Summary
독감 바이러스에 동시 감염 asymptomatic 동안 침투 폐렴 구균 질환의 유도에 연루 요인 중 하나입니다
Abstract
세계적으로 약 50 만명 죽인 1,918 인플루엔자 바이러스 유행 기간 동안 사망자의 대부분은 인플루엔자 바이러스에 혼자와 감염의 결과되지 않았습니다. 대신, 대부분의 개인은 predominately 박테리아 연쇄상 구균 pneumoniae (pneumococcus)에 의한, 보조 세균 감염에 굴복 할 생각입니다. 독감 바이러스와 pneumococcus로 인한 감염 사이의 시너지 관계는 이후 (1, 2 검토)뿐만 아니라 바이러스의 계절 동안 발생으로 1957 아시아 독감 바이러스 유행성 동안 관찰되었습니다. 여기, 우리는 동시에 독감 바이러스와 S.의 결과로 증가 병적 상태에 관여 수있는 메커니즘 (들)을 조사하는 데 사용하는 프로토콜을 설명 pneumoniae 감염. 우리는 안정을 유아 murine 모델을 개발하고 reproducibly S. 함께 식민지 마우스의 독감 바이러스 감염의 효과를 입증했습니다 pneumoniae. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 생체내 이미징 3 사용 공동 위치해, 신생아 생쥐 간의 폐렴 전송의 반응 속도론에 처음으로 통찰력을 제공합니다.
Protocol
1. 발광 생물 S.의 감염성 스톡의 준비 pneumoniae
- 0.5 % (W / V) 효모 추출물 및 발광 생물 S.와 혈액 한천의 작은 조각으로 보충 10ml 토드 - 휴잇 국물을 포함 맥카트니 튜브를 예방 pneumoniae 37에서 정적 성장 ° C 0.40-0.45의 광학 밀도 (600nm)에 적용됩니다.
- 이 성장 단계에있는 세포를 체포 5 분 서부 유럽 표준시 얼음의 문화를 놓습니다.
- 중반 로그인 성장 단계 S.의 10 ML하기 pneumoniae 1 80 % ML (V / V) 글리세롤과 혼합, 원하는 볼륨으로 나누어지는 및 -70 ° C.에 저장을 추가
- 발광 생물 S.의 전염성 복용량을 결정 혈액 한천 플레이트에 시리얼 dilutions의 가능한 개수로 pneumoniae 주식.
2. 인플루엔자 바이러스 주식의 성장과 준비
- 인플루엔자 바이러스는 10 일 이전 embryonated 닭고기 계란의 allantoic 유체 재배됩니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 독감 바이러스에 병을 해동.
- 계란 껍질 기본 정맥의 자유로운 시점에서 공기 색의 위치에있는 airsac (candling), 마크 위에 놓인 광원을 사용합니다.
- 70 % 에탄올로 닦고하여 계란의 표면을 소독하고 깨끗하게 닦으십시오.
- 피어스 단지 보석의 학자를 사용하여 마르크 위의 공기 색의 작은 구멍.
- 계란은 공기 색 맨 위에있는 카톤의 위치로 적절하게 희석 인플루엔자 바이러스의 0.1mL와 쉘에있는 구멍을 통해 각각의 계란을 예방하기 위해 13mm 1mL 주사기와 26G 바늘을 사용합니다. airsac를 피어싱, allantoic 구멍에 바늘을 직접 아래쪽으로 가리 킵니다.
- 녹은 왁스로 입구를 봉쇄하고 35 humidified 계란 보육 2 일 ° C. 위해 알을 품어 2 일 부화, 촛불 후 달걀은 배아가 아직 살아있다는 확인을 위해 혈관의 존재를 확인합니다. 계란 안에 검은 경우 배아가 사망하고 있으며 계란은 폐기되어야하며 독감 바이러스의 수확을 위해 사용되지 않습니다.
- 4 알을 플레이스 ° C 배아를 죽이는과 혈액 및 바이러스 사이의 접촉 적혈구에 바이러스의 바인딩의 결과 마찬가지로, 혈관의 중단을 최소화하기 위해 혈관을 수축하는 하룻밤.
