Misura della corrente bioelettrica con una sonda vibrante

Summary

L', taratura fabbricazione e l'uso di sonde a vibrazione non invasivo per misurare la corrente bioelettrica in vari sistemi biologici è descritto.

Abstract

Campi elettrici, generati dal trasporto attivo di ioni, sono presenti in molti sistemi biologici e spesso svolgono funzioni importanti in tessuti e organi. Ad esempio, essi svolgono un ruolo importante nel dirigere la migrazione delle cellule durante la guarigione delle ferite. Qui si descrive la fabbricazione e l'uso di sonde a vibrazione ultrasensibile per la misura extracellulare correnti elettriche. Il sensore è un isolato, filo metallico affilato con una piccola punta di platino-nero (30-35 micron), in grado di rilevare le correnti ioniche nei ìA / cm ² gamma di soluzione fisiologica. La sonda viene fatta vibrare a circa 200 Hz da un piezoelettrico bender. In presenza di una corrente ionica, la sonda rileva una differenza di tensione tra gli estremi del suo movimento. Un lock-in filtri amplificatore i rumori estranei, bloccando alla frequenza della sonda di vibrazione. I dati vengono registrati su computer. La sonda è calibrata all'inizio e alla fine degli esperimenti in soluzione fisiologica del caso, con una camera che si applica una corrente di esattamente 1,5 ìA / cm ^2. Noi descriviamo come fare le sonde, impostare il sistema e calibrare. Abbiamo anche dimostrare la tecnica di misurazione della cornea, e mostrano alcuni risultati rappresentante di diversi esemplari (cornea, cute, cervello).

Protocol

1. Sonda Produzione

Sonde vuote sono acquistati da Strumenti di precisione (World Elgiloy / acciaio rivestita parylene microelettrodi) (vedi 'Tabella di reagenti e attrezzature specifiche' di seguito). La sonda viene tagliata 25-30 mm dietro la punta e di circa 5 mm di isolamento parylene alla fine taglio raschiato via con un bisturi (# 11 della lama) per garantire una buona connessione. La sonda è montata in un oro R30 connettore utilizzando elettricamente conduttivo d'argento caricato epossidica (ad esempio Rite-Lok SL65) [* vedi nota sotto]. La sonda viene memorizzata durante la notte a temperatura ambiente per permettere la resina epossidica ad indurirsi. Successivamente, la punta della sonda è placcato in oro e platino, con un nano-amp alimentazione. La punta della sonda è risciacquato in acetone e collegato all'uscita negativo di un nano-amp fonte di alimentazione. La punta della sonda è visto sotto un microscopio da dissezione (x40) e al primo posto in soluzione doratura (dicyanoaurate di potassio (0,2% w / v UAE (CN) 2 in acqua distillata (dH ₂ O)). Un filo di riferimento collegato al terminale positivo uscita e immersa in soluzione completa il circuito. Una corrente di 5 nA è applicato per 5 minuti, poi aumentati a 20 nA fino a quando la punta è circa la metà della dimensione finale desiderata (circa 10-15 micron). La punta della sonda è risciacquato in dH ₂ O e poi messo in soluzione platinizing (idrato cloroplatinico acido, 1% w / v H2PtCl6 * 6H ₂ O) e piombo (II) acetato triidrato (0,1% w / v Pb (CH3CO _{2) 2} * 3H ₂ O in DH ₂ O). Una corrente di 250 nA è applicato per 5 minuti, poi aumentato a 500 nA fino a quando la punta è di circa l'80% della dimensione finale desiderata. La corrente è aumentato a 1 μA e applicato in 1 sec raffiche fino a quando il diametro della punta finale si ottiene (circa 30-35 micron). Infine, la punta è risciacquati in DH ₂ O. Le sonde possono essere conservare a temperatura ambiente a tempo indeterminato. sonde sono danneggiati, l'oro R30 connettori possono essere riutilizzati.

[* Nota: alcuni sistemi della sonda hanno la sonda di montaggio collegato direttamente all'amplificatore per trasportare il segnale. Altri sistemi hanno un punto di montaggio separato e connettore di segnale. In quest'ultimo caso, una breve (2-3 cm) a filo con un connettore R30 ad una estremità è saldato al primo R30 connettore prima di montare la sonda (vedi Figura 2A).]

