In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie

Summary

Clathrine-gemedieerde endocytose afhankelijk van de adapter eiwitten die lading selectie en clathrine vacht montage coördineren. Hier beschrijven we de procedures voor adapter-clathrine fysieke interactie en live cell imaging methoden gebruikt als een model de gist endocytische adapter eiwit Sla1p bestuderen.

Abstract

Een belangrijke endocytische route start met de vorming van clathrine-gecoate blaasjes (CCV), dat het vervoer lading uit de cel oppervlak naar ^1-6 endosomen. CCV onderscheiden zich door een polyhedrale rooster van clathrine die jassen de blaasje membraan en fungeert als een mechanische steiger. Clathrine jassen worden geassembleerd tijdens de vesicles van individuele clathrine triskelia, de oplosbare vorm van clathrine bestaat uit drie zware en drie lichte keten subeenheden ^7,8. Omdat de triskelion niet de mogelijkheid om direct te binden aan het membraan, clathrine-bindend adapters zijn van cruciaal belang voor de vorming clathrine rooster link naar het membraan door associatie met lipiden en / of membraaneiwitten ^9. Adapters Ook pakket transmembraan eiwit lading, zoals receptoren, en kunnen communiceren met elkaar en met andere componenten van het CCV formatie machines ^9.

Meer dan twintig clathrine adapters zijn beschreven, een aantal betrokken zijn bij clathrine gemedieerde endocytose en anderen lokaliseren op de trans Golgi netwerk of endosomen ^9. Met uitzondering van HIP1R (gist Sla2p), alle bekende clathrine adapters binden aan de N-terminal-propeller domein van de zware keten clathrine ^9. Clathrine adapters zijn modulair eiwitten die bestaan ​​uit gevouwen domeinen met elkaar verbonden door ongestructureerde flexibele linkers. Binnen deze linker regio's, korte bindingsmotieven bemiddelen interacties met de clathrine N-terminale domein of andere onderdelen van de vesicles machines ^9. Twee verschillende clathrine-bindende motieven zijn gedefinieerd: de clathrine-box en de W-box ^9. De consensus clathrine-box sequentie werd oorspronkelijk gedefinieerd als L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] ^10, maar varianten zijn vervolgens ontdekt ^11. De W-box voldoet aan de volgorde PWxxW (waarbij x is een residu).

Sla1p (Synthetic Lethal met actine bindend eiwit-1) werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een actine geassocieerd eiwit en is nodig voor een normale actine cytoskelet structuur en dynamiek op endocytische sites in gistcellen ^12. Sla1p bindt ook de NPFxD endocytische sorteer-signaal en is van cruciaal belang voor de endocytose van de lading met het NPFxD signaal ^13,14. Meer recent, Sla1p werd aangetoond dat clathrine te binden door middel van een motief lijkt op de clathrine box, LLDLQ, aangeduid als een variant clathrine-box (VCB), en om te functioneren als een endocytische clathrine adapter ^15. Daarnaast is Sla1p uitgegroeid tot een veel gebruikte marker voor de endocytische vacht in levende cellen fluorescentie microscopie studies ^16. Hier gebruiken we Sla1p als een model om benaderingen voor adapter-clathrine interactiestudies te beschrijven. Wij richten ons op levende cellen fluorescentie microscopie, GST pull-down, en co-immunoprecipitatie methoden.

Protocol

1. Oprichting van een GFP-tag en selecteerbare marker in de SLA1 gen

Breng de Longtine methode ¹⁷ om een GFP-tag direct zekering aan het 3 'einde van de SLA1 gen open reading frame (Sla1p C-terminus) en tegelijkertijd markeren het gen met de E. coli Kan ^r gen dat zorgt voor G418 selectie.

