Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

Summary

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הקלטת כל תא תיקון מהדק של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים היקפי mononuclear תאים שמקורם בדם אנושי לימפוציטים-T.

Abstract

ב לימפוציטים מסוג T, דלדול של Ca ^{2 +} מ תאיים Ca ^{2 +} חנות מוביל ההפעלה של plasmalemmal Ca ² ערוצים ^+, שנקרא שחרור המופעל סידן סידן (CRAC) ערוצים. ערוצי CRAC לשחק תפקיד חשוב בוויסות של התפשטות תאים T ו ביטוי גנים. חריגה פונקציה CRAC ערוץ בתאי T נקשר חמורה כשל חיסוני ומחלות אוטואימוניות וכן בשילוב ^{1, 2.} לימוד פונקציה ערוץ CRAC בבני אדם בתאי T עשויה לחשוף המנגנונים המולקולריים חדש המסדיר התגובות החיסוניות נורמלי לפענח את הגורמים מחלות אנושיות בנושא. הקלטות של זרמים אלקטרו קרום לספק הערכה מדויקת ביותר של נכסים ערוץ פונקציונלי ורגולציה שלהם. הערכה של זרמים אלקטרו CRAC ערוץ Jurkat בתאי T, לוקמיה האדם T שורת תאים, בוצעה לראשונה יותר מאשר לפני 20 שנה ^3, לעומת זאת, מדידות CRAC הנוכחי נורמלי בתאי T אנושיים נותר משימה מאתגרת. הקשיים ברישום זרמי CRAC ערוץ נורמלי בתאי T הן מורכב על ידי העובדה דם הנגזרות לימפוציטים מסוג T הם הרבה יותר קטנים בגודל מאשר תאים Jurkat T, ולכן אנדוגני כל תא זרמים CRAC נמוכים מאוד משרעת. הנה, אנחנו נותנים הליך צעד אחר צעד שאנחנו משתמשים באופן שגרתי להקליט את Ca ^{2 +} או Na ⁺ זרמים דרך ערוצים CRAC ב נחים אדם בתאי T מבודדים מהדם ההיקפי של מתנדבים בריאים. השיטה המתוארת כאן אומצה מהנהלים המשמש הקלטה הזרמים CRAC בתאי T Jurkat והופעל אדם בתאי T ^4-8.

Protocol

1. הכנת מנוחה לימפוציטים T האדם

1. שימוש RosetteSep קוקטייל האדם T Cell העשרה צפיפות בינונית RosetteSep, לטהר בתאי T דגימות דם אדם על פי הוראות היצרן. אוכלוסיית התאים וכתוצאה מכך אמור להכיל 95% CD3 ⁺ T תאים נחים. אנו לטהר לימפוציטים מסוג T האדם מן דגימות דם היקפיים שנאספו מתנדבים בריאים בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת UC Davis סקירה פנימית.
2. לאחר בידוד, resuspend בתאי T מנוחה בצפיפות של 0.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום תרבית תאים המכיל RPMI-1640 בינוני עם גלוטמין ו HEPES, בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, 2% GlutaMAX-I, 1% RPMI 1640 ויטמין פתרון, 1% RPMI 1640 פתרון חומצות אמינו, pyruvate נתרן 1%, ו 0.03% β-mercaptoethanol.
3. תא פלייס ההשעיה לתוך צלוחיות תרבית תאים ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עם חממה humidified 5% CO ₂ עד 24 שעות לפני הניסוי.

2. הכנה של לשכת הקלטה

1. הבאים יש צורך להכין את חדרי הקלטה: א) סיליקון O-טבעות, ב) עגולים, 25 מ"מ coverslips לנקות עם אתנול 70% ו מזוקקים H ₂ O, ג) מעורבות Sylgard184, ערוכים לפי הוראות היצרן, ו ד) two 60 x 15 מ"מ צלחות פטרי.
2. מקום ~ 0.5 מ"ל של Sylgard184 מעורב לתוך צלחת פטרי 60x15 מ"מ.
3. טובלים את חלקו התחתון של טבעת-O לתוך באמצעות מלקחיים Sylgard184.
4. הסר Sylgard184 עודף שפת טבעת-O על ידי הנחת טבעת O-על משטח נקי, כמו צלחת פטרי נוספת.
5. מניחים את הטבעת על coverslip ולחץ אותו.
6. Cure Sylgard184 ידי חימום לתאי על 85 מעלות צלזיוס במשך 40-60 דקות או עד Sylgard184 הוא polymerized.
7. חנות לתאי הקלטה במיכל אבק חופשי.

