Summary
La fabrication, l'étalonnage et l'utilisation de la non-invasive des sondes vibrant pour mesurer le courant bioélectrique dans divers systèmes biologiques est décrite.
Abstract
Les champs électriques, générés par le transport actif des ions, sont présents dans de nombreux systèmes biologiques et servent souvent d'importantes fonctions dans les tissus et organes. Par exemple, ils jouent un rôle important dans la direction de la migration des cellules lors de la cicatrisation. Nous décrivons ici la fabrication et l'utilisation de sondes ultra vibrant pour mesurer les courants électriques extracellulaire. La sonde est un isolant, fil de métal aiguisé avec une petite pointe de noir de platine (30-35 um), qui peut détecter des courants ioniques dans le pA / cm 2 dans du sérum physiologique large. La sonde est mise en vibration à environ 200 Hz par un piézoélectriques Bender. En présence d'un courant ionique, la sonde détecte une différence de tension entre les extrêmes de son mouvement. Un lock-dans des filtres amplificateurs à bruit parasite en verrouillant à la fréquence de la sonde de vibration. Les données sont enregistrées sur ordinateur. La sonde est étalonnée en début et en fin d'expériences dans une solution saline appropriée, en utilisant une chambre qui applique un courant de 1,5 pA exactement / cm 2. Nous décrivons comment faire des sondes, configurer le système et les calibrer. Nous démontrons également la technique de mesure la cornée, et de montrer quelques résultats représentatifs à partir de spécimens différents (cornée, peau, du cerveau).
Protocol
1. Sonde Fabrication
Blank sondes sont achetés auprès d'instruments de précision du monde (Elgiloy / inox parylène enduits microélectrodes) (voir «Tableau des réactifs et équipements spécifiques» ci-dessous). La sonde est coupée 25-30 mm derrière la pointe et d'environ 5 mm d'isolant parylène à l'extrémité coupée gratté avec un scalpel (lame n ° 11) pour assurer une bonne connexion. La sonde est montée dans un connecteur d'or R30 utilisant des liaisons électriquement conductrices argent chargée époxy (par exemple, Rite-Lok SL65) [* voir note ci-dessous]. La sonde est stockée pendant la nuit à température ambiante pour permettre à l'époxy à durcir. Ensuite, la sonde est plaquée d'or et de platine, en utilisant une alimentation de nano-ampères. La pointe de la sonde est rincée à l'acétone et connecté à la sortie négative d'une source d'alimentation de nano-ampères. La pointe de la sonde est considérée sous un microscope à dissection (x40) et placé en premier dans une solution de placage à l'or (dicyanoaurate de potassium (0,2% p / v UAE (CN) 2 dans l'eau distillée (dH 2 O)). Un fil de référence relié à la borne positive sortie et placés dans une solution complète le circuit. Un courant de 5 nA est appliquée pendant 5 min, puis augmentée à 20 nA jusqu'à la pointe est environ la moitié de la taille finale désirée (environ 10-15 m). La pointe de la sonde est rincée en DH 2 O, puis placé dans une solution platinisation (hydrate d'acide chloroplatinique; 1% p / v H2PtCl6 * 6H 2 O) et de plomb (II) trihydrate d'acétate (0,1% p / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3 H 2 O 2 en DH O). Un courant de 250 nA est appliquée pendant 5 min, puis augmentée à 500 nA jusqu'à la pointe est d'environ 80% de la taille finale souhaitée. Le courant est passé à 1 uA et appliquée en éclats les 1 sec jusqu'à ce que le diamètre de l'extrémité finale est obtenue (environ 30-35 um). Enfin, l'extrémité est rincée dans Sondes dH O. 2 peuvent être conservés à température ambiante indéfiniment. Si les sondes sont endommagés, la R30 d'or connecteurs peuvent être réutilisés.
[* Note: Certains systèmes de sondes ont la sonde de montage directement relié à l'amplificateur pour transporter le signal. D'autres systèmes ont un point distinct de montage et le connecteur de signal. Dans ce dernier cas, un court (2-3 cm) de fil avec un connecteur R30 à une extrémité est soudée à la première R30 connecteur avant montage de la sonde (voir figure 2A).]