1. Het genereren van een DNA-fragment door PCR gebruikt als een sjabloon het plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 ¹⁸ en de volgende primers: voorwaartse, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG GGA TTT TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', en omgekeerd, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. De onderstreepte volgorde komt overeen met de SLA1 gen specifieke segment onmiddellijk voorafgaand aan (voorwaartse primer) en na het stopcodon (reverse primer). Isoleer het PCR-product door agarose gelelektroforese gevolgd door DNA-zuivering.
2. Bereid een 50 ml cultuur S. cerevisiae SEY6210 stam (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, SUC2-Δ9 GAL-MEL) ¹⁹ in YPD, groeit in de vroege logaritmische fase (OD ₆₀₀ = 0,2 tot +0,6). Spin bij kamertemperatuur gedurende 3 min bij 2000 xg, twee keer wassen met steriel water.
3. Transformeren van de PCR-fragment verkregen in stap 1 in de cellen met behulp van de lithium-acetaat procedure ^20. Was de cellen met 1 ml steriel water, voeg 1 ml YPD en incubeer gedurende 4 uur bij 30 ° C in een shaker.
4. Spreid de cellen op YPD-G418 platen te selecteren voor de G418-resistente transformanten, incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Pick kolonies en streep ze op YPD-G418 platen.
5. Met behulp van kolonie-PCR, identificeren transformanten waarin het GFP-kan-module goed was met de SLA1 gensequenties geïntegreerd door homologe recombinatie. Gebruik een voorwaartse primer dat anneals binnen de SLA1 open reading frame en een reverse primer die anneals in het GFP-kan-module. Identificeer kolonies die PCR-producten hebben de verwachte grootte en controleer door sequentiebepaling.
6. Het scherm van de kolonies door middel van fluorescentie microscopie om te bevestigen dat zij hebben GFP fluorescentie.

2. Mutatie van de variant clathrine box (VCB) in de SLA1 gen

1. Introduceer een LLDLQ te AAALQ mutatie in het gen SLA1 (nucleotiden 2407-2415) naar aanleiding van een benadering in twee fasen ^15.
2. Ten eerste versterken SLA1 nucleotiden 1207-1410 en 2427-2589 door middel van PCR en kloon van de fragmenten in Notl / BamHI en EcoRI / Sall plaatsen van pBluescriptKS, respectievelijk.
3. Subkloon in de BamHI / EcoRI plaatsen een PCR-fragment met URA3.
4. Klieven van de resulterende plasmide met Notl / Sali, isoleren van de URA3 fragment door gel zuivering, en breng dit door lithium acetaat transformatie naar de Sla1-GFP stam gegenereerd in deel 1, of in TVY614 (MATA ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 PEP4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) ^21.
5. Spreid de cellen op aangevuld met SD-platen ontbreekt uracil. Bevestig door kolonie-PCR en sequencing dat de Ura + koloniën goed geïntegreerd URA3 bevatten vervanging van de VCB fragment.
6. In een tweede stap, subkloon SLA1 nucleotiden 1207-2589 in Notl / Sall plaatsen van pBluescriptKS. Met behulp van de QuickChange-XL plaats-gerichte mutagenese kit (Stratagene), muteren van de VCB residuen LLDLQ naar AAALQ. Controleer door sequentiebepaling.
7. Klieven van de resulterende construct met BsgI / Agel, en isoleren van de mutant WCV bevattende fragment door gel zuivering. Cotransform de BsgI / Agel fragment met pRS313 (HIS3) ²² in de stam verkregen in deel 2.3.
8. Spreid de cellen op aangevuld met SD-platen ontbreekt histidine. Replica-plate Zijn + kolonies op agar medium met 5-fluorotic zuur naar cellen waarin het mutante sequenties vervangen URA3, waardoor regeneratie van de sla1 gen met de LLDLQ om AAALQ mutatie (sla1 ^AAA) te identificeren. Bevestig door kolonie-PCR en sequencing.

