Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

Summary

A infecção concomitante com o vírus influenza A é um dos fatores implicados na indução de doença pneumocócica invasiva durante assintomáticos

Abstract

Durante a pandemia de influenza vírus de 1918, que matou aproximadamente 50 milhões de pessoas em todo o mundo, a maioria das mortes não foram o resultado de infecção com o vírus da gripe sozinho. Em vez disso, a maioria dos indivíduos são pensados ​​para ter sucumbido a uma infecção bacteriana secundária, predominantemente causada pela bactéria Streptococcus pneumoniae (pneumococo a). A relação sinérgica entre as infecções causadas pelo vírus influenza e pneumococo foi posteriormente observado durante a pandemia de vírus influenza asiática de 1957, bem como durante os surtos sazonais do vírus (revisto em ^{1, 2).} Aqui, nós descrevemos um protocolo usado para investigar o mecanismo (s) que podem estar envolvidos no aumento da morbidade, como resultado da gripe A concorrente vírus e S. infecção pneumoniae. Nós desenvolvemos um modelo murino infantil de forma confiável e reprodutível demonstrar os efeitos da infecção pelo vírus influenza de ratos colonizados com S. pneumoniae. Usando este protocolo, temos desde o primeiro discernimento da cinética de transmissão pneumocócica entre co-alojados, ratos neonatal usando in vivo de imagens ^3.

Protocol

1. Preparação de stock Infecciosas da Bioluminescent S. pneumoniae

1. Inocular um tubo contendo 10 ml de caldo McCartney Todd-Hewitt suplementado com 0,5% (w / v) de extrato de levedura e um pequeno pedaço de agar sangue com bioluminescent S. pneumoniae e crescer estaticamente a 37 ° C a densidade óptica (600nm) de 0,40-0,45.
2. Lugar da cultura no gelo molhado por 5 min para prender as células nesta fase de crescimento.
3. Para os 10 ml de meados log fase de crescimento S. pneumoniae adicionar 1 ml de 80% (v / v) de glicerol e misture, alíquota para os volumes desejados e armazenar a -70 ° C.
4. Determinar a dose infecciosa do S. bioluminescentes pneumoniae ações pela contagem viável de diluições em série em placas de agar sangue.

2. Crescimento e preparação de vírus influenza A de ações

1. Vírus influenza A é cultivado no líquido alantóide de 10 dias de idade ovos embrionados de galinha.
2. Descongelar um frasco com o vírus influenza A em 37 ° C banho-maria.
3. Usando uma fonte de luz colocada sobre o (candling) airsac, marca na casca do ovo a localização do saco de ar em um ponto livre de veias subjacentes.
4. Desinfetar a superfície dos ovos, limpando com álcool a 70% e limpar.
5. Faça um furo pequeno no saco de ar logo acima da marca usando escriba de um joalheiro.
6. Com os ovos colocados em uma caixa com o saco de ar superior, use uma seringa de 1mL 13 milímetros e uma agulha 26G para inocular cada ovo através do furo na casca com 0,1 ml de gripe adequadamente diluída de vírus. Aponte a agulha diretamente para baixo na cavidade alantóide, perfurando o airsac.
7. Sele o orifício com cera derretida e incubar os ovos por 2 dias em uma incubadora de ovos umidificado a 35 ° C. Após dois dias de incubação vela, os ovos para verificar a presença de vasos sanguíneos para confirmar o embrião ainda está vivo. Se o ovo é preto por dentro, o embrião tenha morrido e os ovos devem ser descartados e não utilizados para a colheita do vírus influenza A.
8. Coloque os ovos, a 4 ° C durante a noite para matar os embriões e os vasos sangüíneos, a fim de minimizar a interrupção dos vasos, como o contato entre o sangue eo vírus resultaria na ligação do vírus às células vermelhas do sangue.
9. No dia seguinte, desinfetar a superfície dos ovos, limpando com álcool a 70%.
10. Trabalho em uma classe II de Biossegurança Gabinete para recolher o líquido alantóico contendo o vírus influenza A partir os ovos. Remover a cera e usar a tesoura para cortar curvas em torno do topo do ovo para remover o saco de ar acima da membrana alantóide.
11. Punção e descascar a membrana alantóide usando uma pinça estéril.
12. Aspirar o líquido alantóico com uma pipeta 10 ml estéril enquanto mantém o embrião para um lado com uma outra pipeta estéril. Coletar pooled líquido alantóico em 50mL tubos e manter em gelo em todos os momentos. Se o líquido alantóico é sangrento ou contém gema não contribuam para a piscina.
13. Centrífuga de líquido alantóico 5min a 2.000 rpm em temperatura ambiente para remover detritos.
14. Alíquota do fluido alantóico infeccioso em 1-2 criotubos ml e armazenar a -70 ° C.
15. Determinar o vírus influenza A título do fluido alantóico descongeladas em três ensaios de placa realizados de forma independente formando em Madin-Darby células de rim canino (veja abaixo). Use uma nova alíquota de vírus para cada experimento. Repetidos de congelamento e descongelamento irá reduzir a titulagem.