- 그 다음날, 70 % 에탄올로 닦고하여 계란의 표면을 소독.
- 계란에서 인플루엔자에게 바이러스를 포함하는 allantoic 유체를 수집하는 클래스 II Biosafety 내각에서 작동합니다. 왁스를 제거하고 allantoic 멤브레인 위에 공기 색을 제거하는 계란의 상단 주변자를 곡선 가위를 사용합니다.
- 찔린 다시 껍질 살균 집게를 사용하여 allantoic 막합니다.
- 다른 멸균 피펫과 함께 한쪽으로 배아를 누른 상태 10mL 멸균 피펫으로 allantoic 액체를 대기음. 50mL 튜브에 풀링된 allantoic 액체를 수집하고 항상 얼음에 보관. allantoic 액체는 피가하거나 포함되어있는 경우 노른자가 수영장에 추가하지 않습니다.
- 파편을 제거하기 위해 상온에서 2,000 rpm으로 5 분 대한 allantoic 액체를 원심 분리기.
- -70에서 1-2 ML cryotubes 및 저장소에 나누어지는 전염성 allantoic 유체 ° C.
- 인플루엔자에게 마딘 - 다비 개과의 신장 세포 (아래 참조) 3 독립적으로 수행 플라크 형성 assays에서 해동 allantoic 유체의 바이러스 titre를 확인합니다. 각 실험에 대한 바이러스의 새로운 나누어지는을 사용합니다. 반복 동결 융해는 감염의 titre을 줄일 수 있습니다.
3. 발광 생물 S.와 생쥐의 비강 감염 pneumoniae 및 / 또는 독감 바이러스
- 발광 생물 S.의 해동 냉동 주식 pneumoniae와 PBS에서 원하는 약을 희석.
- 부드럽게 검지 손가락과 엄지손가락 사이에 오일 오래된 쥐를 들고 똑바로 잡아. 발광 생물 S.를 드롭하는 피펫을 사용하여 3μl의 볼륨에 나레스에 pneumoniae. inoculum의 모든 감옥에 다시 마우스를 걸기 전에 흡입 때까지 기다리십시오. 모의 감염 PBS의 3μl를 사용하십시오.
- 쓰리에 구일 발광 생물 S.와 식민지 이후 pneumoniae는 인플루엔자 바이러스를 포함하는 allantoic 액체의 나누어지는를 해동하고 원하는 농도로 PBS에 희석. 같은 단계 3.2에서 설명 3μl PBS의 볼륨에 독감 바이러스에 쥐를 감염. 모의 바이러스 감염에 대한 감염되지 않은 계란에서 희석 allantoic 액체의 3μl를 사용하십시오.
- 우유 명소의 존재, ≤ 삼일 오래 마우스에 그들의 외모, 행동, 신체 상태를 관찰하고하여 매일 생쥐의 복지를 모니터링합니다. 인간 끝 지점과 간섭 기준에 대한 가이드는 실험실 동물 수의사 (표 3)와 협의하여 개발되어야합니다.
4. 발광 생물 이미징은 IVIS 스펙트럼 (칼리퍼 생명 과학)을 사용하여
- 주사용 물에 0.75 MG / ML과 xylazine 1.76mg/ml에서 마취제의 혼합물을 준비합니다.
- 쥐를 마취시키다하려면, 복막에 100μl/10 g의 체중을 주입공동.
- 이미지 상자에 anaesthetized 마우스를 놓습니다. 세심한주의가 이미징 박스 / 챔버의 마우스 안으로 배치하면 카메라에 관심 평행의 해부 학적 영역을 유지하기 위해 지불되어야합니다.
- 플레이스 IVIS의 생쥐와 상자 0.5 L / 마취를 유지하는 분 상자에 isoflurane 항목을 허용합니다.
- 이미징 플랫폼과 비닝를 수정 7 분 동안 이미지를 캡처하는 IVIS 시스템을 설정합니다.
- 홈 케이지로 돌아오기 전에 예열 상자 (예 :이 열 패드를 사용)에 마취에서 회복하기 위해 생쥐를 허용합니다.
- 이미지 분석 및 생활 이미지 소프트웨어 패키지 버전 3.0 (칼리퍼 생명 과학)를 사용하여 동일한 규모 조정됩니다.