2. Sonde système
La sonde est attachée à une cintreuse piézo-électriques montés sur un 3-dimensionnelle des micro-positionneur (figure 1). Vibrations de la sonde est contrôlé par l'alimentation sonde vibrante qui permet également le réglage de l'amplitude de vibration et de fréquence. L'alimentation de sonde envoie un signal de référence à l'amplificateur lock-in, qui affiche également la fréquence de vibration et de l'angle de phase. Il est également utile pour connecter un oscilloscope ainsi on a une référence visuelle rapide des vibrations de la sonde. Le signal de la sonde va à l'amplificateur lock-in. La sonde et l'échantillon à mesurer peuvent être visualisées avec un microscope à dissection (grossissement x6 à x40) avec éclairage par fibre optique. Lors des mesures d'étalonnage et d'échantillonnage, une référence et un sol (terre) fil doit être dans la solution (voir figure 2B). L'amplificateur est connecté à un ordinateur via un convertisseur analogique-numérique (I / O) de l'interface. Les données sont enregistrées à l'aide du programme Strathclyde électrophysiologie Software cellules entières (WinWCP).
Réglages de l'amplificateur: Sensibilité [200 mV], Résolution dynamique [normal], Offset [sur], Expand [x1], Constante de temps: pré [10 s], après [0,1 s]. Si une réponse plus rapide est nécessaire, le temps de pré constante peut être réduite à 3 s. La commande déportée est utilisée pour amener la trace sonde à proximité du centre de l'écran. Si les réponses grands sont attendus, la trace peut être déplacée vers le haut ou vers le bas.
WCP paramètres du logiciel: Durée d'enregistrement [204.8 s], échantillons par canal [1024], l'intervalle d'échantillonnage [0,2 s], plage de tension [+ / - 0,2 V]. Si des courants importants sont prévus, la plage de tension peut être augmentée à 1 V ou 5 V.
3. Réglages de la sonde
Nouvelles sondes doivent être testés et leur fréquence unique et angle de phase déterminée. La nouvelle sonde est placée dans la chambre d'étalonnage contenant du sérum physiologique (figure 2B). L'alimentation est sous tension et la fréquence tournée jusqu'à la vibration maximale est observée. C'est la fréquence de résonance de la sonde. Utilisation de la sonde à cette fréquence peut entraîner l'instabilité et de produire du bruit dans l'enregistrement, alors la sonde est "désyntonisé» en soustrayant 10 Hz pour donner fréquence de travail de la sonde (généralement 150-200 Hz). L'amplitude de vibration est ajustée de telle sorte que la distance de vibration sonde est le même que le diamètre de la pointe, de sorte que lorsque la sonde est mise en vibration un "double image" de la pointe de la sonde est considéré (voir figure 2B). Pour déterminer l'angle de phase, la sonde est placée dans une solution saline dans la chambre d'étalonnage et un courant de 1,5 mA / cm 2 appliquée à plusieurs reprises. L'angle de phase sur l'amplificateur lock-in est ajustée jusqu'à ce qu'il n'y a pas de réponse. Ajoutant ou en retranchant 90 ° à cetteAngle donne la réponse maximale, et cet angle est l'angle de la sonde phase de travail. L'angle de la fréquence et de phase pour chaque sonde sont indiquées pour une utilisation future. Pendant une expérience, il est important que ces paramètres de l'angle de la fréquence, d'amplitude et de phase ne sont pas modifiés, comme cela va modifier la réponse de la sonde. Pour plus de commodité, quand le courant passe "Sud-Nord», ce qui devrait produire une déflexion vers le haut (appelé ici «pic») dans la trace d'enregistrement, et courant »du Nord-Sud» devrait montrer une déviation vers le bas ( voir Figure 3A). Si ce n'est dans le mauvais sens, puis en ajoutant 180 ° pour l'angle de phase allons y remédier en renversant le tour des réponses. Voir Reid et al. 1 pour des renseignements détaillés sur la théorie derrière la fonction de sonde, l'étalonnage, etc
Calibrage: La réponse de la sonde à une «normalisée» en cours d'exactement 1,5 mA / cm 2, appliquée à la sonde dans une chambre d'étalonnage, est utilisé pour calculer le courant dans l'échantillon (voir figure 2B, 3A). Avant de mesure des échantillons, la sonde est étalonnée dans une solution appropriée, par exemple, BSS + solution de larmes artificielles pour la cornée. Courant est appliqué dans deux directions: Sud-Nord et Nord-Sud, produisant une hausse et une déviation vers le bas, respectivement, l'équivalent de courants sortant et entrant, en fonction de l'orientation de l'échantillon. La trace de la sonde doit avoir une base stable et à faible bruit (comparez fig. 3A et 3B). La sonde est calibrée à la fin de l'expérience dans la solution utilisée pour compenser le changement osmolalité due à l'évaporation. Lors de l'analyse des données, les mesures de la première moitié de l'expérience peut être calculé en utilisant les valeurs d'étalonnage de départ, et les mesures de la seconde moitié calculé en utilisant le calibrage fin.