2. Sonda di sistema

La sonda è collegata ad un piezo-elettrico bender montato su un 3-dimensionale di micro-posizionatore (Figura 1). Vibrazione della sonda è controllata dalla sonda di alimentazione vibrante potenza che permette anche la regolazione di ampiezza di vibrazione e frequenza. L'alimentazione della sonda invia un segnale di riferimento al amplificatore lock-in, che visualizza anche la frequenza di vibrazione e l'angolo di fase. E 'anche utile per collegare un oscilloscopio così si ha un rapido riferimento visivo di vibrazione della sonda. Il segnale dalla sonda va al amplificatore lock-in. La sonda e il campione da misurare possono essere visualizzati con un microscopio da dissezione (ingrandimento x6 a x40) con illuminazione a fibre ottiche. Durante le misure di calibrazione e il campione, un riferimento e un terreno (terra) del filo deve essere la soluzione (vedi Figura 2B). L'amplificatore è collegato a un computer tramite un convertitore analogico-digitale (I / O) interfaccia. I dati vengono registrati con l'intero programma cella Strathclyde Elettrofisiologia Software (WinWCP).

Lock-in impostazioni amplificatore: Sensibilità [200 uV], Dynamic risoluzione [normale], Offset [su], Expand [x1], costante di tempo: pre [10 s], post [0,1 s]. Se una risposta più rapida è necessaria, il tempo pre costante può essere ridotto a 3 s. Il controllo offset viene utilizzato per portare la traccia sonda vicino al centro dello schermo. Se le risposte di grandi dimensioni sono attesi, la traccia può essere spostato in alto o in basso.

WCP impostazioni del software: Durata registrazione [204,8 s], campionamenti per canale [1024], intervallo di campionamento [0,2 s], Gamma di tensione [+ / - 0,2 V]. Se si prevedono grandi correnti, l'intervallo di tensione può essere aumentata a 1 V o 5 V.

3. Sonda Impostazioni

Nuove sonde dovranno essere testati e la loro frequenza unica e angolo di fase determinata. La nuova sonda si trova nella camera di calibrazione contenente soluzione fisiologica (Figura 2B). L'alimentazione è acceso e la frequenza alzato fino a quando la vibrazione massima si osserva. Questa è la frequenza di risonanza della sonda. Utilizzando la sonda a questa frequenza può causare instabilità e produrre rumore nella registrazione, così la sonda è 'de-tuned' sottraendo da 10 Hz a dare frequenza di lavoro della sonda (tipicamente 150-200 Hz). L'ampiezza della vibrazione è regolato in modo che la distanza vibrazione sonda è lo stesso del diametro della punta, in modo che quando la sonda è vibrato una 'doppia immagine' della punta della sonda è visto (vedi Figura 2B). Per determinare l'angolo di fase, la sonda si trova in soluzione salina nella camera di calibrazione e una corrente di 1,5 ìA / cm ² applicato ripetutamente. L'angolo di fase sulla amplificatore lock-in viene regolata fino a quando non c'è risposta. Aggiungendo o sottraendo 90 ° a questoAngolo dà la massima risposta, e questo angolo è l'angolo di fase di lavoro della sonda. L'angolo di frequenza e di fase per ciascuna sonda si distinguono per un uso futuro. Durante un esperimento, è importante che queste impostazioni di angolo di frequenza, ampiezza e fase non vengono modificate, in modo da alterare la risposta della sonda. Per comodità, quando la corrente scorre 'Sud-Nord', questo dovrebbe produrre una deflessione verso l'alto (qui chiamato 'picco') nella traccia di registrazione, e la corrente che scorre 'Nord-Sud' dovrebbe mostrare una flessione verso il basso ( vedi figura 3A). Se questo è il modo sbagliato, aggiungendo poi 180 ° per l'angolo di fase lo correggere invertendo il giro delle risposte. Vedi Reid et al. 1 per informazioni dettagliate sulla teoria che sta dietro funzione della sonda, taratura, ecc

Calibrazione: La risposta della sonda ad una 'standard' in corso di esattamente 1,5 ìA / cm ^2, applicata alla sonda in una camera di calibrazione, viene utilizzato per calcolare la corrente nel campione (vedi figura 2B, 3A). Prima della misura del campione, la sonda è calibrata in soluzione del caso, ad esempio BSS + Soluzione lacrime artificiali per cornea. Corrente viene applicata in due direzioni: Sud-Nord e Nord-Sud, producendo una deflessione verso l'alto e una verso il basso, rispettivamente, pari a correnti verso l'esterno e verso l'interno, a seconda dell'orientamento del campione. La traccia sonda dovrebbe avere una base stabile e basso rumore (cfr. fig. 3A e 3B). La sonda è calibrata alla fine dell'esperimento in soluzione utilizzata per compensare il cambiamento osmolalità a causa dell'evaporazione. Quando si analizzano i dati, le misure della prima metà di questo esperimento può essere calcolato utilizzando i valori di taratura di partenza, e le misure dalla seconda metà calcolato utilizzando la calibrazione fine.