- 관심 선택한 영역의 발광 생물 신호 중 전체 흐름 (광자 / 초) 또는 평균 빛을 (광자 / S / cm 2 / SR)로 계량하실 수 있습니다.
5. 박테리아로드 및 바이러스 titer를 결정하기 위해 조직의 처리
- 생쥐는 CO 2 질식에 의해 euthanased과 모피는 70 % 에탄올을 사용하여 소독하고 있습니다.
- 하드 커팅 보드에있는 동물을 고정.
- 멸균 메스 블레이드를 사용하여 사후 시작, 동물의 머리의 중앙을 통과하여 갈하고, 머리 바깥쪽 양쪽을 절곡하여 nasopharynx을 폭로.
- 1.5mL 얼음처럼 차가운 RPMI에서 살균 포셉과 장소를 사용하여 머리의 각 이분의 일로부터 조직 근근이 살아가고하여 각 동물의 nasopharyngeal 조직을 수집합니다. 얼음 계속.
- 가위를 사용하여 흉강을 열고 살균 집게와 가위를 사용하여 폐를 제거합니다. 폐 언제 혈액을 제거하고 1.5mL 얼음처럼 차가운 RPMI에서 수집 PBS로 세 번 씻어. 얼음 계속.
- 조직을 균질하는 homogeniser 다시 얼음에 장소를 사용합니다.
- 균질 조직의 나누어지는를 제거하고 박테리아 부하를 결정하기 위해 이것을 사용합니다. 조직 homogenate 및 HBA에 접시의 시리얼 dilutions를 준비합니다. 37 문화 번호판 ° C 18-24 시간과 가능한 수를 결정합니다. 특정 장기의 세균성 titers는 해당 지역에서 관찰된 광자의 개수와 상관하실 수 있습니다.
- 4 10 분 3,500 rpm으로 균질 조직의 나머지 부분을 원심 ° C. 깨끗하고 무균 튜브에 뜨는 및 전송을 수집합니다. 스토어 뜨는 -70 ° C에서와 상패 분석하여 바이러스 titer를 결정합니다.
6. 조직 homogenates에서 독감 바이러스 titer를 결정하는 상패 분석
- 바이러스 감염의 titers는 마딘 - 다비 개과의 신장 (MDCK) 세포의 합류 monolayers에 플라크 형성에 따라 결정됩니다. MDCK 세포는 정기적으로 조직 문화 병 (Nunc)에 RF10 (표 1)에서 교양 언제 합류 passaged 있습니다.
- 트립신을 사용하여 조직 배양 병에서 MDCK 세포를 분리합니다. RF10에있는 세포를 씻어 5 분 1,200 rpm으로 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는을 취소하고 RF10에 pelleted 세포를 resuspend. hemocytometer과 중요한 염료를 사용하여 MDCK 세포를 계산합니다. 37 3ml RF10 문화 세포의 1.2x10 6 MDCK 세포와 6 - 잘 접시 잘 각각 35mm 씨앗 (Nunc) (~ 24 시간) confluency 달성 ° C와 5% CO 2.
- Leibovitz dsL15 미디어와 1.8 % (W / V) 아가로 오스 오버레이 미디어 (표 1)을 준비합니다. 나누어지는 dsL15 미디어 멸균 병에 50mL의 1.8 % (W / V)은 아가로 오스. 4 dsL15 미디어를 보관 ° C 56에서 사용하고 아가로 오스 ° C까지 사용까지.
- MDCK 세포 monolayers가 합류하는 확인하고 RF10를 aspirating하고 그것을 대체하여 RPMI의 +와 세포를 씻어 ~ 1.5ml RPMI +. 프로 시저에서 노 단계에서 접시가 완전히 건조 수 있어야합니다. 37 접시를 품어 ° C 바이러스를 포함하는 샘플을 추가할 준비까지.
- RPMI에서 바이러스 샘플 시리얼 dilutions 준비 +. 사용 전까지 얼음 샘플 보관하십시오.
- 기음 monolayers에서 RPMI + 및 + 바이러스 샘플의 적절한 dilutions 각 잘하는 135uL RPMI를 추가합니다. 중복 각 샘플을 테스트합니다.
