باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

Summary

والعدوى المتزامنة مع فيروس الأنفلونزا A هو واحد من العوامل المتورطة في تحريض أمراض الرئوية الغازية خلال أعراض

Abstract

خلال وباء فيروس الإنفلونزا عام 1918 ، التي قتل فيها ما يقرب من 50 مليون شخص في العالم ، كانت الغالبية العظمى من القتلى لم يكن نتيجة للعدوى بفيروس الانفلونزا وحدها. بدلا من ذلك ، يعتقد معظم الأفراد أن يستسلم لعدوى بكتيرية ثانوية ، والناجمة في الغالب عن بكتيريا المكورات العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و). وقد تم لاحقا علاقة التعاون بين العدوى الناجمة عن فيروس الإنفلونزا والمكورة الرئوية والتي لوحظت خلال 1957 جائحة فيروس الآسيوية ، وكذلك أثناء الفاشيات الموسمية من فيروس (مراجعة في ^{2 ، 1).} هنا ، نحن تصف بروتوكول يستخدم لتحقيق هذه الآلية (ق) التي يمكن أن تشارك في زيادة معدلات الإصابة بالمرض نتيجة لفيروس انفلونزا المتزامنة وس. الرئوية العدوى. وقد طورنا نموذجا لموثوق الفئران الرضع والتظاهر بتكاثر آثار عدوى فيروس الانفلونزا من الفئران مع المستعمر س. الرئوية. باستخدام هذا البروتوكول ، وقدمنا ​​رؤية واضحة لأول مرة في حركية انتقال الالتهاب الرئوي بين المشارك يضم الفئران حديثي الولادة به في مجال التصوير فيفو ^3.

Protocol

1. إعداد ألبوم المعدية س Bioluminescent الرئوية

1. تلقيح أنبوب مكارتني تحتوي 10ML تود هيويت مرق تستكمل مع 0.5 ٪ (W / V) مستخلص الخميرة وقطعة صغيرة من الدم مع آغار S. bioluminescent وتنمو بشكل ثابت الرئوية عند 37 درجة مئوية إلى الكثافة البصرية (ل 600Nm) من 0،40-0،45.
2. وضع الثقافة على الجليد الرطب لمدة 5 دقائق لإلقاء القبض على خلايا النمو في هذه المرحلة.
3. في 10 مل من منتصف سجل النمو S. المرحلة الرئوية إضافة 1 مل من 80 ٪ (V / V) والجلسرين المزيج ، قسامة في وحدات التخزين المطلوبة وتخزينها في -70 درجة مئوية.
4. تحديد الجرعة المعدية التي تصيب S. bioluminescent الرئوية عدد الأسهم القابلة للحياة التخفيفات المسلسل على لوحات أجار الدم.