3. הכנת pipettes תיקון

1. ביום הניסוי, למשוך pipettes בקוטר טיפ ~ 2 מיקרומטר באמצעות זכוכית נימים חולץ פיפטה. אנחנו משתמשים בצינור בורוסיליקט עם נימה (OD: 1.5 מ"מ מק"ט: 1.10 מ"מ). חנות pipettes במיקום אבק חופשי.
2. מעיל עם פיפטה טיפים Sylgard184 או HIPEC ציפוי מגן R6101 סמיקונדקטור, על פי נוהל קבוע ^9.
3. בעדינות אש לצחצח את pipettes לפני הניסוי.

4. הצמד תיקון הגדרת הכנה

1. הגדר ולהציל את פקודות מאקרו ליצירת gigaseal בתוכנת שליטה תיקון מגבר-clamp שלך. אנו משתמשים מגבר EPC-10 נתמך על ידי Windows XP ו-Pulse תוכנה לרכישת הנתונים. הקמנו את "הגדרת", "על תאים", ו "כל תא" פקודות מאקרו על פי הוראות EPC-10 ו להשתמש בהם עבור כל הניסויים.
2. הכינו פתרונות אמבטיה פתרונות פיפטה המפורטים בטבלה 1 לפני הניסוי ולאחסן אותם על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע.

כימיקלים	באת פתרונות (מ"מ)			פיפטה פתרונות (מ"מ)
	# 1	# 2	# 3
CH 3 SO 3 Na	130	110	125	-
NaCl	2	4	5	-
Ca (OH) 2	-	20	-	-
MgCl 2	3	1	-	5
MgSO 4	-	-	-	2
HEPES	10	10	10	15
HEDTA	-		10	-
EDTA	-	-	1	-
Cs-spartate	-	-	-	125
BAPTA	-	-	-	12
גלוקוז	10	10	10	-

טבלה 1. פתרונות עבור כל תא הקלטות הנוכחית קרק.

כל הכימיקלים נרכשו מ סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי.

3. קביעת פוטנציאל צומת הנוזלים (LJ) בין פתרון התיקון פיפטה וכל פתרון אמבטיה ^10. שמור את הערך LJ במקום המתאים באמצעות תוכנת הרכישה שלך. לדוגמה, בתוכנית דופק להכניס את הערך LJ לתוך שליטה "LJ" בחלון "מגבר".
4. הגדר ולהציל את הפרוטוקולים גירוי, כפי שמוצג באיור 1, במקום המתאים של התוכנה הרכישה שלך לפני הניסויים. בתוכנית Pulse, אנו קובעים את פרוטוקול רכישת בחלון "דור פולס".
   
   באיור 1. . פרוטוקול גירוי כבש מתח מ -120 ל 100 mV של 50 מילישניות משך מוחל על כל 0.2-2 s (5-0.5 הרץ). פוטנציאל אחזקות (V _ח) בין רמפות נשמר mV 30.

