Summary
様々な生物学的システムにおける生体電流を測定する非侵襲的な振動プローブの製造、キャリブレーションおよび使用が記載されている。
Abstract
イオンの能動輸送によって生成された電場は、、多くの生物系に存在し、多くの場合、組織や臓器の重要な役割を果たします。例えば、彼らは、創傷治癒中に細胞遊走を誘導する上で重要な役割を果たします。ここでは、細胞外の電流を測定するための超高感度振動プローブの製造と使用について説明します。プローブは、生理食塩水でμA/ cm 2の範囲でイオン電流を検出できる小型の白金黒の先端（30〜35ミクロン）、との絶縁、尖った金属線です。プローブは、圧電ベンダーによって約200 Hzで振動する。イオン電流の存在下では、プローブはその運動の両極端の間の電圧差を検出する。ロックイン振動のプローブの周波数にロックすることで外部ノイズ増幅器出力フィルタ。データはコンピューターに記録されます。プローブは、正確に1.5μA/ cm 2の電流を適用するチャンバーを使用して、適切な生理食塩水での実験の開始時と終了時に較正されています。我々は、プローブを作るシステムを設定し、キャリブレーションする方法について説明します。我々はまた、角膜の測定の手法を明らかにし、別の標本（角膜、皮膚、脳）からいくつかの代表的な結果を示す。
Protocol
1。プローブ製造
ブランクプローブは、世界の精密機器（elgiloy /ステンレスパリレンコーティングされた微小電極）（以下"特定の試薬と機器の表"を参照）から購入しています。プローブは、良好な接続を確保するためにメス（＃11ブレード）で掻き切り取った部分は先端の後ろに25〜30ミリメートルとパリレン絶縁体の約5mmをカットしている。プローブは、導電性銀負荷エポキシ（例えばライト=洛SL65）[*下記の注参照]を使用して金R30コネクタに取り付けられている。プローブは、硬化のエポキシを可能にするために、室温で一晩保存されます。次に、プローブ先端がナノアンペアの電源を使用して、金や、白金でメッキされています。プローブ先端をアセトンで洗浄し、ナノアンペアの電源の負出力に接続されている。プローブ先端は、解剖顕微鏡（X40）で観察し、金めっき液（カリウムdicyanoaurate（0.2％w / vのKAU（CN）蒸留水で2（のdH 2 O））に最初に配置されます。ポジティブに接続された基準線が出力とソリューションに配置は回路を完了します。先端が約半分の所望の最終サイズ（約10-15μm）となるまで。プローブの先端がDHで洗浄さ5の電流はnAのが20 nAに増加し、5分間適用されている2 Oとし、ソリューションをplatinizingに配置（塩化白金酸水和物、1％w / vのH2PtCl6 * 6H 2 O）を加えたのdH 2の鉛（II）、酢酸ナトリウム三水和物（0.1％w / vの鉛（CH3CO 2）2 * 3H 2 O O）。先端が所望の最終サイズの約80％になるまで。電流は1μAに増加し、最終的な先端の直径になるまで1秒のバーストで適用されるNAが500 nAに増加し、5分間適用されている250の現在の（約30〜35ミクロン）が得られる。最後に、先端がのdH 2 Oをプローブでリンスされ、無期限常温で保管することができます。プローブは破損している場合は、金のR30コネクタが再利用することができます。
[*注：一部のプローブシステムは、信号を運ぶために、アンプに直接接続されている取り付けプローブを持っている。他のシステムは別々のマウントポイントと信号のコネクタを持っている。後者のケースでは、一方の端にR30コネクタ付き短い（2-3 cm）の線は、プローブを取り付ける前に最初のR30コネクタ（図2Aを参照）に半田付けされる。]
2。プローブシステム
プローブは、3次元マイクロポジショナー（図1）に搭載された圧電ベンダーに添付されます。プローブの振動は、振動の振幅と周波数の調整を可能にする振動プローブの電源によって制御されます。プローブ電源はロックインアンプ、また振動の周波数と位相角を表示するために基準信号を送信します。それはまた、1つは、プローブの振動を素早く視覚的に参照を持つようにオシロスコープを接続すると便利です。プローブからの信号はロックインアンプになります。測定するプローブと試料は、光ファイバ照明付き解剖顕微鏡（X40に倍率X6）で表示することができます。キャリブレーションと試料測定時には、リファレンスとグラウンド（アース）線は（図2Bを参照）ソリューションになっている必要があります。アンプはアナログ - デジタル（I / O）インタフェースを介してコンピュータに接続されている。データは、ストラスクライド電気生理学ソフトウェアの細胞全体のプログラム（WinWCP）を使用して記録されます。