2. النمو وإعداد الأنفلونزا فيروس A الأسهم

1. ويزرع فيروس الانفلونزا في السائل السقائي من 10 يوما القديمة بيض الدجاج المحتوي.
2. أذاب قارورة مع فيروس الأنفلونزا في حمام الماء 37 درجة مئوية.
3. استخدام مصدر الضوء وضعت أكثر من علامة airsac (تشميع) على قشرة البيضة الموقع من كيس الهواء عند نقطة خالية من الأوردة الأساسية.
4. تطهير سطح البيض بواسطة المسح مع الايثانول 70 ٪ والقضاء نظيفة.
5. بيرس ثقب صغير في كيس الهواء مباشرة فوق علامة استخدام الكاتب لصائغ.
6. مع البيض وضعه في علبة مع كيس الهواء العلوي ، واستخدام حقنة 13mm 1mL وإبرة 26G لتلقيح كل بيضة من خلال ثقب في وعاء مع 0.1mL من انفلونزا فيروس مخفف بشكل مناسب. نقطة الإبرة أسفل مباشرة في جوف السقاء ، ثقب airsac.
7. ختم الحفرة مع ذاب الشمع واحتضان البيض لمدة 2 أيام في حاضنة البيض مرطب على 35 درجة مئوية. بعد 2 أيام الشموع ، وحضانة البيض للتحقق من وجود الأوعية الدموية لتأكيد الجنين لا يزال حيا. إذا كان البيض من السود في الداخل ، وقد توفي الجنين ويجب التخلص من البيض وعدم استخدامها للحصاد من فيروس الانفلونزا.
8. وضع البيض على 4 درجات مئوية ليلا لقتل الأجنة وانقباض الأوعية الدموية من أجل الحد من تعطل السفن ، والاتصال بين الفيروس في الدم ويؤدي إلى ربط الفيروس إلى خلايا الدم الحمراء.
9. في اليوم التالي ، تطهير سطح البيض بواسطة المسح مع الايثانول 70 ٪.
10. عمل في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية لجمع السائل السقائي تحتوي على فيروس الأنفلونزا A من البيض. إزالة الشمع واستخدام مقص لقطع منحنية حول الجزء العلوي من البيضة لإزالة كيس الهواء فوق الغشاء السقائي.
11. ثقب وقشر العودة الغشاء السقائي باستخدام ملقط معقم.
12. نضح السائل السقائي مع ماصة 10ML العقيمة بينما يمسك الجنين الى جانب واحد مع آخر ماصة معقمة. جمع السائل السقائي المجمعة في 50mL أنابيب والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات. إذا كان السائل هو السقائي الدموي أو يحتوي على صفار لا تضيف إلى التجمع.
13. السائل السقائي الطرد المركزي ل2000 دورة في الدقيقة في 5min في درجة حرارة الغرفة لازالة الحطام.
14. قسامة السائل السقائي المعدية في 1-2 cryotubes مل وتخزينها في -70 درجة مئوية.
15. تحديد الأنفلونزا من عيار الفيروس من السائل السقائي مذوبة في 3 فحوصات لوحة يؤديها بشكل مستقل يتشكل في مدين ، داربي خلايا الكلى الكلبي (أنظر أدناه). استخدام قسامة جديدة من الفيروس في كل تجربة. ولن يتكرر تجميد ذوبان تقلل من عيار العدوى.

3. عدوى الأنف من الفئران مع S. bioluminescent الرئوية و / أو فيروس الانفلونزا

1. تحسن الاسهم المجمدة س bioluminescent الرئوية وتمييع للجرعة المطلوبة في برنامج تلفزيوني.
2. اختيار برفق 5 الفئران من العمر يوما بين السبابة والإبهام والاستمرار في وضع مستقيم. استخدام ماصة لإسقاط bioluminescent S. الرئوية على فتحتي الأنف في حجم 3μl. الانتظار حتى يتم استنشاق كل قيحة قبل وضع الماوس مرة أخرى في قفص. استخدام 3μl من برنامج تلفزيوني للعدوى وهمية.
3. ثلاثة إلى تسعة أيام بعد الاستعمار مع S. bioluminescent الرئوية ، أذاب an قسامة من السوائل التي تحتوي على السقائي الأنفلونزا من الفيروسات وتمييع في برنامج تلفزيوني الى التركيز المطلوب. تصيب الفئران بفيروس الأنفلونزا في حجم PBS 3μl كما هو موضح في الخطوة 3.2. استخدام السائل السقائي 3μl المخفف من البيض غير مصاب وهمية لعدوى الفيروسات.
4. رصد رفاه الفئران يوميا من خلال مراقبة مظهرهم وسلوكهم ، وحالة الجسم في الفئران التي ≤ 3 أيام العمر ، ووجود بقع الحليب. وينبغي وضع دليل للنقاط النهاية إنسانية ومعايير التدخل في التشاور مع طبيب بيطري الحيوان المعملية (الجدول 3).

4. Bioluminescent التصوير باستخدام الطيف IVIS (الفرجار علوم الحياة)

1. تحضير مزيج من الكيتامين بنسبة 0.75 مل / ملغ و 1.76mg/ml زيلازين في الماء عن طريق الحقن.
2. لتخدير الفئران ، وضخ 100μl/10 في وزن الجسم ز البريتونيالتجويف.
3. مكان الفئران مخدرة في مربع التصوير. وينبغي إيلاء اهتمام دقيق لإبقاء المنطقة التشريحية للاهتمام مواز إلى الكاميرا عند وضع الماوس داخل منطقة الجزاء التصوير / غرفة.
4. مربع مكان مع الفئران في IVIS والسماح بدخول isoflurane في مربع عند 0.5 لتر / دقيقة للحفاظ على التخدير.
5. تعيين IVIS آلة لتصحيح منصة التصوير والتقاط الصور وbinning لمدة 7 دقائق.
6. الفئران تسمح للتعافي من التخدير في مربع حرارة (مثل استخدام لوحة الحرارة) قبل ان يعود الى قفص المنزل.
7. ويتم تحليل الصور وتعديلها لنفس النطاق باستخدام البرنامج صورة حية حزمة الإصدار 3.0 (الفرجار علوم الحياة).
8. ويمكن قياس اشارات Bioluminescent في منطقة مختارة من الفائدة ، إذ تدفق إما الإجمالي (فوتون / ق) أو متوسط ​​الاشعاع (الفوتونات / ق / سم ² / ريال سعودي).