3. Fluorescentie microscopie

1. Groeien de giststammen Sla1-GFP en sla1 ^AAA-GFP gegenereerd in deel 1 en 2 in 4 ml aangevuld met SD-media bij 30 ° C in een rotator in het donker tot aan een OD ₆₀₀ = 0,1-0,4. Spin 1 ml van de cultuur in microcentrifugepuls bij 4.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Gooi ~ 950 ul supernatant. Resuspendeer cellen in de resterende vloeistof (~ 50 ul).
2. Borg 3 ul van de celsuspensie op een microscopie glijbaan en afdekken met een glazen dekglaasje aan. Bescherm het monster tegen licht.
3. Mount dia op een 100x olie-immersie objectief van een spinning-schijf confocale microscoop.
4. Zoek de juiste brandvlak van cellen met behulp van helderveld verlichting of 488 nm laser met de nodige filters te prikkelen en te ontdekken fluorescentie van GFP.
5. Capture time-lapse beelden van Sla1-GFP en sla1 ^AAA-GFP in cellen met een belichtingstijd van 500 ms (of passende waarde) op eenn interval van een beeld per seconde gedurende 150 seconden. Verwacht resultaat: GFP gelabelde puncta zal verschijnen op de binnenkant van de beperking van membraan van de cel, blijven gedurende enkele seconden, en verplaats naar het midden van de cel als het signaal snel verdwijnt (met vermelding van vacht demontage).
6. Selecteer een deel van een beeld waarin plekken worden gezien om te verschijnen, gedurende enkele seconden blijven, en verdwijnen. Crop dit gedeelte van het beeld voor elk frame van de time-lapse beelden.
7. Genereer een kymograaf vertegenwoordigt dit deel van de afbeelding in elk frame van de 150 seconden time-lapse beeld door het uitlijnen van de frames langs een as die overeenkomt met de verstreken tijd.
8. Bereken de duur van elke plek op basis van het aantal seconden (time-lapse frames) de vlekken aanwezig is in de kymograaf. Merk op dat elke plek moeten de "curve" in de richting van het inwendige van de cel als het verdwijnen is, als gevolg van endocytose en demontage van de vacht.
9. Vergelijk wild-type Sla1-GFP met sla1 ^AAA-GFP. Herhalen om te bepalen of de resultaten statistisch significant. Verwacht resultaat: sla1 ^AAA-GFP plekken aanhouden significant langer (~ 80 sec) dan wild type (~ 30 sec) duidt op een defect in de vacht vorming van ^15.

4. De voorbereiding van gist cytosolische extract en de totale cel extract

1. Inoculeren 3 liter YPD met een geschikte giststam, zoals TVY614 ^21, en ​​groeien bij 30 ° C in een incubator shaker tot het bereiken van een OD ₆₀₀ = 1-2.
2. Centrifugeer de gistcultuur bij kamertemperatuur gedurende 20 min bij 3700 x g. Verwijder het supernatant, voeg 3-5 ml steriel water, en de pipet op en neer totdat de pellet volledig geresuspendeerd.
3. Giet ~ 150 ml vloeibare stikstof in een 250 ml plastic beker. Flash-bevriezing van de gist door het toevoegen van druppelsgewijs in de vloeibare stikstof in een cirkelvormig patroon om agglutinatie van de bevroren pellets te vermijden. Laat niet de pellets dooi, voeg meer vloeibare stikstof indien nodig.
4. Chill een roestvrijstalen blender container door gieten vloeibare stikstof in. Laat de vloeibare stikstof om bijna volledig verdampen. Voeg de bevroren gist pellets aan de koude blender container. Sluit de blender container met een koud rubber stop en maal de gist pellets gedurende 10 seconden. Keer de container 3-4 keer om inhoud te mengen en twee keer herhaal de malen stap. De grond bevroren gist hebben een poeder-achtige uitstraling.
5. Chill een trechter en een 50 ml conische buis met vloeibare stikstof. Met behulp van de koude trechter, de overdracht van de grond gist op de buis. De bevroren grond gist kan bewaren bij -80 ° C of onmiddellijk worden gebruikt.
6. Voor het verkrijgen van een cytosolische extract voor de GST-fusie-eiwit affiniteit assay (deel 5), gewicht 3 g bevroren grond TVY614 gist op in een 15 ml conische buis en resuspendeer in 3 ml op kamertemperatuur buffer A (10 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) met protease-remmer cocktail (Sigma).
7. Cap en draai de buis een paar keer totdat het volledig ontdooid en vervolgens op ijs gezet.
8. Ultracentrifuge het extract bij 4 ° C gedurende 20 minuten op 300.000 x g. Breng voorzichtig de supernatant (cytosolische extract) op een conische buis met behulp van een pipet, zonder de pellet te verstoren. Houd de cytosolische extract op ijs.
9. Voeg 100 ul van een 50% (v / v) glutathion-Sepharose slurry in buffer A. Het is handig om aan het einde van de tip gesneden ter vergemakkelijking van pipetteren de kralen. Draaien bij 4 ° C gedurende 15 minuten, spin-down de parels door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 2 min bij 1000 xg, en breng de supernatant (cytosolische extract) naar een nieuwe buis. Reserve 50 ul van het extract voor de invoer te controleren.
10. Voor het verkrijgen van totale cel extracten voor co-immunoprecipitatie experimenten (deel 6), gebruik stam TVY614 (WT SLA1), de sla1 ^AAA stam die een LLDLQ om AAALQ mutatie gegenereerd in deel 2 in TVY614 achtergrond, en een sla1 stam die een deletie van het SLA1 gen zoals GPY3130 ^23. Gewicht 2 g van de overeenkomstige bevroren grond gist in conische buizen en ze in 2 ml van de buffer op kamertemperatuur mengen A, met proteaseremmer cocktail (Sigma) en 2% Triton X-100.
11. Cap en draai de buis een paar keer totdat het volledig ontdooid en vervolgens op ijs incubeer gedurende 10 minuten, regelmatig mengen door inversie.
12. Overdracht van het materiaal microcentrifugebuizen en spin bij 4 ° C gedurende 15 min bij 16.000 xg (topsnelheid in microcentrifugepuls). Breng voorzichtig de supernatant (totale cel extract) tot een conische buis op ijs met behulp van een pipet, zonder de pellet te verstoren.
13. Voeg 100 ul van een 50% (v / v) proteïne A-Sepharose slurry in buffer A. Draai bij 4 ° C gedurende 15 min, spin-down de parels door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 2 min bij 1000 xg, en overdracht het supernatant (totaal extract) naar een nieuwe buis. Reserve 50 ul van het extract voor de invoer te controleren.

