Die Messung der bioelektrischen Strom mit einem vibrierenden Sonde

Summary

Die Herstellung, Kalibrierung und Verwendung von nicht-invasive vibrierende Sonden zur bioelektrischen Strom in verschiedenen biologischen Systemen zu messen beschrieben.

Abstract

Elektrische Felder, durch aktiven Transport von Ionen erzeugt werden, sind in vielen biologischen Systemen und dienen oft wichtige Funktionen in Geweben und Organen. Zum Beispiel spielen sie eine wichtige Rolle bei der Ausrichtung der Zellwanderung während der Wundheilung. Hier beschreiben wir die Herstellung und Verwendung von hochempfindlichen vibrierende Sonden zur Messung von extrazellulären elektrischen Strömen. Die Sonde ist ein isolierter, geschärft Metalldraht mit einem kleinen Platin-schwarzer Spitze (30-35 um), die Ionenströme in die uA / cm ^2-Bereich erkennt in physiologischer Kochsalzlösung. Die Sonde wird auf etwa 200 Hz durch einen piezoelektrischen bender vibrierte. In Anwesenheit eines Ionenstrom, erkennt die Sonde eine Spannung zwischen den Extremen der Bewegung. Ein Lock-in-Verstärker filtert Störgeräusche durch Sperren auf, um die Sonde die Frequenz der Schwingung. Die Daten werden auf Festplatte aufgezeichnet. Die Sonde wird am Anfang und am Ende der Experimente in entsprechende Kochsalzlösung kalibriert, mit einer Kammer, die eine aktuelle gilt von genau 1,5 uA / cm ^2. Wir beschreiben, wie die Sonden zu machen, das System einzurichten und zu kalibrieren. Wir zeigen auch die Technik der Hornhaut-Messung, und zeigen einige repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen Proben (Hornhaut, Haut, Gehirn).

Protocol

1. Probe Herstellung

Blank-Sonden werden von World Precision Instruments gekauft (Elgiloy / Edelstahl parylenbeschichteten Mikroelektroden) (siehe "Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte" unten). Die Sonde ist 25-30 mm hinter der Spitze geschnitten und ca. 5 mm von Parylen Isolierung an das abgeschnittene Ende schabte mit einem Skalpell (# 11 Klinge), um eine gute Verbindung zu gewährleisten. Die Sonde ist in einem Gold-R30-Anschluss mit elektrisch leitfähigem Silber beladenen Epoxid (zB Rite-Lok SL65) [* siehe Anmerkung unten] montiert. Die Sonde wird über Nacht bei Raumtemperatur gelagert, um das Epoxidharz aushärten lassen. Als nächstes wird die Sondenspitze mit Gold und Platin beschichtet, mit einer Nano-Ampere-Stromversorgung. Die Sondenspitze ist in Aceton gespült und mit dem negativen Ausgang eines nano-Amp-Stromquelle. Die Sondenspitze ist unter einem Binokular (x40) angesehen und die erste in Vergoldung Lösung (Kaliumdicyanoaurat (0,2% w / v KAu (CN) 2 in destilliertem Wasser (dH ₂ O)). Ein Verweis Draht verbunden, um die positive platziert Ausgang und in Lösung schließt den Kreislauf. Ein Strom von 5 nA ist für 5 min, dann auf 20 nA erhöht, bis die Spitze ist etwa die Hälfte der gewünschte Endgröße (ca. 10-15 um) aufgebracht. Die Sondenspitze ist in dH gespült ₂ O und dann in Platinierungslösung (Chlorplatinsäure Hydrat; 1% w / v H2PtCl6 * 6 H ₂ O) plus Blei (II)-Trihydrat (0,1% w / v Pb (CH3CO _{2) 2} * 3H ₂ O in dH ₂ O). Ein Strom von 250 nA ist angelegt für 5 min, dann erhöhte sich auf 500 nA bis die Spitze liegt bei ca. 80% der gewünschte Endgröße. Der Strom auf 1 uA erhöht und angewendet in 1 sec platzt, bis die endgültige Spitzendurchmesser erreicht ist (ca. 30-35 um). Schließlich ist die Spitze in dH ₂ O. Probes gespült speichern kann bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit. Wenn Sonden beschädigt sind, das Gold R30-Anschlüsse können wieder verwendet werden.