5. معالجة الأنسجة لتحديد الحمولة البكتيرية والفيروس عيار

1. وeuthanased الفئران خنقا ₂ أكسيد الكربون والفراء تطهيرها باستخدام الايثانول 70 ٪.
2. شل الحيوان على لوح التقطيع الثابت.
3. باستخدام شفرة مشرط معقم ، وقطع طريق في منتصف الرأس من الحيوان ، بدءا الخلفي ، وفضح البلعوم الأنفي عن طريق الانحناء كل جانب من الخارج الرأس.
4. جمع أنسجة البلعوم من كل حيوان عن طريق كشط النسيج من كل نصف الرأس باستخدام ملقط معقم ووضعه في RPMI الجليد الباردة 1.5mL. تبقي على الجليد.
5. تفتح في تجويف الصدر وإزالة باستخدام مقص الرئتين باستخدام ملقط معقم والمقص. شطف الرئتين ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لإزالة أي دم ، وجمع في RPMI الجليد الباردة 1.5mL. تبقي على الجليد.
6. استخدام homogeniser إلى تجانس الأنسجة والمكان مرة أخرى على الجليد.
7. إزالة قسامة من النسيج المتجانس واستغلال هذا لتحديد الحمولة الجرثومية. تحضير التخفيفات التسلسلي للجناسة الأنسجة وطبق على HBA. لوحات الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة ، وتحديد عدد قابلة للحياة. ثم يمكن التتر البكتيرية في جهاز خاص يمكن ربطها مع عدد من الفوتونات التي لوحظت في تلك المنطقة.
8. الطرد المركزي بقية الأنسجة المتجانس في 3500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف جمع ونقل إلى أنابيب ونظيفة ومعقمة. طاف في تخزين -70 درجة مئوية ، وتحديد عيار الفيروسية بواسطة فحص اللوحة.

6. مقايسة لوحة لتحديد فيروس الأنفلونزا من عيار الخليط في الأنسجة

1. ويتم تحديد التتر العدوى الفيروس عن طريق تشكيل لوحة على monolayers متموجة الكلى الكلاب مدين - داربي (MDCK) الخلايا. يتم تربيتها بشكل روتيني في الخلايا MDCK RF10 (الجدول 1) في زجاجات زراعة الأنسجة (نونك) وعندما passaged متموجة.
2. فصل الخلايا MDCK من زجاجات زراعة الأنسجة باستخدام التربسين. غسل الخلايا في RF10 وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في مكعبات RF10. عد الخلايا باستخدام MDCK عدادة الكريات وصبغ الحيوية. كل البذور 35mm جيدا 6 - جيدا لوحات (نونك) مع خلايا 1.2x10 ⁶ MDCK في 3ml RF10 والثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ إلى تحقيق confluency (في ال 24 ساعة ~).
3. إعداد وسائل الاعلام يبوفيتش dsL15 و 1.8 ٪ (ث / ت) agarose تراكب وسائل الاعلام (الجدول 1). قسامة dsL15 وسائل الإعلام ، و 1.8 ٪ (W / V) في agarose 50mL في زجاجات معقمة. إبقاء dsL15 وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية حتى درجة مئوية وتستخدم في 56 agarose حتى الاستخدام.
4. تأكد من أن الخلية monolayers MDCK ومتكدسة وغسل الخلايا مع + RPMI بواسطة الشفط وRF10 واستبدالها ~ 1.5ml RPMI +. وينبغي في أي مرحلة من مراحل الإجراء يسمح لوحات لتجف تماما. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية حتى على استعداد لإضافة العينات التي تحتوي على الفيروس.
5. تحضير التخفيفات التسلسلي للعينات الفيروس في RPMI +. تبقي العينات في الثلج حتى الاستخدام.
6. نضح RPMI + من monolayers وإضافة 135uL RPMI + من التخفيفات المناسبة من عينة الفيروس في كل بئر. اختبار كل عينة في مكررة.
7. احتضان خلايا MDCK مع عينات من الفيروس لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2. يهز بلطف لوحات كل 15 دقيقة لتوزيع الفيروس بشكل متساو ومنع جفاف monolayers MDCK الخلية.
8. نقل agarose من 56 درجة مئوية إلى 46 درجة مئوية بالحمام المائي ودافئة dsL15 وسائل الاعلام الى 46 درجة مئوية في بالحمام المائي.
9. بعد 45min حضانة للفيروس على monolayers MDCK ، تأخذ لوحات من أصل 5 ٪ CO ₂ الحاضنة. إزالة agarose وسائل الإعلام L15 من 46 درجة مئوية بالحمام المائي. إضافة 0.2mL التربسين من 0.1 ٪ إلى 50mL dsL15 من وسائل الإعلام ، من إضافة 50mL من dsL15 + التربسين 50mL إلى 1.8 ٪ (W / V) agarose. مزيج agarose وL15 بلطف وإضافة 3mL المتوسطة التراكب إلى كل بئر من لوحات 6 - جيدا. بلطف تتناول دوامة لضمان كامل المونولاير MDCK الخلية. بمجرد أن يتم تعيين لوحات احتضان تراكب في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ لمدة 2-4 أيام.
10. في نهاية فترة الحضانة ، حساب عدد لويحات كمقياس للفيروس infectiviتاي. إذا لزم الأمر ، يمكن تصور أن تكون لويحات التي تلطيخ من monolayers مع البنفسجي الكريستال الذائبة في الميثانول.