ロックインアンプの設定：感度[200μV]、動的解像度[ノーマル]、オフセット[上]、展開して[X1]、時定数：プレ[10秒]、後[0.1秒]。高速応答が必要な場合は、事前に時定数は3秒に減少させることができます。オフセット制御は、画面の中央付近にプローブのトレースを実現するために使用されます。大きな応答が予想される場合、トレースは、上下に移動することができます。
WCPソフトウェアの設定：録音時間[204.8 s]で、チャンネルあたりのサンプル数[1024]、サンプリング間隔[0.2秒]、電圧範囲[+ / - 0.2 V]。大電流が予想されている場合、電圧範囲は、1 Vまたは5に増やすことができますV.
3。プローブの設定
新しいプローブは、テストする必要がありますし、独自の周波数と位相角が決定。新しいプローブは、生理食塩水（図2B）を含むキャリブレーションチャンバー内に配置されます。電源がオンになり、最大の振動が観測されるまで、周波数は最大になっています。これは、プローブの共振周波数です。この周波数でプローブを使用すると不安定になると、録音のノイズを作り出すことができる、プローブはプローブの動作周波数（通常は150〜200 Hz）を与えるために10 Hzのを差し引くことにより"脱同調"ですので。振動の振幅は、プローブ振動の距離が（図2Bを参照）プローブは、プローブ先端の"二重像を"振動させるときに見られるように、先端の直径と同じになるように調整されます。位相角を決定するために、プローブが校正室とを繰り返し適用1.5μA/ cm 2の電流に生理食塩水に配置されます。応答がなけれまで、ロックインアンプで位相角が調整されます。このために90 °を加算または減算する角度は、最大応答を示し、この角度は、プローブの作業位相角です。各プローブの周波数と位相角は、将来使用するために記載されています。実験の間、これはプローブの応答を変更するので、周波数、振幅および位相角のこれらの設定が変更されていないことが重要です。便宜のため、現在は"南から北"を流れているとき、これは"北 - 南に"記録のトレースの上行性動揺（"ピーク"ここに呼ばれる）、および流れる電流を生成する必要があります下方偏向を表示する必要があります（ ）図3Aを参照してください。これは間違った方法である場合、位相角に180 °を追加すると、応答のラウンドを反転させることにそれを修正します。プローブ関数の背後にある理論、校正等の詳細については、リードら 1を参照してください
校正：正確に1.5μA/ cm 2で 、キャリブレーションチャンバ内のプローブに適用される、の"標準化"現在のプローブの応答は（図2B、3Aを参照してください）サンプルの電流を計算するために使用されます。前のサンプルの測定に、プローブは、適切な解決策、例えば、BSS +角膜のための人工涙液で校正されます。サンプルの向きに応じて、それぞれ、上向きと下向きのたわみを生産、南北と南北外向きと内向き電流に相当する：現在は2つの方向に適用されます。プローブのトレースは、安定したベースラインと低ノイズ（図比較。3Aおよび3B）に設定する必要があります。プローブは、蒸発による浸透圧変化を補正するために使用される溶液中での実験の終了時に較正されています。データを分析する際に、実験の前半からの測定値は、エンドキャリブレーションを使用して計算下半期からキャリブレーション値、および測定値を用いて計算することができます。
サンプルの測定：チャンバーは、試料を保持し、固定するために設計される場合があります。たとえば、図3Cは、角膜の測定に目を保持するためにワイヤループ付きペトリ皿を示しています。生理食塩水を含む料理は解剖顕微鏡およびビューのフィールドにフォーカスに置かれた試料上で関心領域の下に置かれている。それが測定する試料上の点と同じレベルになるようにプローブは、フォーカスでも試料表面にソリューションと指向並列に配置しています。プローブが離れてサンプルから（例えば1〜2センチメートル）限り都合が良いときに移動される、振動が安定（水平方向）のベースラインを（図4Aを参照）を確立するために（そしてレコードに設定されたコンピュータソフトウェア）をオン。プローブは、表面から50μm程度、測定位置に移動されます。新しい（'ピーク'）の値が安定している場合、プローブは、基準の位置に戻され、トレースは、ベースラインに戻ります。これは、タイムラプスデータを生成するために定期的な時点で繰り返さ、またはサンプルは（図4bを参照してください、5B）に移動/わずかに回転し、空間的な現在のマッピングデータを得るために異なる位置に繰り返すことができます。