[* Hinweis: Einige Sonde Systeme der Sonde Montage direkt an den Verstärker angeschlossen, um das Signal zu tragen. Andere Systeme verfügen über einen separaten Befestigungspunkt und Signal-Anschluss. Im letzteren Fall ist eine kurze (2-3 cm) Draht mit einem R30-Stecker an einem Ende mit der ersten R30-Anschluss vor dem Einbau der Sonde (siehe Abbildung 2A) gelötet.]

2. Probe System

Die Sonde ist mit einem piezoelektrischen bender befestigt montiert auf einem 3-dimensionale Mikro-Stellungsregler (Abbildung 1). Probe Vibration wird durch die schwingende Sonde Stromversorgung, die auch ermöglicht die Einstellung der Schwingungsamplitude und Frequenz angesteuert. Die Sonde Stromversorgung sendet ein Referenzsignal an den Lock-in-Verstärker, der zeigt auch die Schwingungsfrequenz und Phasenwinkel. Es ist auch nützlich, um ein Oszilloskop zu verbinden, so man eine schnelle visuelle Referenz der Sonde Schwingung hat. Das Signal von der Sonde geht auf die Lock-in-Verstärker. Die Sonde und Probe gemessen werden kann mit einem Binokular (Vergrößerung x6 auf x40) mit Glasfaser-Beleuchtung angezeigt werden. Während der Kalibrierung und Messungen der Proben, muss ein Verweis und eine Masse (Erde) Draht in die Lösung sein (siehe Abbildung 2B). Der Verstärker an einen Computer erfolgt über einen Analog-Digital-(i / o)-Schnittstelle angeschlossen. Die Daten werden aufgezeichnet mit Strathclyde Elektrophysiologie Software Whole Cell Program (WinWCP).

Lock-in Verstärker-Einstellungen: Empfindlichkeit [200 uV], Dynamic Resolution [normal], Offset [on], Expand [x1], Time Constant: pre [10 s], post [0,1 s]. Wenn eine schnellere Reaktion erforderlich ist, kann der pre Zeitkonstante bis 3 s reduziert werden Die Offset-Steuerung wird verwendet, um die Sonde Spur zu bringen, die Mitte des Bildschirms in der Nähe. Wenn große Reaktionen zu erwarten sind, kann die Spur bis oder unten verschoben werden.

WCP Software-Einstellungen: Record Dauer [204,8 s], Samples pro Kanal [1024], Sampling Interval [0,2 s], Spannungsbereich [+ / - 0,2 V]. Wenn große Ströme zu erwarten sind, kann der Spannungsbereich bis 1 V oder 5 V erhöht werden

3. Probe-Einstellungen

Neue Sonden müssen getestet werden und ihre eigene Frequenz und Phasenwinkel bestimmt. Die neue Sonde ist in der Kalibrierkammer mit physiologischer Kochsalzlösung (Abbildung 2B) platziert. Die Stromversorgung wird eingeschaltet, und die Frequenz eingeschaltet, bis die maximale Schwingung beobachtet. Dies ist die Resonanzfrequenz der Sonde. Mit der Sonde bei dieser Frequenz kann Instabilität verursachen und produzieren Lärm in der Aufnahme, so wird die Sonde "de-tuned 'durch Subtraktion 10 Hz bis die Sonde Arbeitsfrequenz (typischer Wert von 150-200 Hz) geben. Die Schwingungsamplitude wird so eingestellt, dass die Sonde Vibrationen Abstand die gleiche wie die Spitze Durchmesser (siehe Abbildung 2B), so dass, wenn die Sonde eine "doppelte Bild" der Sondenspitze wird in Schwingung versetzt wird gesehen. Zur Bestimmung der Phasenwinkel, wird die Sonde in Kochsalzlösung in die Kalibrierung Kammer platziert und ein Strom von 1,5 uA / cm ² aufgetragen wiederholt. Der Phasenwinkel auf der Lock-in-Verstärker wird so eingestellt, bis es keine Antwort gibt. Addieren oder Subtrahieren 90 ° zu dieserWinkel gibt die maximale Reaktionszeit, und dieser Winkel ist die Sonde arbeitet Phasenwinkel. Die Frequenz und Phasenwinkel für jede Sonde sind für zukünftige Anwendungen zur Kenntnis genommen. Während eines Experiments ist es wichtig, dass diese Einstellungen von Frequenz, Amplitude und Phasenwinkel nicht geändert werden, da dies die Sonde die Reaktion verändern wird. Für die Bequemlichkeit, wenn der Strom fließt 'South-to-Nord ", sollte diese erzeugen ein Ausschlag nach oben (hier' Peak 'genannt) in der Aufzeichnung zu verfolgen und fließende Strom' Nord-Süd-" sollte eine Auslenkung nach unten zeigen ( siehe Abbildung 3A). Ist dies der falsche Weg, dann Zugabe von 180 ° um den Phasenwinkel es durch Umklappen der Antworten rund beheben. Siehe Reid et al. 1 für detaillierte Informationen über die Theorie hinter Sonde Funktion, Kalibration, etc.