3. Infecção intranasal de camundongos com bioluminescent S. pneumoniae e / ou vírus influenza A

1. Estoque de congelados descongelar bioluminescentes S. pneumoniae e diluir a dose desejada em PBS.
2. Gentilmente pegar cinco dias ratos velhos entre o dedo indicador eo polegar e mantenha na vertical. Use uma pipeta a cair bioluminescentes S. pneumoniae em narinas em um volume de 3μl. Esperar até que todos do inóculo é inalado antes de colocar o mouse de volta na gaiola. Use 3μl de PBS para a infecção mock.
3. Três a nove dias após a colonização com S. bioluminescentes pneumoniae, descongelar uma alíquota do líquido alantóico contendo vírus influenza A e diluir em PBS a concentração desejada. Infectar ratos com o vírus influenza A em um volume de 3μl PBS, conforme descrito no passo 3.2. Use 3μl de líquido alantóico diluído a partir de ovos não-infectados de mock-infecção pelo vírus.
4. Monitorar o bem-estar dos ratos por dia, observando a sua aparência, comportamento, condição corporal e, em ratos que são ≤ 3 dias de idade, a presença de manchas de leite. Um guia para pontos finais humano e critérios de intervenção devem ser desenvolvidas em consulta com o veterinário em animais de laboratório (Tabela 3).

4. Bioluminescentes imagem usando o espectro IVIS (Caliper Life Sciences)

1. Prepare uma mistura de cetamina em 0,75 mg / ml e 1.76mg/ml xilazina em água injetáveis.
2. Para anestesiar ratos, injetar 100μl/10 peso corporal em g peritonealcavidade.
3. Coloque os ratos anestesiados na caixa de imagem. Atenção especial deve ser dada para manter a região anatômica de interesse paralelo para a câmera quando colocar o rato dentro da caixa de imagem / câmara.
4. Caixa de lugar com ratos em IVIS e permitir a entrada na caixa de isoflurano a 0,5 L / min para manter a anestesia.
5. Set máquina IVIS para corrigir plataforma de imagem e binning e captura de imagem por 7 minutos.
6. Permitir que os ratos se recuperar da anestesia em uma caixa aquecida (por exemplo, usando uma almofada de calor) antes de retornar a gaiola.
7. As imagens são analisados ​​e ajustados para a mesma escala utilizando a imagem viva do pacote de software versão 3.0 (Caliper Life Sciences).
8. Sinais bioluminescentes em uma região selecionada de interesse podem ser quantificados como quer o fluxo total (fótons / s) ou o brilho média (fótons / s / cm ² / sr).