5. GST-fusie-eiwit affiniteit assay

1. Amplify door PCR een fragment containing van de Sla1p variant clathrine-box (VCB) (residuen 803-807), kloon het in pGEX-5X naar pGEX-5X-VCB te verkrijgen. Controleer door sequentiebepaling.
2. Met behulp van pGEX-5X-VCB als een template en de QuickChange-XL plaats-gerichte mutagenese kit (Stratagene), muteren van de VCB residuen LLDLQ om AAALQ te pGEX-5X-vCBmut te verkrijgen. Controleer door sequentiebepaling.
3. Express GST en de fusie-eiwitten GST-VCB en GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), zuiveren met behulp van glutathion-Sepharose, elueren uit de kralen met een gereduceerd glutathion, dialyze tegen PBS, en bepaal eiwitconcentratie.
4. Label 3 Reactievaatjes: GST, GST-VCB en GST-vCBmut, en voeg 1 ml PBS, 30 pi van een 50% (v / v) glutathion-Sepharose slurry in buffer A, en 50 ug van dialized GST, GST VCB-of GST-vCBmut fusie-eiwitten.
5. Draaien bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten te laten voor de binding.
6. Was de kralen 2 keer met PBS en een keer met buffer A. Voeg 1 ml van gist cytosolisch extract - bereid zoals beschreven in deel 4 - aan elke buis.
7. Draai de buizen 1 uur bij 4 ° C, spin 10 sec bij 5000 xg om pellet de kralen, gooi supernatant, en al snel was de kralen 3 keer met buffer A die 0,1% Triton X-100, en 1 keer met buffer A.
8. Spin down de kralen nog een keer en het gebruik van een gel laad-tip zo veel vloeistof te verwijderen als mogelijk. Op dit punt van de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C om verder te gaan op een later tijdstip.
9. Voeg 15 ul van 2x Laemmli sample buffer aan elke buis, incuberen bij 96 ° C gedurende 5 min, en spin 10 sec bij 5000 x g.
10. Het analyseren van de monsters door immunoblotting met behulp van een antilichaam tegen het clathrine zware keten. Verwachte resultaten: clathrine bindt aan GST-VCB, maar niet om GST-of GST-vCBmut. Ook de monsters analyseren door SDS-PAGE vergelijkbare belasting van de GST fusie-eiwitten te bevestigen.