Kalibrierung: Die Reaktion der Sonde auf eine "standardisierte" Strom von genau 1,5 uA / cm ^2, angewandt auf die Sonde in einem Kalibrierkammer, wird verwendet, um den Strom in der Probe zu berechnen (siehe Abbildung 2B, 3A). Vor Probe-Messung wird die Sonde in geeignete Lösung, zB BSS + künstliche Tränenflüssigkeit Lösung für Hornhaut kalibriert. Nord-Süd-und Nord-Süd, wodurch ein nach oben und nach unten Durchbiegung bzw. entspricht nach außen und innen Ströme, je nach Ausrichtung der Probe: Der Strom wird in zwei Richtungen aufgetragen. Die Sonde verfolgen sollte eine stabile Basislinie und geringes Rauschen (vgl. Abb.. 3A und 3B). Die Sonde wird am Ende des Experiments in verwendete Lösung zur Osmolalität Änderung durch Verdunstung auszugleichen kalibriert. Bei der Analyse von Daten, können die Messungen aus der ersten Hälfte des Experiments anhand der Kalibrierung beginnen Werte und Messungen aus der zweiten Hälfte errechnet Ende Kalibrierung werden.

Beispiel Messung: Eine Kammer kann so ausgelegt zu halten und zu immobilisieren der Probe sein. Zum Beispiel zeigt Abbildung 3C Petrischalen mit Drahtschlingen die Augen für die Hornhaut-Messungen zu halten. Die Schale mit physiologischer Kochsalzlösung unter dem Binokular und im Bereich der Zinsen auf die Probe im Fokus in das Blickfeld platziert. Die Sonde wird dann in Lösung und orientiert parallel zur Probenoberfläche und auch im Fokus gelegt, damit es auf dem gleichen Niveau wie der Punkt auf der Probe gemessen werden soll. Die Sonde ist so weit wie praktisch (z. B. 1-2 cm) entfernt von der Probe bewegt, wandte sich die Schwingung auf (und die Computer-Software gesetzt, um record), um eine stabile (horizontal) Baseline (siehe Abbildung 4A) zu etablieren. Die Sonde wird dann in die Messposition bewegt, etwa 50 um von der Oberfläche. Wenn der neue ('peak')-Wert stabil ist, wird die Sonde zurück zur Referenz-Position verschoben und die Spur auf den Ausgangswert zurück. Dies kann in regelmäßigen Zeitpunkten wiederholt werden, um Zeitraffer Daten zu erzeugen, oder die Probe bewegt / leicht gedreht und wiederholt an verschiedenen Positionen, um räumliche aktuelle Kartendaten liefern (siehe Abbildung 4B, 5B).