Misura Esempio: Uno camera può essere progettato per contenere e immobilizzare il campione. Per esempio, la Figura 3C mostra Petri con anse a filo per tenere gli occhi per le misure di cornea. Il piatto contenente soluzione fisiologica è posto sotto il microscopio da dissezione e l'area di interesse sul campione messo a fuoco nel campo visivo. La sonda viene quindi posto in soluzione e orientati parallelamente alla superficie del campione e anche a fuoco quindi è allo stesso livello come il punto sul campione da misurare. La sonda si sposta per quanto è conveniente (ad esempio 1-2 cm) di distanza dal campione, la vibrazione acceso (e il software per registrare) per stabilire una stabile (orizzontale) al basale (vedi Figura 4A). La sonda viene poi spostato nella posizione di misura, circa 50 micron dalla superficie. Quando la ('picco') nuovo valore è stabile, la sonda si sposta in posizione di riferimento e la traccia ritorna allo stato iniziale. Questo può essere ripetuta a intervalli di tempo regolari per produrre dati timelapse, o il campione spostato / leggermente ruotato e ripetuto in diverse posizioni per produrre dati spaziali mappatura corrente (vedi Figura 4B, 5B).

Analisi dei dati: i dati vengono analizzati utilizzando WinWCP (vedi Figura 5A). Linea di 'zero' orizzontale rosso è spostato verso l'alto o verso il basso in modo che sia parallela alla linea di base traccia prima del picco di misura. La linea verticale verde misura è spostata oltre alla linea di base traccia. L'uscita di lettura nel verde nella parte inferiore della linea verde dovrebbe essere prossima allo zero (ad esempio 0,00012). Questo numero indica il differnce tra il punto in cui le linee rosse e verdi croce, e la traccia blu. La linea rossa è poi salito fino a quando non è parallelo con la parte superiore del picco. La lettura di uscita verde è la dimensione del picco in mV. I dati per tutti i picchi di misura, ei dati di taratura, vengono messi in un modello di foglio di calcolo Microsoft Excel (vedi tabella 1). Informazioni pertinenti, quali la data, il numero della sonda, range di tensione (VR), soluzione utilizzata, misurando la posizione, il tempo-point, ecc può anche essere messo nel foglio di calcolo. La direzione attuale (dentro o fuori del campione: 'I / O') è nota, e le correnti verso l'interno è dato anche un valore negativo nella colonna 'picco'. La corrente nella colonna di destra è calcolato utilizzando la formula: = corrente di picco * (1.5/calibration), dove 1.5 è la corrente in ìA / cm ² applicato a calibrazione. Così: 'unw1' = 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 ìA / cm ^2.

4. I segreti del successo

Come in tutti i elettrofisiologia, messa a terra (messa a terra) di apparecchiature vitali aiuta ad eliminare il rumore. Quindi, almeno il micro-posizionatore e il telaio del microscopio deve essere messa a terra, e forse anche la sorgente di luce (vedi Figura 1). L'utente può anche essere una fonte di elettricità statica, in modo di messa a terra attraverso un polso-band può prevenire l'instabilità della sonda, in alcuni casi, ma non è sempre necessario. Una gabbia di Faraday non è necessario, come il blocco dei filtri amplificatore fuori tutte le frequenze (ad esempio 60Hz da rete elettrica) a parte la frequenza della sonda vibra in. Una tabella di isolamento dalle vibrazioni è utile ma non essenziale. Un solido, stabile da banco o un tavolo funziona altrettanto bene. Oltre alla baseinformazioni contenute nel foglio di calcolo Excel (vedi sopra) è utile per registrare nel proprio laboratorio-book ulteriori informazioni utili come i cambiamenti di temperatura, le aggiunte di droga, ecc Se le fotografie sono tolto il microscopio, nota l'ingrandimento. Se del caso, è anche utile per disegnare uno schizzo del campione (s) che mostra la posizione e / o orientamento di misure sonda (vedi Figura 6).