- 37 45 분 동안은 바이러스 샘플과 MDCK 세포를 품어 ° C와 5% CO 2. 부드럽게 접시 균일하게 바이러스를 배포하고 MDCK 세포 monolayers의 건조 방지하기 위해 15 분 간격으로 흔들어.
- 56에서 아가로 오스를 이동 ° 46에 C ° C waterbath과 ° C waterbath 46에 따뜻한 dsL15 미디어.
- MDCK monolayers에있는 바이러스의 45 분 부화 후 5 % CO 2 배양기의 번호판을 꺼내. 46 ° C waterbath에서 아가로 오스와 L15 미디어를 제거합니다. 50mL 1.8 % (W / V) 아가로 오스로 dsL15의 50mL + 트립신을 추가하는 것보다 dsL15 미디어 50mL에 0.1 %의 트립신의 0.2mL를 추가합니다. 아가로 오스와 부드럽게 L15를 혼용하여 6 자 접시 각 잘하는 오버레이 매체 3mL를 추가합니다. 부드럽게 전체 MDCK 세포 monolayer을 보장하기 위해 소용돌이가 덮여 있습니다. 일단 오버레이가 37 품어 번호판을 설정 ° C와 5% 2~4일에 대한 CO 2.
- 잠복기의 마지막에는, 바이러스 infectivi의 조치로 plaques의 개수를 계산티. 필요한 경우, plaques은 메탄올에 녹아있는 크리스탈 바이올렛과 monolayers의 얼룩에 의해 시각하실 수 있습니다.
7. 섹션 C - 성공의 비밀 :
S.하는 모든 실험 작업 1 pneumoniae (액체 문화의 예 접종, S. pneumoniae에 감염된 생쥐에서 조직의 처리) 클래스 II Biosafety 내각에서 수행됩니다.
1.1 우리는 발광 생물 S.를 만들 플라스미드 pPJTG28 3 도입하여 pneumoniae의 종자. 다른 발광 생물의 S. 그러나, 다양한 pneumoniae의 변종은 4-6 사용할 수 있습니다. 발광 생물 S. pneumoniae의 변종도 칼리퍼 생명 과학 부동산 (MA, 미국)에서 구입하실 수 있습니다.
다양한 S. 1.1 성장 속도론 pneumoniae의 변종이 다를 수 있고, 각 변형에 대한 결정되어야합니다. 그것은 = 0.4 0.45에 OD600nm에 도달하는 4-3 사이의 시간이 걸릴 수 있습니다.
1.4 우리는 일반적으로 전염성이 주식은 10e8 CFU / ML의 농도에 도달하고 가능한 박테리아의 농도를 결정하기 위해 10e - 8 10e - 4에서 희석 범위를 권장 기대합니다.
계란을 inoculating에 사용할 2.6 적절한 titre은 사용 바이러스 변형에 의존하고 10e - 3 10e - 5에 이르기까지 다양합니다. 조직 문화 supernatants 얻은 인플루엔자 바이러스 변종은 때로는 단정 사용할 수 있습니다.
3.2a 우리는 일상적으로 S. 2,000 CFU를 사용하여 pneumoniae 변형 EF3030은 오일 오래된 쥐를 3 식민지 있습니다. inoculum의 정확한 감염 투여는 말 혈액 한천 플레이트에 inoculum 일련 dilutions을 도금하여 각 실험에 대한 보는 결정됩니다. S.의 능력 마우스를 식민지로 pneumoniae 스트레인은 먼저 생쥐의 접종 후 몇 시간이 지점에서 조직 homogenates의 가능한 셀 (예 : nasopharynx, 폐)에 의해 결정됩니다.
3.2b는 그것은 흡입을 통해 동물에 세균이나 바이러스를 관리하는 anaestetics를 사용할 필요가 없습니다. 유아 마우스가 (뿐만 아니라 어른 생쥐로) 손으로 구속하고 조사에 의해 수직으로 개최되어야 inoculum (최대 성인 쥐 10 microliter에 유아 마우스 3 microliter는) 다음 inoculum 모든 나레스 및 흡입에 삭제됩니다 관찰에 의해 확인됩니다.