Datenanalyse: Daten werden analysiert mit WinWCP (siehe Abbildung 5A). Die horizontale rote "Null"-Linie ist nach oben oder unten bewegt, so ist parallel zur Spur Ausgangswert vor der Messung Gipfel ist. Die vertikale grüne Messleitung ist über die Trace-Basislinie bewegt. Die Ausgabe liest in grün am Ende der grünen Linie sollte nahe Null (zB 0,00012). Diese Zahl zeigt die differnce zwischen dem Punkt, wo die roten und grünen Linien kreuzen, und die blaue Kurve. Die rote Linie ist dann, bis sie parallel mit der Spitze des Gipfels verschoben wird. Die grüne Ausgabe zu lesen ist die Größe des Peaks in mV. Die Daten für alle Mess-Spitzen, und die Kalibrierungsdaten werden in eine Microsoft Excel-Arbeitsblatt-Vorlage (siehe Tabelle 1) setzen. Relevante Informationen wie das Datum, die Sonde Zahl, Spannungsbereich (VR), Lösung eingesetzt, Messpositionen, Zeit-Punkte, etc. können auch in der Tabelle gesetzt werden. Die aktuelle Richtung (in oder aus der Probe: 'i / o') wird darauf hingewiesen, und Einwärtsströme auch einen negativen Wert in der "Peak"-Spalte angegeben. Der Strom in der rechten Spalte ist nach folgender Formel berechnet: Strom = Spitzenleistung * (1.5/calibration) wo 1,5 wird der Strom in uA / cm ² angewendet bei der Kalibrierung. Also: "unw1 '= 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 uA / cm ^2.

4. Secrets to Success

Wie in allen Elektrophysiologie, hilft eine ordnungsgemäße Erdung (Erdung) lebenswichtige Geräte zu eliminieren. So zumindest der Mikro-Stellungsregler und das Chassis des Mikroskops sollten geerdet werden, und vielleicht auch die Lichtquelle (siehe Abbildung 1). Der Benutzer kann auch eine Quelle der statischen Elektrizität werden, so Erdung über ein Handgelenk-Band kann Instabilität der Sonde in einigen Fällen zu verhindern, ist aber nicht immer notwendig. Ein Faraday-Käfig ist nicht erforderlich, da die Lock-in-Verstärker filtert alle Frequenzen (zB 60Hz aus Stromnetz) abgesehen von der Frequenz der Sonde am schwingt. Eine Schwingungsisolation Tabelle ist nützlich, aber nicht unbedingt erforderlich. Eine solide, stabile Werkbank oder Tisch funktioniert genauso gut. Abgesehen von den grundlegendenInformationen in der Excel-Tabelle (siehe oben) ist es sinnvoll, in einem Labor-Buch weitere nützliche Informationen wie Veränderungen in der Temperatur, Drogen-Ergänzungen, etc. aufnehmen Wenn Fotos unten die Lupe genommen werden, beachten Sie die Vergrößerung. Gegebenenfalls ist es auch nützlich, um eine Skizze der Probe (n) zeigt Position und / oder Orientierung der Sonde Messungen (siehe Abbildung 6) zu zeichnen.

Herausfordernde Schritte

1. Probe machen: Es muss eine gute elektrische Verbindung zwischen der Sonde und der R30-Anschluss sein. Wenn nichts passiert in der Galvanik stattfindet, dann ist dies wahrscheinlich die Ursache.
2. Kalibrierung: geeignete Kochsalzlösung oder Kulturmedium für die Probe Sie messen wird. Nicht über-oder unter-fill der Kalibrierkammer, da dies die Reaktion verändern kann. Die Oberfläche der Flüssigkeit sollte im oberen Bereich der Kammer flach.
3. Probe-Messungen: Planen Sie im Voraus, nicht zB die Sie benötigen, um eine spezielle Kammer zu halten / mount der Probe (siehe Abbildung 3C) zu machen? Bei der Messung von einer Probe, die Sonde sollte so ausgerichtet, dass die lange Achse parallel zur Probenoberfläche, so dass die Sonde die Richtung der Schwingung (und damit Richtung des Stroms gemessen) senkrecht auf die Probenoberfläche (z. B. siehe Bild 4B ). Die Probe kann und / oder gedreht für Messungen an verschiedenen Positionen bewegt werden. Es ist wichtig, einen konstanten Abstand zwischen der Sonde und der Probenoberfläche zu erhalten, wenn die Messung. Der gemessene Strom ist proportional zum Abstand von der Probenoberfläche, als die Sonde bewegt sich weg von der Probenoberfläche fällt der Strom durch die inverse quadratische Gesetz. Das heißt, wenn die Messung einen Strom an der Probenoberfläche erzeugt wird, wird die aktuelle erkannt umgekehrt proportional zum Quadrat der Entfernung von der Oberfläche. Ein Okularstrichplatte kann verwendet werden, um den Abstand zwischen der Sonde und der Probenoberfläche zu beurteilen.