5. Processamento de tecidos para determinar a carga bacteriana e titulação do vírus

1. Os ratos são sacrificados por asfixia CO ₂ e os pêlos desinfectados com álcool 70%.
2. Imobilizar o animal em uma tábua de corte rígido.
3. Usando uma lâmina de bisturi estéril, passou no meio da cabeça do animal, a partir posterior, e expor a nasofaringe, dobrando cada lado da cabeça para fora.
4. Coletar o tecido nasofaríngea de cada animal raspando o tecido de cada metade da cabeça usando uma pinça estéril e colocar em 1,5 ml gelada RPMI. Manter no gelo.
5. Abrir a cavidade torácica com uma tesoura e retire os pulmões usando uma pinça e tesouras estéreis. Enxágüe os pulmões três vezes em PBS para remover qualquer vestígio de sangue e coleta de 1,5 ml gelada RPMI. Manter no gelo.
6. Use um homogeneizador para homogeneizar os tecidos, coloque de volta no gelo.
7. Retire uma alíquota do tecido homogeneizado e usar isso para determinar a carga bacteriana. Preparar diluições de série do homogeneizado de tecido e na placa HBA. Placas de cultura a 37 ° C por 18-24 horas e determinar a contagem viável. Os títulos de bactérias em um determinado órgão pode então ser correlacionado com o número de fótons observados na região.
8. Centrifugar o resto do tecido homogeneizado a 3.500 rpm por 10 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante e transferir para limpar, tubos estéreis. Loja sobrenadante a -70 ° C e determinar título viral pelo ensaio de placa.

6. Ensaio de placa para determinar influenza A título de vírus em tecidos homogeneizados

1. Títulos de infectividade do vírus são determinadas pela formação de placas em monocamadas confluentes de Madin-Darby canine kidney (MDCK) células. Células MDCK são rotineiramente cultivadas em RF10 (Tabela 1) em frascos de cultura de tecidos (Nunc) e várias passagens quando confluentes.
2. Separar as células MDCK a partir de garrafas de cultura de tecidos usando tripsina. Lave as células de RF10 e recolher as células por centrifugação a 1200 rpm por 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células peletizada em RF10. Contar as células MDCK utilizando um hemocitômetro e corante vital. Semente de cada 35 milímetros bem de 6 bem-placas (Nunc) com 1.2x10 ⁶ células MDCK em 3ml RF10 e cultura as células a 37 ° C e CO ₂ 5% para atingir confluência (em ~ 24 horas).
3. Prepare Leibovitz dsL15 mídia e 1,8% (w / v) de agarose overlay mídia (Tabela 1). Alíquota dsL15 mídia e 1,8% (w / v) de agarose em 50mL em frascos esterilizados. Mantenha dsL15 media a 4 ° C até C ° uso e agarose a 56 até o uso.
4. Verifique se as monocamadas de células MDCK são confluentes e lavar as células com RPMI + pela aspiração do RF10 e substituí-lo com ~ 1,5 ml RPMI +. Em nenhuma fase do procedimento deve ser permitido que as placas para secar completamente. Incubar as placas a 37 ° C até que esteja pronto para adicionar as amostras contendo vírus.
5. Prepare diluições seriadas das amostras de vírus em RPMI +. Manter as amostras em gelo até o uso.
6. Aspirar RPMI + do monocamadas e adicione 135uL RPMI + de diluições apropriadas da amostra de vírus a cada poço. Teste cada amostra em duplicata.
7. Incubar as células MDCK com as amostras do vírus por 45 min a 37 ° CO C e 5% _2. Agite suavemente as placas a cada 15 minutos para distribuir uniformemente o vírus e evitar o ressecamento da monocamadas de células MDCK.
8. Mover a agarose de 56 ° C a 46 ° C e banho de água quente dsL15 media a 46 ° C em banho-maria.
9. Após a incubação 45min do vírus no monocamadas MDCK, ter placas de 5% incubadora de CO _2. Remover agarose e L15 media de 46 ° C tanque. Adicionar 0,2 mL de tripsina 0,1% a 50 mL de dsL15 mídia, do que adicionar 50 ml de tripsina para dsL15 + 50 mL de 1,8% (w / v) de agarose. Misture a agarose e L15 delicadamente e adicionar 3 mL de meio de cobertura a cada poço das placas de 6 poços. Agite suavemente para garantir a monocamada de células MDCK inteiro é coberto. Uma vez que a sobreposição é set placas incubar a 37 ° C e 5% CO ₂ por 2-4 dias.
10. No final do período de incubação, contar o número de placas, como medida de vírus infectivity. Se necessário, as placas podem ser visualizados através da coloração das monocamadas com cristal violeta dissolvido em metanol.