データ分析：データはWinWCPを（図5Aを参照）を使用して分析する。それは前の測定ピークへのトレースのベースラインと平行になるように水平方向の赤い'ゼロ'の行が上下に移動される。緑色の縦測定ラインは、トレースのベースラインに横切って移動する。緑のラインの下部にある緑色の読み込み出力はゼロに近い（例えば0.00012）にしてください。この数字は、赤と緑の線が交差する点、および青のトレース間differnceを示しています。それは、ピークの上部と平行になるまで、赤い線は、上に移動されています。緑色の出力の読み取りはmVのピークの大きさです。すべての測定のピークのデータ、およびキャリブレーションデータは、Microsoft Excelスプレッドシートのテンプレート（表1参照）に入れられます。このような日付、プローブの数、電圧の範囲（VR）、ソリューションが使用されて、位置を測定、タイムポイント、などの関連情報は、スプレッドシートに入れることができます。現在の方向（試料の内部または外部には："I / O"）記録され、内向き電流は、"ピーク"の列に負の値を与えられます。右列の電流値は次の式を使用して計算されます：1.5キャリブレーションで適用μA/ cm 2での電流である電流=ピーク*（1.5/calibrationを）。このように："unw1'= 12.45 *（1.5/56.12）= 0.33276907μA/ cm 2である 。
4。成功の秘訣
すべての電気生理学のように、重要な機器の適切な接地（アース）は、ノイズを除去するのに役立ちます。従って、少なくともマイクロポジショナーと顕微鏡の筐体は接地されるべきである、そしておそらくまた、光源（図1参照）。ユーザーはまた、静電気の発生源になることができるので、手首バンドを介してアースにはいくつかのケースでは、プローブの不安定性を防ぐことができますが、必ずしも必要ではない。ロックで離れて周波数からのすべての周波数（例えば60Hzの電力網から）増幅器出力フィルタープローブがで振動しているとして、ファラデーケージには、必要ありません。防振台は便利ですが必須ではありません。固体、安定したベンチやテーブルも同様に使えます。離れて基本から写真は顕微鏡の下に撮影している場合はExcelスプレッドシート内の情報が（上記参照）、そのような温度の変化、薬剤の追加、などなど、1つの研究室 - 書籍その他の有用な情報に記録しておくと便利です、倍率に注意してください。該当する場合、それは（図6を参照）の位置および/またはプローブの測定値の方向を示すサンプル（s）のスケッチを描くのにも便利です。
挑戦的な手順
- プローブは、作成：プローブおよびR30コネクタ間の良好な電気的な接続が存在する必要があります。何も電気の段階で起こらない場合、これはおそらく原因です。
- キャリブレーション：あなたが測定されるサンプルのために適切な生理食塩水または培養液を使用する。範囲超過またはこれに応答を変更できるようにキャリブレーションチャンバーを下に、記入しないでください。液体の表面は、チャンバの上部に平らにしてください。
- サンプルの測定値：事前に計画、例えば、あなたが（図3Cを参照）、サンプルホールド/マウントする特殊なチャンバーをする必要がありますか？サンプルから測定するとき、プローブは振動のプローブの方向が（したがって、現在の方向が測定される）、試料表面に対して垂直になるように、試料表面に長軸と平行に配向してください（例えば、図4bを参照してください）。サンプルは、および/または異なる位置での測定のための回転移動することができます。測定プローブと試料表面との間の一定の距離を維持することが重要です。測定された電流は、試料表面からの距離に比例し、プローブが試料表面、逆二乗の法則による電流低下から離れて移動するとして。つまり、試料表面に発生する電流を測定するとき、検出された電流は、表面からの距離の二乗に反比例する。接眼レンズの目盛りは、プローブと試料表面間の距離を判断するために使用することができます。
トラブルシューティング
- 問題：キャリブレーションで応答なし。解決策：チェック生理食塩水は両方の電極に接触している。定電流校正器でバッテリを確認してください。
- 問題：小さな応答。解決策：のdH 2 Oおよび/ またはアセトンできれいなプローブ。位相角を確認してください。
- 問題：ノイズや不安定なベースライン（図3Bを参照）。解決策：アース線を確認してください。