Mesure de l'échantillon: Une chambre peut être conçu pour recevoir et immobiliser l'échantillon. Par exemple, la figure 3C montre des boîtes de Petri avec des boucles de fil pour tenir les yeux pour les mesures de la cornée. Le plat contenant du sérum physiologique est placée sous la loupe binoculaire et la région d'intérêt sur l'échantillon placé en focus dans le champ de vision. La sonde est ensuite placé dans une solution et orienté parallèlement à la surface de l'échantillon et aussi la mise au point de sorte qu'il est sur le même niveau que le point sur l'échantillon à mesurer. La sonde est déplacée dans la mesure où c'est pratique (par exemple 1-2 cm) de l'échantillon, la vibration activée (et les logiciels mis à enregistrer) pour établir une stabilité (horizontal) de base (voir figure 4A). La sonde est ensuite déplacée en position de mesure, d'environ 50 um de la surface. Lorsque la nouvelle («pic») la valeur est stable, la sonde est déplacée en position de référence et la trace retourne aux valeurs initiales. Ceci peut être répété à des moments réguliers pour produire des données timelapse, ou de l'échantillon déplacé / pivoter légèrement et répétée à des positions différentes pour produire des données spatiales de cartographie actuelle (voir la figure 4B, 5B).
Analyse des données: Les données sont analysées à l'aide WinWCP (voir figure 5A). La ligne «zéro» à l'horizontale rouge est déplacé vers le haut ou le bas de sorte qu'il est parallèle à la ligne de trace avant le pic de mesure. La ligne verte verticale de mesure est déplacé à travers la ligne de base de trace. La sortie de lecture dans le vert en bas de la ligne verte devrait être proche de zéro (par exemple 0,00012). Ce nombre montre la differnce entre le point où les lignes rouges et vertes croix, et la trace bleue. La ligne rouge est alors déplacé jusqu'à ce qu'il soit parallèle au sommet du pic. La lecture de sortie verte est la taille de la crête en mV. Les données pour tous les pics de mesure, et les données d'étalonnage, sont mis dans un modèle Microsoft Excel (voir tableau 1). Informations pertinentes telles que la date, le numéro de la sonde, gamme de tension (VR), solution utilisée, la mesure des positions, le temps-points, etc peuvent également être mis dans le tableur. La direction du courant (dans ou hors de l'échantillon: «I / O ') est noté, et les courants entrant sont aussi une valeur négative dans le« pic »de la colonne. Le courant dans la colonne de droite est calculée en utilisant la formule: = courant crête * (1.5/calibration) où 1,5 est le courant en uA / cm 2 appliquée à l'étalonnage. Ainsi: «unw1 '= 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 pA / cm 2.
4. Les secrets du succès
Comme dans tous les électrophysiologie, la terre correcte (terre) du matériel indispensable aide à éliminer le bruit. Ainsi, au moins les micro-positionneur et le châssis du microscope doit être mis à la terre, et peut-être aussi la source de lumière (voir figure 1). L'utilisateur peut également être une source d'électricité statique, donc mise à la terre via un poignet bande peut empêcher l'instabilité de la sonde dans certains cas, mais n'est pas toujours nécessaire. Une cage de Faraday n'est pas nécessaire, comme le verrouillage des filtres amplificateurs toutes les fréquences (par exemple 60 Hz à partir du réseau électrique) en dehors de la fréquence de la sonde vibre moins. Une table anti-vibrations est utile mais pas indispensable. Un solide, un banc ou une table stable, fonctionne aussi bien. Outre la basel'information dans le tableur Excel (voir ci-dessus), il est utile d'enregistrer dans un laboratoire de livre des informations supplémentaires utiles telles que les changements de température, des ajouts de drogue, etc Si les photographies sont prises au microscope bas, notez le grossissement. Le cas échéant, il est également utile de faire un croquis de l'échantillon (s) montrant la position et / ou l'orientation des mesures à la sonde (voir figure 6).
Étapes difficiles
- Sonde de décision: il doit y avoir une bonne connexion électrique entre la sonde et le connecteur R30. Si rien ne se passe à l'étape de galvanoplastie, alors c'est probablement la cause.