5. תאים הרכבה על הבמה מיקרוסקופ

1. מעיל לתאי הקלטה עם _{פולי-L-ליזין} עבור 20 דקות ולשטוף עם ~ H ₂ O ואז עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) לפני ציפוי התאים.
2. 500 פלייט μL ההשעיה התא המכיל 0.2-0.5 x10 ⁶ תאים לתוך תא ו דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C.
3. אבטח את תא הקלטת עם תאים המחוברים בעל קאמרית. אנו משתמשים בעל מחוייט קאמרית, שבה תומכת בבסיס התחתון של coverslip, ואילו את החלק העליון בעדינות לוחץ על החלק העליון של coverslip.
4. המקום בעל קאמרית על הבמה של המיקרוסקופ הפוכה.
5. פוקוס על התאים האור המועבר. אנו משתמשים אובייקטיבי 40X טבילה שמן.
6. מניחים את אלקטרודת Ag / AgCl התייחסות לאמבטיה.
7. יישר את, multibarrel הכבידה מונחה מערכת זלוף. קצה הצינור יבוא צריך להיות ממוקם ב 45 מעלות זווית כדי לסגור את coverslip לשדה הראייה.
8. מקמו את צינור היניקה מול אל קצה צינור יבוא.
9. Perfuse הקאמרית עם פוספט בופר סליין (PBS) או HBSS כדי לשטוף את תרבית תאים מדיה תאים מחוברים באופן רופף.

6. CRAC ערוץ הקלטה זרמים

1. מצא תא מחובר היטב coverslip. אנחנו בדרך כלל לבחור בגודל ממוצע, תא עגול עם משטח חלקה החיצוני.
2. Perfuse הקאמרית הקלטה עם Ca ^{2 +} חינם, 3 מ"מ Mg ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 1 (טבלה 1) ובה 0.5-1 מיקרומטר thapsigargin 8-10 דקות כדי לחסום את המשאבה SERCA. אנו מבצעים את הצעד הזה כדי לרוקן את החנות לפני היווצרות gigaseal.
3. שימוש microloader Eppendorf ו פיפטה-20-P תזוזה, למלא את פיפטה תיקון עם פתרון פיפטה (טבלה 1) להכניס את התיקון פיפטה לתוך מחזיק פיפטה על headstage את המגבר. Ca ^{2 +} chelator BAPTA נכלל הפתרון פיפטה כדי פסיבי לרוקן את החנות כדי להפחית Ca ^{2 +} תלויי איון ערוץ CRAC.
4. למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי (~ 3 ס"מ של H ₂ O) בתוך פיפטה את התיקון לפני הכניסה לאמבטיה. אנו משתמשים מחוייט ללחץ יניקה מכשיר המחובר אוויר דחוס קווי ואקום ליצור לחץ חיובי או שלילי בתוך פיפטה תיקון.
5. מנמיכים את פיפטה תיקון לאמבטיה תחת שליטה ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ. בחלון "אוסצילוסקופ", אתה צריך לראות זרם זורם דרך פיפטה. שינוי צעד כמו משרעת הנוכחי צריך להיגרם על ידי דופק מתח קטן משרעת (מבחן הדופק) מיושם על ידי המאקרו מראש. בשלב זה, אתה אמור להיות מסוגל לקבוע את ערך ההתנגדות פיפטה. ההתנגדות של pipettes שלנו הוא בדרך כלל 5-6 MΩ.
6. תקן את "לקזז" הפוטנציאל שנוצר בין פיפטה לבין אלקטרודה השוואתית.
7. תחת בקרה חזותית באמצעות המיקרוסקופ, מביא את קצה פיפטה קרוב לתא עד נוגע קרום התא.
8. החל לחץ שלילי (20-40 ס"מ של H ₂ O) בתוך פיפטה את התיקון.