7. Seção C - Segredos para o sucesso:

1 Todos os trabalhos experimentais com S. pneumoniae (por exemplo, a inoculação de culturas líquidas, o processamento de tecidos de camundongos infectados com S. pneumoniae) é realizada em uma classe II de Biossegurança Gabinete.

1,1 Criamos bioluminescentes S. pneumoniae através da introdução de cepas plasmídeo pPJTG28 ^3. No entanto, uma grande variedade de diferentes bioluminescentes S. cepas pneumoniae estão disponíveis 4-6. Bioluminescentes S. cepas pneumoniae também pode ser comprado de Caliper Life Sciences Inc (MA, EUA).

1,1 cinética de crescimento de S. vários cepas pneumoniae pode ser diferente e deve ser determinado para cada cepa. Pode demorar entre 3 a 4 horas para chegar OD600nm = 0,4-0,45.

1,4 Nós esperaria normalmente os estoques infecciosas para atingir a concentração de 10e8 UFC / ml e recomendar uma série de diluições de 10e-10e-4 a 8 para determinar a concentração de bactérias viáveis.

O título de 2,6 apropriado usar para inoculação dos ovos, depende da cepa do vírus usado e pode variar entre 10e-10e-3 para 5. Influenza A cepas de vírus obtidos a partir de sobrenadantes de cultura de tecidos pode às vezes ser utilizado puro.

3.2a Nós usam rotineiramente 2000 UFC de S. pneumoniae cepa EF3030 para colonizar cinco dias ratos velhos ^3. A dose infecciosa precisa do inóculo é determinada a posteriori para cada experimento por plaqueamento diluições do inóculo em placas de ágar sangue de cavalo. A capacidade do S. pneumoniae cepa para colonizar ratos é o primeiro determinado por contagem viável de homogeneizados de tecido (por exemplo, nasofaringe, pulmões) em vários intervalos de tempo após a inoculação dos camundongos.

3.2b Não é necessário usar anaestetics para administrar as bactérias ou vírus aos animais por via inalatória. Camundongos infantil (assim como camundongos adultos) deve ser restringida à mão e em posição vertical pelo investigador, o inóculo (3 microlitro de camundongos lactentes, até 10 microlitros de camundongos adultos) é, então, caiu sobre as narinas e inalação todos os inóculo é confirmada pela observação.

3.2c Remover ratos neonatal, um por um do ninho e inocular com bactérias ou vírus, conforme necessário. Marca a cauda do animal usando um marcador permanente se o animal necessária e voltar para gaiola imediatamente. Esfregue o animal com algum material de cama para que a barragem vai aceitar os filhotes de volta para o ninho. Nota: marcador permanente fricciona fora os animais de forma rápida e precisa ser re-aplicado diariamente. Alternativamente, um sistema de tatuagem pode ser usado para identificar animais individuais.

3,3 Usamos 20 PFU vírus influenza A Udorn/307/72 (H3N2) para infectar ratos 8-14 dias de idade 3. Mortalidade e morbidade observada nos animais depende da cepa de S. pneumoniae e vírus influenza A usados. A Tabela 3 fornece um conjunto útil de pontos finais e critérios de intervenção humana para uso em camundongos com idade inferior a 21 dias de idade. Nós normalmente não detectar qualquer mortalidade ou morbidade quando se utiliza S. EF3030 pneumoniae e vírus influenza A cepa Udorn/307/72 (H3N2), quando os ratos são> 10 dias.

4.2 Para ser exato, os camundongos podem ser pesados ​​antes da injeção da solução anestésica. Como um guia, a cerca de 50-75 microlitros de solução de anestésico é usado para 20 dias ratos velhos. O mouse é totalmente anestesiado quando não está respondendo a um beliscão na cauda ou dos membros posteriores. Enquanto no IVIS, os ratos também serão expostos a isoflurano que vai acrescentar a anestesia. O momento da imagem após a infecção dos camundongos depende da cepa (s) de S. pneumoniae e vírus influenza A utilizada, bem como sobre os sintomas de interesse. Executando uma experimentos-piloto poucos para otimizar o tempo de bioluminescent imagem pode ser necessária.