7. الفرع جيم -- أسرار النجاح :

1 جميع الأعمال التجريبية مع س. يتم تنفيذ الرئوية (التلقيح مثلا الثقافات السائل ، ومعالجة الأنسجة من الفئران المصابة الرئوية س) في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية الأحيائية.

1.1 نخلق bioluminescent س. سلالات الرئوية عن طريق إدخال البلازميد pPJTG28 ^3. ومع ذلك ، تشكيلة واسعة من مختلف S. bioluminescent سلالات الرئوية متاحة 4-6. Bioluminescent S. ويمكن أيضا سلالات الرئوية يمكن شراؤها من شركة الفرجار العلوم الحياتية (MA ، الولايات المتحدة).

حركية النمو 1.1 من مختلف S. قد تختلف سلالات الرئوية وينبغي أن تحدد لكل سلالة. قد يستغرق ما بين 3 إلى 4 ساعات للوصول إلى OD600nm = ،4-0،45.

1.4 ونتوقع عادة مخزونات المعدية للوصول إلى تركيز 10e8 CFU / مل وتوصي مجموعة التخفيف من 4 إلى 8 - 10E - 10E لتحديد تركيز البكتيريا قادرة على البقاء.

2.6 عيار المناسبة لاستخدامها لتلقيح البويضة ، ويعتمد على سلالة الفيروس المستخدمة ، ويمكن أن تتراوح بين 3 إلى 5 - 10E - 10E. أحيانا قد الأنفلونزا من سلالات الفيروس تم الحصول عليها من supernatants زراعة الأنسجة يمكن استخدام أنيق.

3.2A نستخدم بشكل روتيني 2000 CFU س. EF3030 الرئوية سلالة فئران لاستعمار القديم يوم 5 ^3. يتم تحديد جرعة دقيقة لقيحة المعدية بأثر رجعي لكل تجربة من قبل الطلاء التخفيفات المتسلسلة من اللقاح على لوحات الخيول آغار الدم. قدرة س. يجري أولا تحديد الرئوية سلالة فئران لاستعمار من قبل عدد من الخليط قابلة للحياة الأنسجة (مثلا البلعوم الأنفي والرئتين) في الوقت عدة نقاط بعد تلقيح الفئران.

3.2b وليس من الضروري استخدام anaestetics لإدارة البكتيريا أو الفيروس إلى الحيوانات عن طريق الاستنشاق. وينبغي تقييده الفئران الرضع (وكذلك الفئران الكبار) من جهة ، وعقد تستقيم من قبل المحقق ، ثم يتم إسقاط قيحة (3 ميكروليتر عن الفئران الرضع ، وتصل إلى 10 ميكروليتر لفئران بالغة) على فتحتي الأنف واستنشاق كل قيحة ما تؤكده الملاحظة.