3.2c는 신생아 생쥐에게 박테리아 또는 필요에 따라 바이러스에 둥지와 예방에서 하나씩를 제거합니다. 필요하고 반환 동물 경우 즉시 새장에 다시 영구 마커를 사용하여 동물의 꼬리를 표시합니다. 댐이 둥지로 다시 새끼를 수락 수 있도록 몇 가지 침구 소재로 동물을 문지 르세요. 참고 : 영구 마커 신속하게 동물을 떨어져 나오기 매일 다시 적용해야합니다. 또한, 문신 시스템은 각각의 동물을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
3.3 우리는 8-14일 된 생쥐에게 3 감염 20 PFU 독감 바이러스 Udorn/307/72 (H3N2)를 사용합니다. 동물에서 관찰 사망률 및 병적 상태는 S.의 변형에 따라 달라집니다 pneumoniae와 독감은 바이러스가 사용됩니다. 표 3은 인간 엔드 포인트와 세 21 일 이내에 어린 마우스에서 사용 개입 기준 유용한 집합을 제공합니다. S.를 사용할 때 우리는 일반적으로 어떤 사망률이나 병적 상태를 감지하지 pneumoniae EF3030 및 독감 바이러스 변종 Udorn/307/72 (H3N2) 때 마우스> 10 일 간의 있습니다.
정확하게 4.2, 생쥐는 마취 솔루션을 주입하기 전에 무게하실 수 있습니다. 가이드로, 마취 솔루션의 50-75에 대한 microliters은 이십일 된 생쥐에 사용됩니다. 마우스는 꼬리 또는 뒷다리에서 핀치에 응답하지 않는 경우 완전히 anesthetized입니다. IVIS에있는 동안, 생쥐도 마취를 추가할되는 isoflurane에 노출됩니다. 생쥐의 감염 다음과 같은 이미지의 타이밍은 S.의 변형 (들)에 따라 pneumoniae와 독감은 바이러스가 관심의 증상뿐 아니라 사용됩니다. 발광 생물 이미징의 타이밍을 최적화하기위한 몇 가지 시범 실험을 수행하는 것이 필요할 수 있습니다.
4.3 마우스가 중 절연 상자 (상자를 입력하거나 종료할에서 오염 물질을 방지하는)에 배치하거나 또는 영상을위한 장비에 직접 삽입할 수 있습니다. 우리는 생쥐가 이미징 절차를 수행하는 동안 anaesthetized 유지되도록하고, S.와 IVIS의 오염을 방지하기 위해, 유아 쥐 실험에 대한 절연 상자를 사용하여 pneumoniae 및 / 또는 독감 바이러스를.
4.3 호흡기의 이미지를 얻기 위해 생쥐의 복부 이미지를 사용합니다. 마우스의 측면 이미지가 귀를보다 민감한 이미지를 제공합니다.
생쥐가 챔버에 직접 배치 4.4 isoflurane은 코 콘을 통해 마우스로 배달됩니다. 코 콘은 유아 생쥐에 적합하지 않기 때문에 유아 마우스를 사용하는 실험은 절연 상자가 좋습니다.
4.5 T그는 이미지를 캡처하는 데 필요한 총 노출 시간은 발광 생물 신호의 강도에 따라 실험을 사이에 차이가 신호, 세균성 긴장의 위치와 마우스 스트레인 사용된 수 있습니다. 후자에 대해서, 안료 및 모피 모두 크게 총 감지 신호를 감쇠 수 있습니다. IVIS 스펙트럼에있는 카메라는 다시 - thinned, 뒤로 넓은 동적 범위 (65,536 회색 수준) 제공 CCD는 조명. 이상적으로, 노출 시간은 60 사이의 60,000 카운트를 캡처하도록 설정해야합니다. 7분 넘어 이미징 시간을 증가 C57BL / 6 마우스와 함께 우리의 경험에서 현저하게 노이즈 비율로 신호를 향상되지 않습니다. 발광 생물 신호를 높이기위한 대체 옵션 비닝의 정도 (대형에 ie.)을 증가하고 볼의 작은 필드를 사용하고 있습니다. 이 감지 광자의 수를 과소 평가 가치를 제공하는 등 중요한 부량은 포화 픽셀이 포함된 이미지를 내부 영역에서 수행해서는 안됩니다. 최적의 조건으로 알 수있는 경우, 자동 노출 기능은 지침으로 사용할 수 있습니다.