4,3 Ratos podem ser colocados em uma caixa de isolamento (que impede a entrada de contaminantes ou sair da caixa) ou, alternativamente, pode ser colocado diretamente no instrumento para geração de imagens. Nós usamos a caixa de isolamento para experimentos com camundongos lactentes, a fim de garantir os ratos permanecem anestesiados durante o procedimento de imagem e para evitar a contaminação do IVIS com S. pneumoniae e / ou vírus influenza A.

4.3 Utilização de uma imagem ventral dos ratos para obter uma imagem do trato respiratório. Uma imagem lateral do mouse proporciona uma imagem mais sensível das orelhas.

4.4 Quando ratos são colocados diretamente dentro da câmara, o isoflurano é entregue aos ratos através de cones de ogiva. Para experimentos em que ratos infantis são usados, a caixa de isolamento é o preferido desde os cones do nariz não se encaixam em camundongos lactentes.

4,5 Tele tempo total de exposição necessário para capturar uma imagem pode variar entre experiências de acordo com a força do sinal bioluminescente, a localização do sinal de tensão, bacteriana e da estirpe do mouse usado. Quanto a este último, tanto do pigmento da pele e pode significativamente atenuar o sinal total detectável. A câmera na Spectrum IVIS é um back-diluído, de volta iluminado CCD oferecendo uma ampla gama dinâmica (65536 níveis de cinza). Idealmente, o tempo de exposição deve ser ajustado para capturar entre 60 e 60.000 pontos. Em nossa experiência com camundongos C57BL / 6, aumentando o tempo de imagem além de 7 minutos não melhorar sensivelmente a relação sinal-ruído. Opções alternativas para aumentar o sinal bioluminescente incluem o aumento do grau de binning (ou seja, a grande) e usando um pequeno campo de visão. Importante, quantificação não deve ser realizada em áreas dentro da imagem que contenha pixels saturados, uma vez que oferece um valor subestimado para o número de fótons detectados. Se estiver em dúvida quanto às condições ideais, o recurso de auto-exposição pode ser usado como uma diretriz.

4.5 Se um sinal forte bioluminescentes em uma parte do rato está a obstruir a detecção de bioluminescência em uma região próxima, as regiões selecionadas do mouse pode ser coberto com papel preto e imagem pode continuar como normal

4.7 Se o sinal luminoso é quantificado em fótons (em oposição a contagens) variações nas condições de imagem (imagem tempo, por exemplo) entre os experimentos não afetarão a medição do sinal bioluminescente.

4,8 Se estiver usando o fluxo total para medir os fótons em uma região determinada, garantir que a mesma "região de interesse" forma é usado para todas as amostras.

Ratos 5.1a pode ser sacrificado em nenhum momento após a infecção com o vírus influenza A, dependendo do interesse do pesquisador. Nós normalmente determinam título bacterianas e virais em 6 dias após a infecção com o vírus influenza A Udorn/307/72 (H3N2) e não observar qualquer mortalidade / morbidade. No entanto, a morbidade ea mortalidade observada nesses experimentos vai variar dependendo do S.pneumoniae e influenza A cepa do vírus utilizado eo momento chosed devem ter taxas de mortalidade e morbidade em conta para minimizar o impacto no bem-estar animal. A Tabela 3 fornece um guia útil para critérios de intervenção humana e terminais para uso nesses experimentos. Geralmente, os ratos são sacrificados e os tecidos processados, conforme descrito dentro de 3 horas após in vivo bioluminescente de imagem.

5.1b Ratos com idade inferior a 10 dias de idade são resistentes à hipóxia e são sacrificados por decapitação. Na configuração descrita experimental, os ratos são pelo menos 14 dias de idade e podem ser sacrificados por asfixia CO _2.