Passi impegnativi

1. Sonda fare: ci deve essere un buon collegamento elettrico tra la sonda e il connettore R30. Se non accade nulla in fase di galvanica, allora questa è probabilmente la causa.
2. Calibrazione: uso appropriato salina o terreno di coltura per il campione sarà di misura. Non sovra o sotto-riempire la camera di calibrazione come questo può alterare la risposta. La superficie del liquido deve essere piatta nella parte superiore della camera.
3. Misure campione: Piano in anticipo, ad esempio, avete bisogno di fare una camera speciale per tenere / montare il campione (vedi figura 3C)? Quando si misura da un campione, la sonda dovrebbe essere orientato con l'asse parallelo lungo la superficie del campione, in modo che la direzione della sonda di vibrazione (e quindi la direzione della corrente da misurare) è perpendicolare alla superficie del campione (per esempio, vedere la Figura 4B ). Il campione può essere spostato e / o rotazione per le misurazioni in diverse posizioni. E 'importante mantenere una distanza costante tra la sonda e la superficie del campione durante la misurazione. La corrente misurata è proporzionale alla distanza dalla superficie del campione, come la sonda si allontana dalla superficie del campione, la corrente scende dalla legge dell'inverso del quadrato. Cioè, quando si misura una corrente generata sulla superficie del campione, la corrente rilevata è inversamente proporzionale al quadrato della distanza dalla superficie. Un reticolo oculare può essere usato per valutare la distanza tra la sonda e la superficie del campione.

Risoluzione dei problemi

• Problema: nessuna risposta alla calibrazione. Soluzione: soluzione salina di controllo è contattando entrambi gli elettrodi. Controllo della batteria in corrente costante calibratore.
• Problema: la risposta di piccole dimensioni. Soluzione: pulire la sonda in dH ₂ O e / o acetone. Controllare angolo di fase.
• Problema: rumore o al basale instabile (vedi Figura 3B). Soluzione: Controllare i cavi di messa a terra.
• Problema: traccia salta fuori dallo schermo. Soluzione: non consentono punta della sonda al tocco del campione.

5. Rappresentante Risultati

Figura 3A mostra un buon esempio di una traccia di calibrazione. Si noti la stabile (orizzontale) al basale, a basso rumore e la risposta di grandi dimensioni. A titolo di confronto, 3B figura mostra una traccia rumoroso con base instabile. Misure di corrente in posizioni diverse in una ferita cornea del mouse sono mostrate nella figura 4B. Il pannello superiore mostra la posizione della sonda, il pannello centrale mostra le tracce della sonda come registrato sul computer e il pannello inferiore è un grafico delle correnti presso le diverse posizioni, mostrando un profilo di ferita in corso. 5B figura mostra misurazioni a una ferita della pelle del mouse effettuati a intervalli di tempo regolari per produrre i dati sul tempo attuale ferita portate.

Figura 1. Vibrante sistema sonda. Vedi testo per descrizione dettagliata. Testo blu descrive la funzione dei cavi di collegamento. Simboli verdi mostrano i punti di messa a terra.

Figura 2. A. Sonda di montaggio. La sonda viene incollato in un oro R30 connettore d'argento caricato epossidica, prima di electroporating. In alcuni sistemi, un secondo connettore con un filo corto per trasportare il segnale è saldato su. Scala grafica 3 mm. La palla di platino non è in scala. B. sonda di calibrazione. Il calibratore di corrente costante (a sinistra) si applica una corrente di 1,5 ìA / cm ² per la sonda nella camera di calibrazione (a destra). In basso a sinistra: primo piano di una sonda. Quando la sonda è vibrato (in basso a destra), l'ampiezza è regolata in modo una doppia immagine della punta è visto. Scala bar 100 micron.

Figura 3. A. Calibrazione sonda traccia. Esempio di una traccia buona calibrazione della sonda, con la linea di base stabile, a basso rumore e la risposta di grandi dimensioni. Corrente che scorre Sud-Nord dà una deflessione verso l'alto, e la corrente che scorre da nord a sud produce una deflessione verso il basso. B. Un instabile, traccia rumorosi sonda. C. Chambers fatta per il montaggio del mouse (sinistra) o di ratto (a destra) gli occhi per le misure di cornea. Scala grafica 5mm.