마우스의 한 부분에서 강한 발광 생물 신호가 인근 지역에서 bioluminescence의 검색을 방해하고있다면, 마우스 선택 영역이 검은색 종이와 영상으로 덮여 수있는 4.5 정상적으로 진행할 수 있습니다
4.7 발광 신호가 광자 (로 계산 반대) 실험 사이 이미징 조건의 변화 (예 : 이미징 시간) 발광 생물 신호의 측정에는 영향을 미치지 않습니다 논리적으로 양이있다면.
4.8 지정된 영역에서 광자를 측정하는 전체 유량을 사용하는 경우, 모양 같은 '관심의 영역'이 모든 샘플에 사용되었는지 확인합니다.
5.1a 마우스는 연구자의 관심에 따라, 인플루엔자 바이러스에 감염 후에 시점에서 euthanized 수 있습니다. 우리는 일반적으로 인플루엔자 바이러스 Udorn/307/72 (H3N2)에 감염된 후 6 일 동안 박테리아와 바이러스 titre을 결정하고 사망률 / 병적 사항을 준수하지 않습니다. 그러나, 병적 이러한 실험에서 관찰 사망률은 S.pneumoniae에 따라 다를 수 있으며 독감 바이러스 변종이 사용 chosed 시점은 동물 복지에 미치는 영향을 최소화하기 위해 계정으로 사망률과 병적 요금을해야합니다. 표 3은 이러한 실험에 사용하기 위해 개입 기준 및 인간 종점에 유용한 가이드를 제공합니다. 일반적으로 마우스 생체내 이미징에서 발광 생물 후 3 시간 이내에 설명된대로 처리 euthanized 및 조직입니다.
미만 십일 이전 5.1b 마우스는 hypoxia에 강한되며 잘린으로 euthanized 있습니다. 설명 실험 설정에서 마우스는 최소 14 일 이전이며, CO 2 질식에 의해 euthanized 수 있습니다.
5.7 블러드 - 한천 플레이트는 비강 조직의 homogenates에 공생 박테리아의 성장을 방지하기 위해 5μg/ml gentamicin과 보충 수 있습니다. 사용 dilutions의 범위는 S.에 따라 달라집니다 pneumoniae 응력이 사용됩니다. S. 함께 이십일 된 생쥐의 실험 pneumoniae 변형 EF3030, 우리는 깔끔한, 10e - 1, 10e - 2 및 10e - 3을 사용합니다.
백업 예제는 바이러스 상패 분석이 실패 경우에 사용할 수 있도록 적어도 두 개의 aliquots의 균질 조직의 5.8 쇼핑몰 각각의 샘플을! 정확한 바이러스 titer는 샘플에서 냉동 아니지만 반복 동결 - 해동 후 한번 해동 샘플에서 얻을 수 있습니다.
6.1 90-100%의 합류를 재배하면, 단일 150cm 두 조직 문화 플라스크 다섯 6 잘 접시 정도 MDCK 세포를 얻을 수 있습니다.
6.5 최적의 시리얼 희석 사용되는 바이러스 변종과 감염 후 시간에 따라 달라집니다. 일반적으로, 우리는 육일 인플루엔자 바이러스에 감염 후 찍은 장기 homogenates를위한 깔끔한, 10e - 1 10e - 2 dilutions을 사용합니다.
바이러스 주식의 일련 dilutions의 6.6를 사용하면 각 상패 분석에 사용하기 위해 적절한 긍정적인 컨트롤입니다. 대조군으로 RPMI +를 사용할 수 있습니다.
8. 대표 결과 :
그림 1. embryonated 닭고기 계란의 도식 다이어그램.
그림 2. S.의 BLI pneumoniae는 독감 바이러스 감염 후 모의 일 3 일 4 마우스를 감염.
그림 3. S.의 BLI 일 3 독감 바이러스에 감염 후 4 일 pneumoniae 및 독감 바이러스에 감염된 마우스 공동.