5,7 agar-sangue placas podem ser complementados com 5μg/ml gentamicina para impedir o crescimento de bactérias comensais em homogeneizados de tecidos nasal. A gama de diluições utilizadas dependerá da S. pneumoniae cepa utilizada. Para experimentos em camundongos 20 dias de idade com S. pneumoniae cepa EF3030, usamos puro, 10e-1, 10e-10e-2 e 3.

5,8 Loja cada amostra de tecido homogeneizado em pelo menos duas alíquotas, de modo que uma amostra de backup está disponível, caso o ensaio de placa vírus não! Um título precisa viral só pode ser obtido a partir de uma amostra, uma vez descongelado após o congelamento, mas não a partir de amostras repetidamente freeze-descongelado.

6.1 Quando cresceu confluentes 9-10%, um único frasco de 150 centímetros ² de cultura de tecido vai produzir células MDCK suficiente para cinco 6-lamelas.

O ideal 6,5 diluição de série vai depender do tipo de vírus utilizado eo tempo após a infecção. Normalmente, nós usaríamos puro, 10e-10e-1 e 2 diluições para órgão homogeneizados tomadas seis dias após a infecção com vírus da gripe A.

6,6 O uso de diluições em série de ações é um vírus adequada para controlo positivo para o uso em cada ensaio de placa. Como controle negativo, RPMI + pode ser usado.

8. Resultados representativos:

Figura 1. Esquema do ovo de galinha embrionados.

Figura 2. BLI de S. pneumoniae do mouse infectados no dia 3 e dia 4 após a infecção simulada com vírus da gripe.

Figura 3. BLI de S. pneumoniae e vírus influenza do mouse co-infectados no dia 3 e dia 4 após a infecção com o vírus influenza.

Figura 4. Carga bacteriana no nariz de um único e uma co-infecçãoted mouse.

Figura 5. Títulos virais no nariz e no pulmão de um rato co-infectados.

Mídia	Conteúdo
1,8% (w / v) Agarose	Adicionar 0,9 grama de agarose a 50 mL H 2 O destilada, esterilizar em autoclave a 121 ° C por 10 min. Transferência para 56 ° C banho para esfriar.
Médio dupla força Leibovitz L15 (ds L15)	Uma bolsa de L15 pó (para compensar 1E) é dissolvido em 450 mL destilada estéril H 2 O e agitado até dissolver. O pH é ajustado para pH 6,8 com 1M HCl. Em seguida, completar com 4mL de 7% (w / v) NaHCO3, 0,4 ml HEPES (pH, 0,5 M 6,8), 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 60 mg / ml de gentamicina. Ajustar o volume final de 500mL e filtro de esterilizar.
Agar Sangue cavalo (HBA)	4% HBA (Oxoid, Basingstoke, UK), dH 2 O, 7% (v / v) de sangue do cavalo
RF10	RPMI-1640 contendo 2mM de glutamina, piruvato de sódio 2nm, 24 mcg / ml de gentamicina, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml, 10% (v / v), inativado pelo calor soro fetal bovino.
RPMI +	RPMI-1640 contendo 2mM de glutamina, piruvato de sódio 2nm, 24 mcg / ml de gentamicina, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml
Todd-Hewitt Caldo + extrato de levedura 0,5%	Todd Hewitt Broth (Oxoid, Basingstoke, UK) em dH 2 O suplementado com 2% (w / v) de extrato de levedura

Tabela 1. Mídia específicas utilizadas no presente protocolo.

Nome do material	Tipo	Companhia	Número Catálogo	Comentário
Meio RPMI 1640	Reagente	Gibco	21870-076
Tripsina	Reagente	Worthington Corporação Bioquímica	LS003740	TPCK tratados
Meio Leibovitz L-15	Reagente	Gibco	41300-039
Agarose, tipo I	Reagente	Sigma-Aldrich	A6013	Use baixa temperatura de fusão agarose, como SeaPlaque agarose
Madin-Darby Canine Kidney células	Reagente	ATCC	CCL-34

Tabela 2 reagentes específicos e equipamentos.:

Efeito sobre o bem-estar animal
	Leve a moderada sinais um	B sinais severos
Não-específica sinal (s):
Aparência	Leve a moderada piloereção sem desidratação (tenting pele)	Piloereção, com desidratação (tenting pele)
Condição corporal	ganho de peso reduzido	Nenhum ganho de peso ou redução do peso
Comportamento	Subjugado, mas responsável, diminuição da interação com os pares.	Responder à atividade e provocações. Isolado de outros littermates
Condições específicas ou sinal clínico anormal (s):
Ausência de mancha de leite (<2-3 dias de idade)	Tentar incentivar amamentação se isso tem sido observado para <24h.	Se nenhuma evidência de leite local, mesmo com encorajamento após 24-48h, ou se, obviamente, não tem amamentado, considere a eutanásia.
Outros sinais	Procuram animais Facility Manager / Laboratory Animal re conselho veterinário: ação apropriada ou eutanásia se o animal está com dor moderada ou severa ou sofrimento

Tabela 3. Critérios de intervenção para camundongos lactentes (<21 dias de idade):

^um Quando um ou mais "leve a moderada 'sinais são observados aumento da freqüência de observações de duas vezes por dia e procurar aconselhamento de oficial de bem-estar animal sempre que necessário para que o tratamento e os cuidados podem ser dadas.

^b Quando um ou mais "severo" sinais são observados, eutanásia os ratos usandométodo apropriado. Ratos <10 dias de idade são sacrificados por decapitação, camundongos> 10 dias são sacrificados por asfixia CO _2.

Discussion

In vivo de imagens com a máquina IVIS é uma metodologia exclusiva que permite a visualização em tempo real da patogênese microbiana ^{4, 6-9.} Aqui, mostramos a aplicação desta tecnologia para a compreensão do sinergismo entre S. pneumoniae e vírus influenza em camundongos lactentes. Devido à natureza não-invasiva desta técnica, temos sido capazes de monitorar a progressão da infecção em cada rato individuais ao longo do tempo. Isto permitiu-nos para documentar a cinética de transmissão pneumocócica entre camundongos co-infantil alojados ^3. A natureza não-invasiva desta técnica permite aos pesquisadores usar menos animais por experimento e, portanto, reduzir o uso de animais. Também é possível usar a máquina IVIS para visualizar a disseminação da infecção para locais previamente desconhecida de infecção no organismo, bem como sites que não são facilmente amostradas por dissecção (como o ouvido médio).

Antes de se iniciar os experimentos de imagem, que confirmaram que os níveis de colonização da cepa EF3030 bioluminescentes foram comparáveis ​​aos níveis de colonização da estirpe EF3030 enumerando Contagem em homogeneizados de tecido. Além disso, confirmou que a primeira infecção pelo vírus da influenza resultaram em aumento da carga de bioluminescent EF3030 na nasofaringe de animais colonizados como ficou demonstrado com a estirpe EF3030 (resultados não mostrados).

Embora a tecnologia IVIS é fácil de operar e gera reprodutível e fácil de entender os dados, os experimentos devem ser cuidadosamente projetado de modo que a sensibilidade ea utilidade da tecnologia é maximizado. Por exemplo, a sensibilidade da câmera IVIS é afetada pela profundidade e opacidade do tecido ^8, que em nossa experiência, aumenta o limite de detecção de sinais bioluminescentes originário dos pulmões. Além disso, pêlo escuro e pele pigmentada reduz a transmissão de luz em até 10 vezes (em comparação com camundongos sem pêlo) ^8. Durante o desenvolvimento deste método, temos este protocolo otimizado para uso com 5-14 dias de idade C57BL / 6 e camundongos têm demonstrado que desde IVIS pode ser usado para detectar a colonização de 20 dias de idade C57BL / 6 ratos com bioluminescent S. pneumoniae EF3030. No entanto, a detecção do sinal pode ser aumentada quando estes experimentos são realizados em camundongos nus ou BALB / c. No entanto, a câmera IVIS representa uma nova abordagem para monitorar, caracterizar e, finalmente, compreender o desenvolvimento in vivo da doença pneumocócica seguintes influenza A infecção pelo vírus.