3.2c إزالة الفئران حديثي الولادة واحدا تلو الآخر من العش وتلقيح بالبكتريا أو الفيروس حسب الحاجة. علامة ذيل الحيوان باستخدام علامة دائمة إذا الحيوانية اللازمة والعودة الى قفص فورا. فرك مع بعض المواد الحيوانية الفراش حتى أن السد لن يقبل بالعودة الى الجراء العش. ملاحظة : علامة دائمة التدليك قبالة الحيوانات بسرعة ويحتاج إلى إعادة تطبيق اليومية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نظام الوشم لتحديد الحيوانات الفردية.

3.3 نحن نستخدم 20 PFU فيروس الأنفلونزا A Udorn/307/72 (H3N2) ليصيب الفئران 8-14 يوم من العمر 3. والوفيات والمراضة التي لوحظت في الحيوانات تعتمد على سلالة من S. الرئوية والأنفلونزا يستخدم الفيروس. ويقدم الجدول 3 مجموعة مفيدة من نقاط النهاية إنسانية ومعايير التدخل لاستخدامها في الفئران الذين تقل أعمارهم عن 21 يوما من العمر. ونحن عادة لا الكشف عن أي وفيات أو الاعتلال عند استخدام س. EF3030 الرئوية والأنفلونزا وفيروس Udorn/307/72 سلالة (H3N2) عند الفئران هي> 10 يوما من العمر.

4.2 إلى أن تكون دقيقة ، ويمكن أن يكون وزنه قبل حقن الفئران من الحل مخدر. كدليل ، ويستخدم حوالي 50-75 microliters من محلول مخدر للفئران عمرها 20 يوما. الفأر هو تخدير تماما عندما لا يستجيب لقرصة في الذيل أو أطرافه الخلفية. بينما في IVIS ، سيتم أيضا الفئران أن تتعرض لisoflurane الذي سيضيف التخدير. توقيت التصوير بعد العدوى من الفئران يعتمد على سلالة (ق) س. الرئوية والأنفلونزا وفيروس المستخدمة فضلا عن أعراض الفائدة. قد يؤدون بعض التجارب الرائدة لتحسين توقيت التصوير bioluminescent يكون ضروريا.

يمكن أن يكون إما 4.3 الفئران يوضع في خانة العزلة (التي تمنع الملوثات من الدخول أو الخروج من مربع) ، أو بدلا من ذلك ، يمكن وضعها مباشرة إلى أداة للتصوير. نستخدم مربع العزلة عن تجارب على الفئران الرضع ، من أجل ضمان بقاء الفئران مخدرة أثناء إجراء التصوير ومنع التلوث من IVIS مع س. الرئوية و / أو الأنفلونزا من الفيروس.

4.3 استخدام صورة البطنية من الفئران للحصول على صورة من الجهاز التنفسي. صورة جانبية للفأرة يوفر صورة أكثر حساسية من الأذنين.

4.4 عندما يتم وضع الفئران مباشرة الى غرفة ، يتم تسليم isoflurane للفئران عبر المخاريط الأنف. عن التجارب التي تستخدم فيها الفئران الرضع ، ويفضل مربع العزلة منذ المخاريط الأنف لا تتناسب على الفئران الرضع.

4.5 Tانه قد تعرض مجموع الوقت اللازم لالتقاط صورة تختلف بين التجارب وفقا لقوة الإشارة bioluminescent ، والموقع من سلالة ، إشارة البكتيرية وتستخدم سلالة الماوس. بخصوص هذا الأخير ، فإن كلا من الصباغ والفراء التخفيف بشكل كبير من إجمالي إشارة يمكن كشفها. الكاميرا على الطيف IVIS هي الخلفية ضعيفة ، مضاءة مرة أخرى CCD التي تقدم مجموعة واسعة النطاق الحيوي (65536 مستويات الرمادي). من الناحية المثالية ، ينبغي ضبط الوقت التعرض لالتقاط ما بين 60 و 60000 التهم. في تجربتنا مع C57BL / 6 الفئران ، وزيادة وقت التصوير بعد 7 دقائق لا يحسن بشكل ملحوظ من إشارة إلى نسبة الضوضاء. خيارات بديلة لزيادة اشارة bioluminescent تشمل زيادة درجة binning (أي والكبيرة) ، وباستخدام أصغر مجال الرؤية. الأهم ، لا ينبغي أن يقوم على تقدير داخل المناطق التي تحتوي على صورة بكسل المشبعة ، وهذا يوفر قيمة التقليل من أجل الكشف عن عدد من الفوتونات. إذا لم تكن متأكدا فيما يتعلق بشروط أفضل ، ويمكن استخدام هذه الميزة لصناعة السيارات في التعرض كمبدأ توجيهي.