Figura 4. Dimostrare esempi di misura. A. Una linea di base stabile è stabilito con la sonda in posizione di riferimento 1-2 dal campione. Quando la sonda viene spostata in posizione di misura in prossimità del campione, si rileva unattuale e la traccia devia verso l'alto (verso l'esterno di corrente). B. Misure in diverse posizioni attraverso una cornea topo. Sonda è parallelo orientato alla superficie, in modo da vibrazione è perpendicolare. Picchi verso l'alto mostrano le correnti verso l'esterno. Corrente massima è visto ai bordi della ferita (posizioni B & F). Lo schema della sonda viene visualizzato nella misura F posizione (fronte ferita a destra). Scala bar 300 micron.

Figura 5. A. Analizzando le tracce della sonda. Pannello superiore: la linea rossa zero è spostato verso l'alto o verso il basso in modo che sia parallela alla linea di base traccia, allora la linea di misurazione verde è spostata oltre alla linea di base così la lettura di uscita in verde è vicino a zero (0,00012). Pannello inferiore: la linea rossa è poi salito fino a quando non è parallelo con la parte superiore del picco traccia, e la lettura di uscita fornisce la dimensione del picco in mV (12.45). Correnti è calcolata da questo utilizzando i dati di calibrazione (vedi tabella 1). B. pelle mouse ferita dati Timelapse. Corrente prima ferimento è riportato al tempo zero (simbolo rosso). Misurazioni sono state effettuate nella stessa posizione in una ferita del mouse pelle timepoints regolari dopo ferimento. Dopo l'iniziale correnti transitorie verso l'interno (sotto zero), la corrente invertita e le correnti verso l'esterno (positivo) è cresciuto lentamente e plateau.

Figura 6. Lab-libro di schizzi che mostrano sonda di misura posizioni. Cervello di ratto A.; puntini rossi indicano le posizioni di misura e simboli della sonda mostrano l'orientamento della sonda. Ferita Rat B. cornea; puntini rossi mostrano le posizioni di misura e frecce indicano la direzione della corrente misurata.

Tabella 1. Esempio di foglio di calcolo Excel per la memorizzazione e la quantificazione dei dati della sonda. pN2_cal1 = calibrazione di partenza; cal + e cal-= valori di calibrazione in mV; VR = range di tensione, di picco = misure campione in mV, i / o = flusso di corrente (dentro o fuori del campione).

Discussion

Descriviamo un basso costo, di base, ma molto sensibile sistema sonda vibrante per la misurazione non invasiva corrente elettrica in una varietà di sistemi biologici.

Le modifiche possibili

1. Se platino / iridio elettrodi (Strumenti di precisione mondiale; cat # PTM23B20) sono utilizzati al posto di acciaio inox, poi la fase di placcatura in oro può essere eliminato.

Applicazioni

Abbiamo usato la sonda vibrante per misurare la corrente elettrica: cornea ratto ^2; lente ratto ^3,4; topo pelle ^5; Xenopus girino ^6; pelle umana ^7; cornea umana ^8; embrione Zebrafish ^1; Dictyostelium ^1; del cervello del ratto ^1. La sonda vibrante è stato descritto da Jaffe e Nuccitelli ^9. Un computer controllato sonda che misura la corrente in due dimensioni è stata descritta anche ^10. Rilevanti recensioni interessanti sono inclusi anche ^11-13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eligoy-Stainless Electrode	World Precision Instruments, Inc.	SSM33A70	76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip
Gold R30 connector	www.vectorelect.com	R30	Re-usable
Silver-loaded epoxy	3M	SL65	Mix 1-part Resin with 1-part Hardener
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ40	Magnification x6 to x40
Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2)	Sigma-Aldrich	379867	CAUTION: Toxic
Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O)	Sigma-Aldrich	520896	CAUTION: Toxic
Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O)	Sigma-Aldrich	185191	CAUTION: Toxic
Nano-Amp power source	Home made	-	Powered by six 1.5 V (AAA) batteries
3-dimensional micro-positioner	Line Tool Co.	Model H
Lock-in amplifier	Stanford Research Systems	SR530
Digital I/O interface	National Instruments	PCI-6220
Shielded Connector Block with BNC connections	National Instruments	BNC-2110
Strathclyde Electrophysiology Software	University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK	WinWCP V4.1.5	Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
Calibration Chamber	Home made
Constant Current Calibrator	Vibrating Probe Company		Powered by one 9 V (PP3) battery