- 問題：画面オフトレースジャンプ。解決策：プローブ先端が試料に触れないようにしてください。
5。代表的な結果
図3Aは、キャリブレーショントレースの良い例を示しています。安定（水平）ベースライン、低ノイズと大きな応答に注意してください。比較として、図3Bは、不安定なベースラインとノイズの多いトレースを示しています。マウスの角膜の傷では異なる位置での電流の測定結果を図4Bに示されています。トップパネルは、プローブの位置を示し、中央のパネルには、コンピュータに記録されたプローブのトレースを示し、下部のパネルには現在の傷のプロファイルを示す、異なる位置での電流のグラフである。図5Bは、傷、現在の時間経過でデータを生成するために定期的な時間間隔で行われたマウスの皮膚創傷における測定結果を示しています。
図1振動プローブシステム。詳細な説明のテキストを参照してください。青色のテキストは、接続ワイヤの機能を説明します。緑のシンボルは、アースポイントを示しています。
図2。A.プローブの取付け。プローブは、前のelectroporatingに、銀負荷エポキシで金メダルR30コネクタに接着される。いくつかのシステムでは、信号を運ぶために、短い線で2つ目のコネクタは上半田付けされている。スケールバー3ミリメートル。プラチナのボールは実寸ではありません。 B.プローブキャリブレーション。定電流校正器は、（左）校正室（右）におけるプローブ〜1.5μA/ cm 2の電流を印加。左下：プローブのクローズアップ。先端の二重像が見られるようにプローブを振動されている場合（右下）、振幅が調整されます。スケールバーは100μm。
図3。A.プローブのキャリブレーションのトレース。安定したベースライン、低ノイズと大きな応答との良好なプローブのキャリブレーションのトレースの例、。現在流れて南から北が上向きのたわみを与え、そして北から南を流れる電流は、下向きのたわみを生成します。不安定な、ノイズの多いプローブのトレースを。B.。 C.チェンバースは、取付けマウス（左）またはラット（右）角膜の測定のための目のために作ら。 5ミリメートルスケールバー。
図4の測定例を証明せよ。 A.安定したベースラインは、サンプルから基準位置1-2のプローブを用いて確立されます。プローブがサンプルに近い位置を測定するために移動されると、それが検出され現在とトレースは（外向き電流）上向きに偏向する。マウスの角膜内の異なる位置でのBの測定でしょう。プローブが表面に配向平行なので、振動が垂直である。上向きのピークは、外向き電流を示しています。最大電流は、創傷の端（ポジションB＆F）で見られる。プローブの回路図は、位置F（右巻きのエッジ）を測定することで表示されます。スケールバーは300μm。
図5。A.プローブのトレースを分析する。上部パネル：緑の出力の読み取り値がゼロ（0.00012）に近いので、トレースのベースラインと平行になるように、赤ゼロラインを上下に移動され、その後、緑色の測定ラインがベースラインに横切って移動する。下部パネル：赤い線は、それがトレースのピークの上部と平行になるまで移動、および出力の測定値はmVのピーク（12.45）の大きさを与えるている。現在は、キャリブレーションデータを（表1参照）を使用して、ここから計算されます。 B.マウスの皮膚は、タイムラプスデータを巻いた。負傷する前に現在の時間ゼロ（赤の記号）で示されています。測定は、傷付け後、通常の時点においてのマウスの皮膚創傷で同じ位置で行われた。初期過渡内向き電流（以下ゼロ）の後、現在は逆転し、外向き電流は、（正）ゆっくりと上昇し、出世が頭打ちになった。
図6。プローブの測定位置を示すラボブックスケッチ。 A.ラット脳、赤いドットは、測定位置とプローブシンボルは、プローブの向きを示す表示。 B.ラット角膜の傷、赤い点は測定位置を示し、矢印は、現在の測定の方向を示しています。
表1。プローブデータを格納し、定量化するためのExcelスプレッドシートの例。 pN2_cal1は=キャリブレーションを開始し、CAL +とCAL - = mVでキャリブレーション値、VR =電圧範囲、mVでピーク=サンプル測定、現在のI / O =フロー（サンプルの内や外）。
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Discussion
我々は低コスト、基本的な、しかし生物系の様々な非侵襲的に電流を測定するための高感度な振動プローブシステムを説明します。
可能な限り修正