يمكن إذا 4،5 إشارة قوية bioluminescent في جزء واحد من الماوس عرقلة الكشف عن تلألؤ بيولوجي في منطقة مجاورة ، ويمكن تغطية مناطق مختارة من الفأرة مع ورقة سوداء والتصوير المضي قدما بشكل طبيعي

4،7 إذا كميا في إشارة الانارة الفوتونات (مقابل التهم) الاختلافات في ظروف التصوير (مثل وقت التصوير) بين التجارب لن يؤثر على قياس إشارة bioluminescent.

4.8 في حالة استخدام التمويه لقياس مجموع الفوتونات في منطقة معينة ، وضمان أن يتم استخدام المنطقة "المصالح" على نفس الشكل لجميع العينات.

يمكن أن يتم التخلص 5.1a الفئران في أي نقطة زمنية بعد العدوى بفيروس الإنفلونزا ، اعتمادا على اهتمام الباحث. نحن عادة تحديد عيار البكتيرية والفيروسية في 6 أيام بعد الإصابة بفيروس إنفلونزا Udorn/307/72 فيروس A (H3N2) وليس لمراقبة أي وفيات / الاعتلال. ومع ذلك ، فإن معدلات الاعتلال والوفيات التي لوحظت في هذه التجارب تختلف تبعا لS.pneumoniae وتستخدم سلالة فيروس الانفلونزا ونقطة chosed الوقت يجب أن تأخذ معدلات الوفيات والمراضة بعين الاعتبار للحد من تأثير ذلك على رفاه الحيوان. الجدول 3 يوفر دليلا مفيدا لمعايير التدخل والنهاية إنسانية لاستخدامها في هذه التجارب. عموما ، والفئران والموت الرحيم والأنسجة المصنعة كما هو موضح في غضون 3 ساعات بعد في التصوير bioluminescent الجسم الحي.

5.1b الفئران الذين تقل أعمارهم عن 10 يوما القديمة تقاوم نقص الأكسجين والموت الرحيم بواسطة قطع الرأس. في الإعداد التجريبية وصفها ، الفئران ما لا يقل عن 14 يوما من العمر ، وربما يتم التخلص خنقا ₂ CO.

يجوز تكميل 5.7 آغار الدم لوحات مع الجنتاميسين 5μg/ml لمنع نمو البكتيريا المتعايشة في الخليط من الأنسجة الأنفية. سيقوم مجموعة من التخفيفات المستخدمة تعتمد على س. الرئوية السلالة المستخدمة. لإجراء التجارب على الفئران من العمر 20 يوما مع س. الرئوية سلالة EF3030 ، ونحن نستخدم أنيق ، 10E - 1 ، 10E - 10E 2 و 3.

5.8 تخزين كل عينة من النسيج المتجانس في اثنين على الاقل aliquots ، بحيث يتوفر نموذج احتياطية في حال فشل تجربة لوحة الفيروس! يمكن فقط عيار دقيقة فيروسية يمكن الحصول عليها من عينة إذابة مرة واحدة بعد تجميد العينات ولكن ليس من إذابة للتجمد مرارا وتكرارا.

عندما نمت 6.1 متموجة 9-10 ٪ ، واحد 150cm زراعة الأنسجة ² قارورة العائد MDCK خلايا كافية لوحات 6 - جيدا الخمسة.

وسوف 6.5 والتخفيف الأمثل المسلسل يعتمد على سلالة الفيروس المستخدمة ووقت بعد الإصابة. عادة ، سوف نستخدم أنيق ، 10E - 1 و 2 - 10E التخفيفات لهيئة الخليط تؤخذ 6 أيام بعد الإصابة بفيروس الأنفلونزا.