6. Co-immunoprecipitatie assay

1. Label 3 microcentrifugebuizen: WT (wild-type SLA1), sla1 ^AAA, en sla1Δ, en voeg 1 ml PBS, 30 pi van een 50% (v / v) proteïne A-Sepharose slurry in buffer A, en 2 ug van een konijn anti-Sla1p antilichaam.
2. Draaien bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
3. Twee keer was de kralen met PBS en een keer met buffer A met 1% Triton X-100.
4. Voeg 1 ml van de overeenkomstige totale gistextracten bereid in deel 4: SLA1, sla1 ^AAA, en sla1Δ. Draai 1 uur bij 4 ° C.
5. Spin 10 sec bij 5000 xg om pellet de kralen, gooi supernatant, en al snel was de kralen 3 keer met buffer A die 0,1% Triton X-100, en 1 keer met buffer A.
6. Spin down de kralen nog een keer en het gebruik van een gel laad-tip zo veel vloeistof te verwijderen als mogelijk. Op dit punt van de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C om verder te gaan op een later tijdstip.
7. Voeg 15 ul van 2x Laemmli sample buffer aan elke buis, incuberen bij 96 ° C gedurende 5 min, en spin 10 sec bij 5000 x g.
8. Het analyseren van de monsters door immunoblotting met behulp van een antilichaam tegen het clathrine zware keten. Verwachte resultaten: clathrine co-immunoprecipitaten met wild-type Sla1p, maar niet om met sla1 ^AAA, of in de sla1Δ monster.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1. Analyse van de Sla1p clathrine adapter op endocytische plaatsen door live-cell fluorescentie microscopie. Een frame (links) uit een video en de bijbehorende kymographs (rechts) van gist cellen die Sla1-GFP of sla1 ^AAA-GFP die een LLDLQ te AAALQ mutatie. Zowel de wild-type en mutant Sla1-GFP werd tot expressie gebracht van de endogene SLA1 locus. Endocytische sites worden waargenomen als lichtpuntjes verspreid in de cel periferie (links beelden). Het gebied tussen de witte lijnen overeen met de regio waar kymographs werden gegenereerd. Films werden genomen op een frame rate van 1 frame / sec. Let op de langere levensduur van Sla1-GFP in de LLDLQ om AAALQ mutant (sla1 ^AAA) in vergelijking met wild type (SLA1).

Figuur 2. Fysieke interactie tussen clathrine en de Sla1p-variant clathrine box. GST gefuseerd aan fragment aa798-813 met daarin de volgorde LLDLQ (GST-VCB), de bijbehorende AAALQ mutant (GST-vCBmut), of GST alleen (GST) Sla1p waren gebonden aan glutathion-Sepharose kralen en geïncubeerd met een cytosolische extract van wild- soort gistcellen. De bijbehorende eiwitten werden geëlueerd en geanalyseerd door immunoblotting (IB) voor clathrine zware keten.

Discussion

Clathrine-gecoate blaasjes (CCV) deelnemen aan endocytose en vervoer van het trans Golgi netwerk en endosomen, geconserveerd paden die fundamenteel zijn voor eukaryote cel biologie. De benaderingen beschreven in dit document methoden zijn nuttig om de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het CCV vorming, in het bijzonder interacties tussen eiwitten en adapter clathrine te bestuderen. GST-fusie-eiwit affiniteit en co-immunoprecipitatie assays laten testen voor de fysieke relatie tussen een adapter (kandidaat) en clathrine. GFP-tagging en fluorescentie microscopie beeldvorming vergunning dynamische studies in levende cellen. Gistcellen in het bijzonder biedt het voordeel van eenvoudige genetische manipulatie van tags en mutaties te introduceren in de adapter endogene gen houdt dus vast een normale expressie regulatie van de gelabeld / gemuteerde eiwit. Ook kan clathrine of andere componenten van het CCV worden gelabeld met RFP of andere fluorescerende eiwitten aan dual imaging studies te vergemakkelijken in levende cellen ^16.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit	Stratagene
protease inhibitor cocktail	Sigma