9. צג היווצרות gigaseal בחלון "אוסצילוסקופ". אתה תראה את המשרעת של הזרם, הנגרמת על ידי דופק את הבדיקה, מקטין את הערך של עליות פיפטה התנגדות> 5 GΩ. צורות gigaseal בדרך כלל בתוך פהw שניות, אבל זה יכול לקחת 1-2 דקות כדי להשיג gigaseal יציב.
10. פיצוי על קיבול פיפטה ("C-Fast").
11. לשבור את קרום תיקון על ידי הפעלת לחץ שלילי נוסף באמצעות מזרק 20 סמ"ק.
12. הגדר את הפוטנציאל להחזיק עד 30 mV. פוטנציאל חיובי מחזיק מסייעת במניעת סידן תלויי איון CRAC הערוץ.
13. פיצוי על קיבול הממברנה של התא ("C-איטי"); לשמור או להקליט את הערך של C-איטי.
14. בדוק את הערך של ההתנגדות גישה "R _ים". בניסויים שלנו, _של R הוא בדרך כלל 70-20 MΩ.
15. התחל ליישם שורה של רמפות מתח עם תדר של 0.5 Hz (איור 1) של Ca ^{2 +} ללא mM 3 Mg ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 1. בפתרון זה, הנוכחי CRAC קטן negligibly בהשוואה עם "דליפה" הנוכחי עקב חדירות העניים של ערוצי CRAC עבור Mg ^{2 +.} שמור את עקבות השימוש הנוכחי נרשם פתרון אמבטיה # 1 בניתוחים בעתיד כמו זרמים "דליפה". משרעת המוחלט של "דליפה" הנוכחי ב -100 mV צריך להיות פחות או שווה ל הרשות 5. אם התא הוא "דולף", להפסיק את הניסוי ולהתחיל מחדש בעזרת פיפטה תיקון חדש תא חדש.
16. כדי להקליט Ca ^{2 +} הנוכחי דרך ערוצים CRAC (אני _CA-CRAC), להחליף Ca ^{2 +} 3 ללא Mg ^{2 מ"מ +} אמבט המכילים פתרון # 1 עם 20 מ"מ Ca ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 2 (טבלה 1) על ידי החלפת שסתומים זלוף. זה מאפשר Ca ^{2 +} לזרום דרך ערוצים CRAC לייצר זרם פנימה. בחלון "אוסצילוסקופ", תוכל לראות התפתחות פנימית לתיקון אני _CA-CRAC (איור 2). משרעת הזרם במתח שלילי ימשיך לעלות דקות על 1 בשל Ca ^{2 +} תלויי potentiation של הנוכחי CRAC.
17. הגדלת התדירות של גירוי עם רמפות מתח 5 הרץ, אשר יש צורך להקליט את Na ⁺ חולף הנוכחית דרך ערוצים CRAC.
18. החלף את 20 מ"מ Ca ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 2 עם פתרון Na ⁺ המכילים קטיון ללא divalent # 3 (טבלה 1) על ידי החלפת שסתומים זלוף. בחלון "אוסצילוסקופ", תוכל לראות התפתחות חולף של משרעת גדולה יותר כלפי פנים לתיקון Na ⁺ הנוכחי באמצעות ערוצי CRAC (אני _Na-CRAC; איור 2).
19. אפשר להחיל 20 מ"מ Ca ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 2 המכיל 1-5 מיקרומטר לה ^{3 +} בסוף הניסוי כדי להקליט את "דליפה" הנוכחי. עם זאת, לא מצאנו גישה זו שימושית כי "דליפה" שינויים הנוכחי לאורך זמן זה עלול להיות גדול או קטן יותר בסוף הניסוי. אנחנו מעדיפים לקחת הנוכחית נרשמה Ca ^{2 +} ללא mM 3 Mg ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 1 בתחילת הניסוי בתור "דליפה" הנוכחי.
20. שמור את עקבות הנוכחי נרשם לניתוח נוסף.