- Calibrage: utiliser une solution saline ou de milieu de culture approprié pour l'échantillon, vous serez mesure. Ne pas sur-ou sous-remplissage de la chambre de calibration, car cela peut modifier la réponse. La surface du liquide doit être à plat sur le dessus de la chambre.
- Mesures de l'échantillon: Planifiez à l'avance, par exemple, avez-vous besoin de faire une chambre spéciale à tenir / montage de l'échantillon (voir figure 3C)? Lors de la mesure à partir d'un échantillon, la sonde doit être orienté avec l'axe parallèle longtemps à la surface de l'échantillon, de sorte que l'orientation de la sonde de vibration (et donc la direction du courant mesuré) est perpendiculaire à la surface de l'échantillon (par exemple, voir figure 4B ). L'échantillon peut être déplacé et / ou en rotation pour des mesures à différentes positions. Il est important de maintenir une distance constante entre la sonde et la surface de l'échantillon lors de la mesure. Le courant mesuré est proportionnel à la distance de la surface de l'échantillon; que la sonde s'éloigne de la surface de l'échantillon, le courant chute par la loi carrée inverse. C'est, pour mesurer un courant généré à la surface de l'échantillon, le courant détecté est inversement proportionnelle au carré de la distance de la surface. Un réticule peut être utilisé pour juger de la distance entre la sonde et la surface de l'échantillon.
Dépannage
- Problème: pas de réponse à l'étalonnage. Solution: vérifiez salines est en contact avec les deux électrodes. Vérifiez les piles de calibrateur courant constant.
- Problème: petite réponse. Solution: Nettoyer la sonde en DH 2 O et / ou de l'acétone. Vérifiez l'angle de phase.
- Problème: le bruit ou de base instable (voir figure 3B). Solution: Vérifiez fils de terre.
- Problème: trace sauts hors de l'écran. Solution: ne permettent pas de toucher pointe de la sonde d'échantillonnage.
5. Les résultats représentatifs
La figure 3A montre un bon exemple d'une trace d'étalonnage. Notez l'écurie (horizontal) de base, à faible bruit et une réponse importante. A titre de comparaison, la figure 3B montre une trace bruyant avec base instable. Les mesures de courant à différentes positions lors d'une blessure cornée de souris sont indiquées dans la figure 4B. Le panneau supérieur montre les positions de sonde, le panneau du milieu montre les traces de sonde enregistrée sur l'ordinateur et le panneau inférieur est un graphique des courants dans les positions différentes, montrant un profil de blessure actuelle. La figure 5B montre des mesures à une plaie cutanée de souris effectués à intervalles de temps réguliers pour produire des données sur la plaie du temps cours actuel.
Figure 1. Vibrant système de sonde. Voir le texte pour une description détaillée. Texte bleu décrit la fonction des fils de connexion. Symboles verts montrent les points de terre.
Figure 2. A. Montage de la sonde. La sonde est collée sur une médaille d'or avec l'argent connecteur R30-chargé époxy, avant électroporation. Dans certains systèmes, un second connecteur avec un fil court pour transporter le signal est soudé sur. Barre d'échelle de 3 mm. La boule de platine n'est pas à l'échelle. B. sonde de calibration. Le calibrateur de courant constant (à gauche) applique un courant de 1,5 mA / cm 2 à la sonde dans la chambre d'étalonnage (à droite). En bas à gauche: close-up d'une sonde. Lorsque la sonde est mise en vibration (en bas à droite), l'amplitude est réglée de manière d'une image double de la pointe est visible. La barre d'échelle 100 um.
Figure 3. A. Oligo-étalonnage de la sonde. Exemple d'une trace étalonnage de la sonde bonne, avec base stable, à faible bruit et une réponse importante. Courant Sud-Nord, donne une déflexion vers le haut, et courant Nord-Sud produit une déviation vers le bas. B. Un instable, oligo-sonde bruyant. C. Chambers a fait pour la souris de montage (à gauche) ou de rat (à droite) les yeux pour les mesures de la cornée. La barre d'échelle 5mm.
Figure 4. Prouver exemples de mesure. A. Une base stable est établi avec la sonde en position de référence 1-2 de l'échantillon. Lorsque la sonde est déplacée à la position de mesure à proximité de l'échantillon, il détecte unactuelle et la trace dévie vers le haut (courant sortant). B. Mesures à différentes positions à travers une cornée de souris serait. Probe est orienté parallèlement à la surface, afin de vibration est perpendiculaire. Pics à la hausse montrent courants sortants. Courant maximal est vu sur les bords des plaies (positions B & F). Le schéma de la sonde est montré à la mesure de la position F (berges de la plaie à droite). Barre d'échelle de 300 um.