그림 4. 하나의 코를 세균로드 및 공동 infec테드 마우스.
그림 5. 공동 감염 마우스의 코와 폐에 바이러스성 titres.
| 미디어 | 내용 |
| 1.8 % (W / V) 아가로 오스 | 50mL 증류수 H 2 O로 아가로 오스의 0.9 g을 추가, 10 분에 대해 121 ° C에서 autoclaving하여 소독. ° C waterbath가 냉각 56으로 환승. |
| 더블 강도 Leibovitz의 L15 매체 (DS L15) | L15 분말 (1L를하기 위해) 1 가방은 450 ML 멸균 증류수 H 2 O에 용해하고 용해까지 흔들 수 있습니다. 산도는 1M HCL로 산도 6.8로 조정됩니다. 다음 NaHCO3 4mL 7 % (W / V), 0.4mL HEPES (0.5M, 산도 6.8), 200 U / ML 페니실린, 200 μg / ML 스트렙토 마이신, 60 μg / ML의 gentamicin과 보완. 소독 500mL 및 필터 최종 볼륨을 조정합니다. |
| 호스 블러드 아가르 (HBA) | 4퍼센트 HBA (Oxoid, 베이 싱 스 토크, 영국), DH 2 O, 7 % (V / V) 호스 피 |
| RF10 | RPMI - 1640 2mM 글루타민, 2nM 나트륨 pyruvate, 24 μg / ML gentamicin, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 10 % (V / V) 열 inactivated 소태아 혈청을 포함. |
| RPMI + | RPMI - 1640 2mM 글루타민, 2nM 나트륨 pyruvate, 24 μg / ML gentamicin, 100 U / ML 페니실린을 포함한 100 μg / ML 스트렙토 마이신 |
| 토드 - 휴이트 맛을 + 0.5 % 효모 추출물 | DH 2 O의 토드 휴이트 맛을 (Oxoid, 베이 싱 스 토크, 영국) 2 % (W / V) 효모 추출물과 보충 |
표 1.이 프로토콜에서 사용되는 특정 미디어.
| 재료 이름 | 유형 | 회사 | 카탈로그 번호 | 논평 |
| RPMI 배지 1,640 | 시약 | Gibco | 21870-076 | |
| 트립신 | 시약 | 워싱턴 생물 코퍼레이션 | LS003740 | TPCK는 치료 |
| Leibovitz의 L - 15 배지 | 시약 | Gibco | 41300-039 | |
| 아가로 오스, 나를 입력하십시오 | 시약 | 시그마 - 알드리치 | A6013 | 같은 SeaPlaque 아가로 오스와 같은 낮은 용융 온도 아가로 오스를 사용 |
| 마딘 - 다비 개 신장 세포 | 시약 | ATCC | CCL - 34 |
표 2 특정 시약 및 장비. :
| 동물 복지에 대한 효과 | ||
| 보통 표지에 온화한 | 심한 증상의 B | |
| 비 특정 기호 (S) : | ||
| 외관 | 노 탈수 (피부 tenting)와 piloerection를 운영 살짝 | 탈수와 Piloerection (피부 tenting) |
| 바디 조건 | 감소 체중 증가 | 없음 체중 증가 또는 체중 감소 |
| 행동 | 부드러운하지만 응답, 동료들과 상호 작용을 감소. | 활동 및 도발에 응답. 다른 littermates에서 절연 |
| 특정 조건이나 비정상적인 임상 기호 (S) : | ||
| 우유 명소 부재 (<2-3일 세) | 이것이 <24 시간에 대한 관찰되었는지 서클링 격려보십시오. | 24 - 48h 후에도 격려와 우유 명소에 대한 증거, 또는 분명 로물루스하지 않은 경우, 안락사를 고려하지 않으면. |
| 기타 표지판 | 동물이 중간 또는 심한 통증이나 고통에있는 경우 적절한 조치 또는 euthanise : 동물 시설 관리자 / 실험실 동물 수의사의 상담을 다시 탐색 | |
표 3. 유아 마우스 (<21일 이전)에 대한 개입 기준 :
하나 이상의 '순한는 중간에'간판이 두 번 매일 관찰의 빈도를 증가시키고 있도록 치료와 관리가 주어진 수있는 적절한 동물 복지 담당관의 조언을 구하 관찰하고 있습니다.