Fehlerbehebung

• Problem: keine Reaktion bei der Kalibrierung. Lösung: Überprüfen Sie Salzlösung Kontakt beider Elektroden. Überprüfen Sie die Batterie in konstanten Strom-Kalibrator.
• Problem: geringe Resonanz. Lösung: saubere Sonde in dH ₂ O und / oder Aceton. Überprüfen Sie Phasenwinkel.
• Problem: Rauschen oder instabile Basislinie (siehe Abbildung 3B). Lösung: Überprüfen Sie Erdungskabel.
• Problem: trace springt aus dem Bild. Lösung: nicht zulässig Sondenspitze Probe zu berühren.

5. Repräsentative Ergebnisse

3A zeigt ein gutes Beispiel für eine Kalibrierung zu verfolgen. Beachten Sie die stable (horizontal) Baseline, geringes Rauschen und große Resonanz. Zum Vergleich zeigt Abbildung 3B eine laute Spur mit instabilen Grundlinie. Aktuelle Messungen an verschiedenen Positionen bei einer Maus Hornhaut Wunde sind in Abbildung 4B gezeigt. Das obere Feld zeigt die Sonde Positionen, zeigt der Mitteltafel die Sonde Spuren wie auf dem Computer erfasst und die untere Platte ist eine graphische Darstellung der Ströme an den verschiedenen Positionen, zeigt ein Profil der Wunde Strom. 5B zeigt Messungen an einer Maus Hautwunde in regelmäßigen Zeitabständen an den Daten auf der Wunde aktuellen Zeit-Verlauf zu erzeugen.

Abbildung 1. Vibrating Tastsystem. Siehe Text für ausführliche Erläuterungen. Blauer Text beschreibt die Funktion der Anschlussdrähte. Grüne Symbole zeigen Erdungspunkte.

Abbildung 2. A. Probe Montage. Die Sonde wird in einem goldenen R30-Stecker mit Silber beladenen Epoxy, vor Elektroporation geklebt. In manchen Systemen ist ein zweiter Anschluss mit einem kurzen Draht um das Signal zu tragen aufgelötet. Maßstabsleiste 3 mm. Die Platin-Ball ist nicht maßstabsgetreu. B. Probe Kalibrierung. Der konstante Strom-Kalibrator (links) gilt ein Strom von 1,5 uA / cm ^2, um die Sonde in der Kalibrierkammer (rechts). Unten links: Nahaufnahme von einer Sonde. Wenn die Sonde in Schwingung versetzt wird (unten rechts) ist die Amplitude so eingestellt, eine doppelte-Bild von der Spitze zu sehen ist. Maßstabsbalken 100 um.

Abbildung 3. A. Tastkopfkalibrierung Spur. Beispiel für eine gute Kalibrierung der Sonde zu verfolgen, mit einer stabilen Grundlinie, geringes Rauschen und große Resonanz. Strom fließt von Süden nach Norden gibt einen Ausschlag nach oben und fließt Nord-Süd-erzeugt eine Auslenkung nach unten. B. Ein instabiles, laut Sonde zu verfolgen. C. Chambers gemacht für die Montage der Maus (links) oder Ratte (rechts) die Augen für Hornhaut-Messungen. Maßstabsbalken 5mm.

Abbildung 4. Beweisen Messung Beispiele. A. Eine stabile Basislinie mit der Sonde in Bezug Position 1-2 aus der Stichprobe ermittelt. Wenn die Sonde zur Messung Position in der Nähe der Probe bewegt wird, erkennt es sich um eineStrom und die Spur lenkt nach oben (außen Strom). B. Messungen an verschiedenen Stellen über eine Maus Hornhaut würde. Probe orientiert sich parallel zur Oberfläche, so Vibrationen senkrecht. Upward Peaks zeigen Auswärtsströme. Maximaler Strom wird an den Wundrändern gesehen (Positionen B & F). Die schematische Darstellung der Sonde ist bei Messposition F (rechts Wundrand) gezeigt. Maßstabsbalken 300 um.