Figure 5. A. L'analyse des traces de la sonde. Panneau supérieur: la ligne rouge à zéro est déplacé vers le haut ou le bas de sorte qu'il est parallèle à la base de trace, puis la ligne verte de mesure est déplacé à travers la ligne de base pour la lecture de sortie en vert est proche de zéro (0,00012). Panneau inférieur: la ligne rouge est alors déplacé jusqu'à ce qu'il soit parallèle au sommet du pic de trace, et la lecture de sortie donne la taille de la crête en mV (12.45). Courant est calculé à partir de cela en utilisant les données d'étalonnage (voir tableau 1). B. Souris plaie cutanée de données timelapse. Courant avant blessant est montré à l'instant zéro (symbole rouge). Les mesures ont été faites à la même position lors d'une plaie cutanée souris à timepoints régulière après avoir blessé. Après transitoire initiale courants entrants (en dessous de zéro), le courant inversé et les courants sortants (positif) a progressé lentement et atteint un plateau.
Figure 6. Lab-book croquis montrant la sonde de mesure des positions. Cerveau de rat A.; points rouges indiquent les positions de mesure et des symboles de sonde montrent l'orientation de la sonde. B. plaies cornée Rat; points rouges indiquent les positions de mesure et les flèches indiquent la direction du courant mesuré.
Tableau 1. Exemple de feuille de calcul Excel pour le stockage et la quantification des données de la sonde. pN2_cal1 = calibration de départ; cal + et Cal-= valeurs d'étalonnage en mV; VR = plage de tension, le pic des mesures d'échantillons = en mV, i / o = débit du courant (dans ou hors de l'échantillon).
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Discussion
Nous décrivons un faible coût, de base, mais très sensible du système sonde vibrante pour mesurer de façon non invasive de courant électrique dans une variété de systèmes biologiques.
Modifications possibles
- Si platine / iridium électrodes (instruments de précision du monde; # cat PTM23B20) sont utilisés au lieu de l'acier inoxydable, puis l'étape de placage à l'or peut être éliminé.
Applications
Nous avons utilisé la sonde vibrante pour mesurer le courant électrique dans: 2 cornée de rat; lentille de rat, 3,4; peau de souris 5; Xenopus tadpole 6; peau humaine 7; cornée humaine 8; l'embryon de poisson zèbre 1; Dictyostelium 1; 1 cerveau de rat. La sonde vibrante a été décrite par Jaffe et Nuccitelli 9. Une sonde commandé par ordinateur qui mesure actuelle en deux dimensions a également été décrite 10. Pertinentes critiques intéressantes sont également inclus 11-13.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants au Professeur Richard Borgens, Centre de recherche paralysie, l'Université de Purdue, de l'aide dans le montage du système de sonde vibrante. Cette étude a été soutenue par IEN subventions du NIH pour 1R01EY019101 MZ et BR, et en partie par des subventions du California Institute of Regenerative Medicine RB1-01417, NSF MCB-0951199, et par une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité, l'UC Davis ophtalmologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eligoy-Stainless Electrode | World Precision Instruments, Inc. | SSM33A70 | 76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip |
| Gold R30 connector | www.vectorelect.com | R30 | Re-usable |
| Silver-loaded epoxy | 3M | SL65 | Mix 1-part Resin with 1-part Hardener |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ40 | Magnification x6 to x40 |
| Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2) | Sigma-Aldrich | 379867 | CAUTION: Toxic |
| Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O) | Sigma-Aldrich | 520896 | CAUTION: Toxic |
| Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O) | Sigma-Aldrich | 185191 | CAUTION: Toxic |
| Nano-Amp power source | Home made | - | Powered by six 1.5 V (AAA) batteries |
| 3-dimensional micro-positioner | Line Tool Co. | Model H | |
| Lock-in amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Digital I/O interface | National Instruments | PCI-6220 | |
| Shielded Connector Block with BNC connections | National Instruments | BNC-2110 | |
| Strathclyde Electrophysiology Software | University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK | WinWCP V4.1.5 | Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm |
| Calibration Chamber | Home made | ||
| Constant Current Calibrator | Vibrating Probe Company | Powered by one 9 V (PP3) battery |
References
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).
- Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. Wound healing in rat cornea: the role of electric currents. FASEB J. 19, 379-386 (2005).
- Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electric currents and lens regeneration in the rat. Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).
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