约1分钟的Ca 2 +依赖的CRAC电流程增强。
- 增加刺激频率5 Hz，这是必要的记录通过的CRAC通道的瞬态钠电流电压斜。
- 替换20毫米的Ca 2 +含Na +的含二价阳离子免费的解决方案＃3（见表1）通过切换灌注阀液＃2。在“示波器”窗口中，你会看到一个振幅较大的瞬态发展， 内向整流娜+，目前通过的CRAC通道（我娜的CRAC图2）。
- 一个可能适用于20毫米的Ca 2 +含液含有的实验记录“泄漏”目前结束在1-5微米镧+＃2。然而，我们没有发现这种方法非常有用，因为“泄漏电流的变化，”随着时间的推移，它可能在实验结束后成为更大或更小。我们宁愿采取记录中的Ca 2 +免费3毫米的电流镁2 +含液为“泄漏”目前的实验开始于＃1 。
- 保存记录作进一步分析当前的痕迹。
7。数据分析
- 检索到分析软件保存当前记录。我们使用脉冲程序进行分析。
- 测量电压斜在开始和结束目前的幅度。我们通常在-100 mV和100 mV的“示波器”脉冲程序的窗口在使用游标对测量的电流幅度。
- 成作进一步的分析和图形显示的图形程序中导出电流幅度值。我们使用原产科学绘图和分析软件，第7版。
8。代表性的成果
图2。机房空调在休息的人类T细胞的电流 （A），当然在全细胞电压钳在-100 mV的（实心圆）和100毫伏（空心圆）的配置记录的CRAC电流。 gigaseal形成之前，细胞孵育〜10分钟，在Ca 2 +免费的3 毫米MG 2 +含液＃1含0.5微米毒胡萝卜素。 CA的突破后，洗澡的解决方案相继被应用如下：2 + 3 毫米MG 2 +含液＃1（0钙3毫克），20毫米的Ca 2 +含液＃2 （20钙），二价阳离子无液液＃2（20钙）＃3（DVF），其次是。一系列如在图1所示的电压斜的细胞受到刺激。斜道的频率为5赫兹液＃3（DVF）在所有其他解决方案和0.5赫兹。请注意应用20 毫米的Ca 2 +含液＃2和我那机房空调的快速瞬态发展DVF液＃3后发展缓慢， 我钙的 CRAC 。 （二），代表当前的痕迹记录在Ca 2 +无3 mM的镁2 +含液＃1（在电压斜“泄漏”），20毫米的Ca 2 +含液＃2（20钙），液＃3（DVF）。 （C，D），我CA的CRAC（C）和我娜的CRAC（四）获得减去“泄漏”电流电压斜的Ca 2 +含浴期间录得20毫米的电流的电流-电压关系解决方案＃2（20钙），沐浴液＃3（DVF）面板（b）所示。
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Discussion
人类T细胞在休息的CRAC电流的电生理调查是一项具有挑战性的任务，因为在这些细胞中的内源性的CRAC的电流幅值小，由于小单元尺寸（休息人体T细胞直径在5-8微米的范围内）。在这里，我们现在一步一步的程序，以可靠地记录在休息的人类T淋巴细胞从外周血单个核细胞中分离的CRAC电流。这项技术使我们能够探讨在静息T细胞的CRAC通道的生理学和功能表达，以便更好地了解正常和病理的免疫细胞反应的性质。使用此协议，可以衡量人类T细胞以及其他免疫细胞，激活人体T细胞，单核细胞，和巨噬细胞，如在休息的CRAC电流。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢为我们提供与离子通道的研究设施和良好的环境，加州大学戴维斯分校生理学与膜生物学部。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
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