Abbildung 5. A. Analyse-Sonde Spuren. Oben: die rote Null-Linie nach oben oder unten bewegt, so ist parallel mit der Spur Ausgangswert, dann die grüne Messleitung ist über die Grundlinie bewegt, so die Ausgabe zu lesen in grün ist nahe Null (0,00012). Unten: Die rote Linie ist dann, bis sie parallel mit der Spitze der Spur Spitze bewegt wird, und die Ausgabe zu lesen gibt die Größe des Peaks in mV (12.45). Der Strom wird von diesem mit der Kalibrierdaten (siehe Tabelle 1) berechnet. B. Maus Hautwunde Zeitraffer Daten. Aktuelle vor Verwundung ist zum Zeitpunkt Null (rotes Symbol) dargestellt. Die Messungen wurden an der gleichen Position bei einer Maus Hautwunde in regelmäßigen Zeitpunkten nach der Verletzung gemacht. Nach anfänglichen transienten Einwärtsströme (unter Null), umgekehrt die aktuelle und die nach außen Ströme (positive) erhob sich langsam und abgeflacht.

Abbildung 6. Lab-Buch Skizzen Sonde Messpositionen. A. Rattenhirn; roten Punkte zeigen Messpositionen und Sonde Symbole zeigen Sonde Orientierung. B. Rat Hornhaut Wunde, rote Punkte zeigen Messpositionen und Pfeile zeigen Richtung des Stroms gemessen.

Tabelle 1. Beispiel für Excel-Tabelle für die Speicherung und die Quantifizierung Sonde Daten. pN2_cal1 = Start Kalibrierung; cal + und CAL-= Kalibrierwerte in mV; VR = Spannungsbereich, peak = Probe Messungen in mV, i / o = Stromfluss (in oder aus der Probe).

Discussion

Wir beschreiben eine kostengünstige, einfach, aber sehr empfindlich vibrierenden Sonde zur Messung nicht-invasiv elektrischen Strom in einer Vielzahl von biologischen Systemen.

Mögliche Änderungen

1. Wenn Platin / Iridium-Elektroden (World Precision Instruments, cat # PTM23B20) anstelle von Edelstahl verwendet werden, dann wird die Goldschicht Bühne beseitigt werden kann.

Anwendungen

Wir haben die schwingende Sonde verwendet, um elektrischen Strom im Takt: rat Hornhaut ^2, Ratte-Objektiv ^3,4; Mäusehaut ^5; Xenopus Kaulquappen ^6; menschliche Haut ^7; menschliche Hornhaut ^8; Zebrafisch-Embryo ^1; Dictyostelium ^1; Rattenhirn ^1. Die vibrierenden Sonde wurde erstmals von Jaffe und Nuccitelli ⁹ beschrieben. Ein Computer-gesteuerten Sonde, die aktuellen Maßnahmen in zwei Dimensionen wurde auch ¹⁰ beschrieben. Relevante interessante Beiträge sind ebenfalls enthalten ^11-13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eligoy-Stainless Electrode	World Precision Instruments, Inc.	SSM33A70	76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip
Gold R30 connector	www.vectorelect.com	R30	Re-usable
Silver-loaded epoxy	3M	SL65	Mix 1-part Resin with 1-part Hardener
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ40	Magnification x6 to x40
Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2)	Sigma-Aldrich	379867	CAUTION: Toxic
Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O)	Sigma-Aldrich	520896	CAUTION: Toxic
Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O)	Sigma-Aldrich	185191	CAUTION: Toxic
Nano-Amp power source	Home made	-	Powered by six 1.5 V (AAA) batteries
3-dimensional micro-positioner	Line Tool Co.	Model H
Lock-in amplifier	Stanford Research Systems	SR530
Digital I/O interface	National Instruments	PCI-6220
Shielded Connector Block with BNC connections	National Instruments	BNC-2110
Strathclyde Electrophysiology Software	University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK	WinWCP V4.1.5	Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
Calibration Chamber	Home made
Constant Current Calibrator	Vibrating Probe Company		Powered by one 9 V (PP3) battery