7. ניתוח נתונים

1. אחזר את הרשומות הנוכחי נשמר לתוך תוכנת ניתוח. אנו משתמשים בתוכנית דופק לניתוח.
2. מדוד את אמפליטודות הנוכחי בתחילת בסוף רמפות מתח. אנחנו בדרך כלל למדוד את אמפליטודות הנוכחית ב -100 mV ובבית באמצעות mV 100 זוגות של סמנים בחלון "אוסצילוסקופ" של התוכנית דופק.
3. ייצוא ערכי אמפליטודות הנוכחית לתוכנית גרפי לניתוח נוסף והצגה גרפית. אנו משתמשים Graphing מקור מדעי תוכנות ניתוח, גרסה 7.

8. נציג תוצאות

איור 2. CRAC זרמים תא T מנוחה אדם. (א), וכמובן זמן של זרמים CRAC נרשם תצורה מתח-clamp כל תא ב -100 mV (עיגולים מלאים) ו - 100 mV (עיגולים פתוח). לפני היווצרות gigaseal, התא היה preincubated דקות 10 ~ ב Ca ^{2 +} ללא mM 3 Mg ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 1 המכיל thapsigargin 0.5 מיקרומטר. לאחר פריצה, פתרונות אמבטיה יושמו ברצף כדלקמן: Ca ^{2 +} ללא 3 מ"מ Mg ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 1 (0 Ca + 3 מ"ג), ואחריו 20 מ"מ Ca ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 2 (20 Ca), ואחריו פתרון divalent קטיון ללא אמבטיה # 3 (DVF), ואחריו פתרון אמבטיה # 2 (20 Ca). התא היה מגורה עם סדרה של רמפות מתח כפי שמוצג באיור 1. תדירות רמפות היה 5 הרץ בפתרון אמבטיה # 3 (DVF) ו 0.5 הרץ בכל פתרונות אחרים. הערה התפתחות איטית של אני _CA-CRAC לאחר היישום של 20 מ"מ Ca ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 2 ופיתוח חולף במהירות של אני _Na-CRAC בפתרון אמבטיה DVF # 3. (ב), עקבות הנוכחית נציג שנרשמו במהלך רמפות מתח Ca ^{2 +} ללא 3 מ"מ Mg ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 1 ("דליפה"), 20 מ"מ Ca ^{2 +} אמבט המכילים פתרון # 2 (20 Ca), והפתרון אמבטיה # 3 (DVF). (C, D), שוטפים מתח של יחסים אני _CA-CRAC (ג) ואני _Na-CRAC (ד ') מתקבל על ידי הפחתה של "דליפה" הנוכחי מן הזרמים שנרשמו במהלך-רמפות מתח 20 מ"מ Ca ^{2 +} המכילים אמבטיה פתרון # 2 (20 Ca), והפתרון אמבטיה # 3 (DVF) המוצג בלוח (B).

Discussion

החקירה של זרמים אלקטרו CRAC ב נחים אדם בתאי T היא משימה מאתגרת כי משרעת אנדוגני הנוכחית CRAC בתאים אלה הוא קטן בשל גודל תאים קטנים (בקוטר מנוחה האדם T התא בטווח של 5-8 מיקרומטר). כאן, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד באופן מהימן שיא זרמים CRAC בבני אדם לימפוציטים T מנוחה מבודדים תאים דם היקפיים mononuclear. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקור את הפיזיולוגיה ביטוי פונקציונלית של ערוצי CRAC בתאי T מנוחה כדי להבין טוב יותר את מהות נורמליים ופתולוגיים התגובות תא החיסון. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן למדוד זרמים CRAC ב נחים בתאי T אנושיים, כמו גם תאים חיסוניים אחרים, כגון מופעל בתאי T, מונוציטים אדם, מקרופאגים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15061
RosetteSep Density Medium	Stem Cell Technologies	15705
RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES	Fisher Scientific	SH3025501
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
GlutaMAX-I (100X solution)	Invitrogen	35050
RPMI 1640 vitamin solution (100X)	Sigma-Aldrich	7256
1640 amino acids solution (50X)	Sigma-Aldrich	R7131
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
β-Mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Inositol trisphosphate	Sigma-Aldrich	19766
BAPTA	Sigma-Aldrich	A4926
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636
Lanthanum Chloride	Sigma-Aldrich	262072
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004
HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating	Dow Corning
63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table	Technical Manufacturing Corp.	63-540
EPC 10 patch clamp amplifier with headstage	HEKA Instruments
Micromanipulator	Sutter Instrument Co.	MP-285
Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective	Olympus Corporation	1X71
Windows Computer	Dell
Pulse software	HEKA Instruments
Origin Scientific Graphing and Analysis Software	OriginLab
Patch pipette puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm	Sutter Instrument Co.	BF150-110-7.5
Narashige’s Microforge	Tritech Research, Inc.	MF-830
Silicon O-rings	McMaster-Carr	111 S70
Coverslips 25 mm	Fisher Scientific	12-545-102 25 mm 25CIR.-1