B 하나 이상의 '심각한'징후가 관찰되면 사용하여 생쥐 euthanise적절한 방법입니다. 마우스 <10 일 간의이 잘린으로 euthanized 있으며, 마우스> 10 일 지났다는 CO 2 질식에 의해 euthanized 있습니다.
Discussion
생체내에서 IVIS 시스템과 이미징은 미생물의 pathogenesis 4, 6-9의 실시간 시각화을 허용하는 독특한 방법이다. 여기, 우리는 S. 사이 synergism을 이해하기 위해이 기술의 응용 프로그램을 표시 유아 마우스의 pneumoniae 및 독감 바이러스. 이 기법의 비침습 특성으로 인해, 우리는 시간이 지남에 따라 각각의 마우스에 감염의 진행을 모니터 할 수있다. 이것은 우리가 공동 보관되어 유아 마우스 세 사이 폐렴 전송의 속도론을 문서에 사용할 수 있습니다. 이 기법의 비침습 자연 실험마다 적은 동물을 사용하는 연구자 수 있으며 따라서 동물의 사용량을 줄일 수 있습니다. 그것은 몸 속에 감염의 이전에 알려지지 않은 사이트로 감염의 보급을 시각화뿐만 아니라 쉽게 해부 (예 : 중간 귀)에 의해 샘플링되지 사이트 IVIS 기계를 사용하는 것도 가능합니다.
이미징 실험을 시작하기 전에, 우리는 발광 생물 EF3030 변형의 식민지 수준은 조직 homogenates에 가능한 개수를 열거하여 부모 EF3030 변형의 식민지 수준을 비교할 수 있다고 밝혔다. 또한, 우리는 먼저 독감 바이러스에 감염이의 nasopharynx의 발광 생물 EF3030 증가 하중 결과 상위 EF3030 변형 (결과가 표시되지 않음)와 시연으로 동물을 식민지 확인.
IVIS 기술이 작동하기 쉬운 데이터를 이해하기 쉽게 재현할 생성하지만, 실험은 신중하게 기술의 감도와 유틸리티가 극대화되도록 설계해야합니다. 예를 들어, IVIS 카메라의 감도는 우리의 경험에서, 폐에서 발생하는 발광 생물 신호에 대한 검출 한계를 증가 조직 8의 깊이와 불투명도에 영향을받습니다. 또한, 어두운 모피와 색소 피부가 많은 8 (사나이 답게 마우스에 비해) 10 배 등에 의해 빛의 전송을 줄여줍니다. 이 방법을 개발하는 동안, 우리는 5~14일 된 C57BL / 6 마우스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 최적화하고 이후 IVIS가 발광 생물 S. 함께 이십일 된 C57BL / 6 마우스의 식민지를 감지하는 데 사용할 수있는 것을 보여준 pneumoniae EF3030. 이러한 실험은 누드 또는 BALB / C 마우스에서 수행하는 경우 그러나, 신호 검출이 증가 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, IVIS 카메라는 새로운 접근 방식, 모니터 특징 궁극적으로 독감 바이러스 감염 다음과 폐렴 구균 질환의 생체내 개발에 이해를 나타냅니다.
Disclosures
이 비디오 문서의 생산은 칼리퍼 생명 과학에 의해 후원되었다.
Acknowledgments
저자는 기술 데이빗 브릴즈 (버밍엄, AL, 미국의 앨라배마 대학)에서 조언을 인정하고 싶습니다. 우리는 설명된 실험에 대한 유용한 제안 및 토론 동물 복지에 관한과 윤리 및 간섭 기준 및 인간 끝 지점의 개발을위한 이베트 첸, 멜버른 대학의 동물 복지 담당관, 그리고 데이비드 테일러, 동물 시설 관리자를, 감사하고 싶습니다 이 원고 인치
Odilia Wijburg과 패트 릭 읽기가 NHMRC RD 라이트 원정대에 의해 지원됩니다, 커스티 단기은 GSK 대학원 지원 교부금 및 퍼지 장학금으로 지원됩니다.
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