6.6 استخدام التخفيفات المتسلسلة من الأسهم الفيروس هو السيطرة الإيجابية المناسبة للاستخدام في كل فحص اللوحة. كعنصر تحكم السلبية ، يمكن استخدام RPMI +.

8. ممثل النتائج :

الشكل 1. رسم تخطيطي من بيضة الدجاج المحتوي.

الشكل 2. BLI س. الرئوية المصابة الماوس يوم 3 و 4 ايام بعد الاصابة بفيروس الانفلونزا وهمية.

الشكل 3. BLI س. الرئوية والأنفلونزا فيروس للمصابين الماوس يوم 3 و 4 ايام بعد الاصابة بفيروس الانفلونزا.

الشكل 4. الحمولة الجرثومية في الأنف من نفس واحدة وشارك العدوى.تيد الماوس.

الشكل 5. عيارات الفيروسية في الأنف والرئة ماوس للمصابين.

وسائل الاعلام	محتويات
1.8 ٪ (W / V) Agarose	إضافة 0.9 جرام من agarose ل50mL المقطر O 2 H ، تعقيم بواسطة التعقيم عند درجة 121 ل10min. نقل إلى 56 درجة مئوية بالحمام المائي لتبرد.
مضاعفة القوة ليبوفيتش L15 المتوسطة (DS L15)	يذوب 1 حقيبة من مسحوق L15 (لتعويض 1L) في 450 مل العقيمة المقطر O 2 H وأثارت حتى المنحل. يتم ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك 1M. ثم تكملة مع 4mL 7 ٪ (W / V) NaHCO3 ، 0.4mL HEPES (0.5M ، ودرجة الحموضة 6.8) ، 200 U / البنسلين مل و 200 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، 60 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. ضبط الحجم النهائي لتصفية 500ml وتعقيم.
الحصان آجار الدم (HBA)	4 HBA ٪ (Oxoid ، باسينجستوك ، المملكة المتحدة) ، DH 2 O ، 7 ٪ (V / V) حصان الدم
RF10	RPMI - 1640 التي تحتوي على 2mm والجلوتامين ، 2nM البيروفات الصوديوم ، و 24 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، 10 ٪ (V / V) للحرارة المعطل مصل العجل الجنين.
RPMI +	RPMI - 1640 التي تحتوي على 2mm والجلوتامين ، 2nM البيروفات الصوديوم ، و 24 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين
تود هيويت مرق + 0.5 ٪ مستخلص الخميرة	تستكمل تود هيويت مرق (Oxoid ، باسينجستوك ، المملكة المتحدة) في DH 2 O مع 2 ٪ (W / V) مستخلص الخميرة

الجدول رقم 1 وسائل الاعلام الخاصة المستخدمة في هذا البروتوكول.

اسم المادة	نوع	شركة	رقم كتالوج	تعليق
RPMI المتوسط ​​1640	الكاشف	Gibco	21870-076
التربسين	الكاشف	رثينجتون مؤسسة بيوكيميائية	LS003740	تعامل TPCK
ليبوفيتش L - 15 المتوسط	الكاشف	Gibco	41300-039
Agarose ، النوع الأول	الكاشف	سيغما الدريخ	A6013	انخفاض استخدام ذوبان agarose درجة الحرارة ، مثل agarose SeaPlaque
مادين - داربي خلايا الكلى الناب	الكاشف	ATCC	CCL - 34

الجدول 2 كواشف محددة والمعدات :

تأثير على الرفق بالحيوان
	علامات خفيفة الى المعتدلين	علامات شديدة ب
غير محدد علامة (ق) :
مظهر	خفيف إلى معتدل مع عدم وجود انتصاب الشعر التجفاف (خيام الجلد)	انتصاب الشعر ، مع الجفاف (خيام الجلد)
حالة الجسم	تخفيض الوزن	أي زيادة في الوزن أو خفض وزنها
السلوك	انخفض التفاعل مع أقرانهم ولكن استجابة مهزوما.	لا تستجيب للنشاط والاستفزاز. معزولة عن الأخرى تتزاحم
الظروف الخاصة بكل علامة سريرية أو غير طبيعية (ق) :
غياب بقعة الحليب (<2-3 أيام من العمر)	محاولة لتشجيع الرضاعة إذا كان قد لوحظ هذا ل<24H.	إذا لم يكن هناك دليل على بقعة الحليب حتى مع التشجيع بعد 48h - 24 ، أو إذا كان من الواضح لم مرضع ، والنظر في القتل الرحيم.
علامات أخرى	تسعى الحيوان مرفق البيطرة الحيوانية / مدير مختبر إعادة نصيحة : العمل المناسب أو إذا euthanise الحيوان في ألم شديد أو معتدل أو استغاثة