- プラチナ/イリジウム電極（世界の精密機器、猫＃PTM23B20が）場合、ステンレス鋼の代わりに使用されている、その後、金めっきの段階を排除することができます。
アプリケーション
我々は、で電流を測定するために振動プローブを使用している：ラットの角膜2、ラットのレンズ3,4、マウスの皮膚5、 アフリカツメガエルのオタマジャクシ6、人間の皮膚7、人間の角膜8;ゼブラフィッシュ胚1、細胞性粘菌1、ラットの脳1。振動プローブは、最初のジャフとNuccitelli 9によって記述されていた。二次元で電流を測定するコンピュータ制御のプローブは、10をも記載されている。関連する興味深いレビューはまた11月13日含まれています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は教授のリチャードBorgens、振動プローブシステムを組み立てるに助け麻痺の研究、パデュー大学、センターに感謝しています。この研究は、MZとBRに、そして一部の再生医療研究所カリフォルニアRB1 - 01417、NSF MCB - 0951199、からの補助金によって、失明を防ぐための研究からUnrestrictedグラント、カリフォルニア大学デービス校の眼科でNEIの助成金NIH 1R01EY019101によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eligoy-Stainless Electrode | World Precision Instruments, Inc. | SSM33A70 | 76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip |
| Gold R30 connector | www.vectorelect.com | R30 | Re-usable |
| Silver-loaded epoxy | 3M | SL65 | Mix 1-part Resin with 1-part Hardener |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ40 | Magnification x6 to x40 |
| Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2) | Sigma-Aldrich | 379867 | CAUTION: Toxic |
| Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O) | Sigma-Aldrich | 520896 | CAUTION: Toxic |
| Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O) | Sigma-Aldrich | 185191 | CAUTION: Toxic |
| Nano-Amp power source | Home made | - | Powered by six 1.5 V (AAA) batteries |
| 3-dimensional micro-positioner | Line Tool Co. | Model H | |
| Lock-in amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Digital I/O interface | National Instruments | PCI-6220 | |
| Shielded Connector Block with BNC connections | National Instruments | BNC-2110 | |
| Strathclyde Electrophysiology Software | University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK | WinWCP V4.1.5 | Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm |
| Calibration Chamber | Home made | ||
| Constant Current Calibrator | Vibrating Probe Company | Powered by one 9 V (PP3) battery |
References
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