الجدول 3. معايير التدخل من أجل الفئران الرضع (<21 يوما) :

وعند ملاحظة ^وجود واحد أو أكثر "خفيفة الى معتدلة" علامات زيادة تواتر الملاحظات إلى مرتين يوميا وطلب المشورة من ضابط الرفق بالحيوان عند الاقتضاء بحيث يمكن أن تعطى العلاج والرعاية.

^ب عندما لاحظ واحد أو أكثر "حاد" علامات ، والفئران باستخدام euthaniseالطريقة المناسبة. <يصرح باستخدامها في 10 يوما القديمة قطع الرأس والفئران> الفئران يصرح باستخدامها في 10 يوما من العمر خنقا ₂ CO.

Discussion

في الجسم الحي مع آلة التصوير IVIS هي منهجية فريدة من نوعها تسمح التصور في الوقت الحقيقي من الجراثيم المرضية ^{4 ، 6-9.} هنا ، ونعرض في تطبيق هذه التكنولوجيا لفهم التآزر بين س. الرئوية والأنفلونزا فيروس في الفئران الرضع. نظرا للطبيعة غير الغازية من هذه التقنية ، تمكنا من رصد تطور العدوى في كل فأر الفردية على مر الزمن. وقد أتاح لنا هذا لتوثيق حركية انتقال الالتهاب الرئوي بين الفئران الرضع المشارك يضم ^3. الطبيعة غير الغازية من هذه التقنية تمكن الباحثون لاستخدام عدد أقل من الحيوانات في التجربة وبالتالي الحد من استخدام الحيوانات. ومن الممكن أيضا استخدام الجهاز لتصور IVIS نشر العدوى إلى مواقع غير معروفة سابقا للعدوى في الجسم ، فضلا عن عينات من مواقع لا بسهولة عن طريق تشريح (مثل الأذن الوسطى).

قبل الشروع في تجارب التصوير ، وأكدنا أن مستويات الاستعمار من سلالة EF3030 bioluminescent كانت مماثلة للمستويات الاستعمار من سلالة EF3030 الأصل بواسطة تعداد عدد قابلة للحياة في الخليط الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، أكد لنا أولا أن العدوى بفيروس الأنفلونزا أسفرت عن زيادة الحمولة bioluminescent EF3030 في البلعوم الأنفي للاستعمار الحيوانات كما هو موضح مع سلالة EF3030 الأصل (النتائج غير معروضة).

في حين أن التكنولوجيا IVIS من السهل أن تعمل ويولد استنساخه وسهلة الفهم البيانات ، لا بد من التجارب مصممة بعناية بحيث يتم تكبير حساسية وفائدة هذه التكنولوجيا. على سبيل المثال ، تتأثر حساسية الكاميرا IVIS من عمق والتعتيم من النسيج ⁸ ، والتي في تجربتنا ، ويزيد من حد الكشف عن إشارات مصدرها bioluminescent الرئتين. بالإضافة إلى ذلك ، الفرو والجلد الداكن المصطبغة يقلل من انتقال الضوء بمقدار 10 أضعاف (بالمقارنة مع الفئران أصلع) ^8. في حين أن تطوير هذا الأسلوب ، ونحن على هذا البروتوكول الأمثل للاستخدام مع C57BL يوم 5-14 القديمة / 6 و الفئران أظهرت منذ عام والتي يمكن استخدامها للكشف عن IVIS استعمار القديم C57BL 20 يوما / 6 مع الفئران S. bioluminescent EF3030 الرئوية. ومع ذلك ، قد يتم الكشف عن زيادة إشارة عندما يتم تنفيذ هذه التجارب على الفئران عارية أو BALB / ج. ومع ذلك ، الكاميرا IVIS يمثل نهجا جديدا لرصد وتوصيف وفهم في نهاية المطاف في تطوير المجراة من داء المكورات الرئوية التالية الأنفلونزا من عدوى الفيروس.