Summary
Tillverkning, kalibrering och användning av icke-invasiv vibrerande prober för mätning av bioelektriska aktuella i olika biologiska system beskrivs.
Abstract
Elektriska fält, som genereras av aktiv transport av joner, finns i många biologiska system och tjänar ofta viktiga funktioner i vävnader och organ. Till exempel spelar de en viktig roll i att leda cell migration vid sårläkning. Här beskriver vi tillverkning och användning av ultrakänslig vibrerande givare för att mäta extracellulära elektriska strömmar. Sonden är en isolerad, vass metalltråd med en liten platina-svart spets (30-35 mikrometer), som kan upptäcka jonströmmar i μA / cm 2 intervall i fysiologisk koksaltlösning. Sonden är vibrerat på ca 200 Hz med en piezoelektrisk Bender. I närvaro av en jonisk ström, upptäcker sonden en spänning skillnad mellan ytterligheterna av dess rörelse. Ett lås förstärkare filtrerar bort brus genom att låsa på sondens frekvensen av vibrationer. Data spelas in på datorn. Sonden är kalibrerad i början och slutet av experiment i lämpliga saltlösning, med hjälp av en kammare som gäller en ström på exakt 1,5 μA / cm 2. Vi beskriver hur man gör sonder, ställa in systemet och kalibrera. Vi visar också tekniken att hornhinnan mätning, och visar några representativa resultat från olika prover (hornhinna, hud, hjärna).
Protocol
1. Probe Tillverkning
Tomma givare köps från instrument World Precision (elgiloy / rostfritt Parylen-coated microelectrodes) (se "Tabell över specifika reagenser och utrustning" nedan). Sonden är skuren 25-30 mm bakom spetsen och ca 5 mm Parylen isolering på den avskurna ändan skrapas bort med en skalpell (# 11 blad) för att säkerställa en god anslutning. Sonden är monterad i en guld R30 kontakt med elektriskt ledande silver-laddad epoxi (t.ex. Rite-Lok SL65) [* se kommentar nedan]. Sonden förvaras över natten i rumstemperatur att låta epoxin härda. Därefter är det mätspets förgyllt och platina, med en nano-amp strömförsörjning. Sondspetsen sköljs i aceton och ansluts till den negativa utgången på en nano-amp strömkälla. Sondspetsen ses under ett dissekera mikroskop (X40) och placeras först i förgyllning lösning (kalium dicyanoaurate (0,2% w / v KAU (CN) 2 i destillerat vatten (dH 2 O)). En hänvisning kabel ansluten till den positiva produktion och placeras i lösningen klar kretsen. en ström av 5 NA är ansökt om 5 min, ökade sedan till 20 nA tills spetsen är ungefär hälften önskade slutliga storlek (ca 10-15 mikrometer). Mätspetsen sköljs i dH 2 O och sedan placeras i platinizing lösning (chloroplatinic syra hydrat, 1% w / v H2PtCl6 * 6H 2 O) plus bly (II) trihydrat (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O i dH 2 O). en ström på 250 nA söks för 5 min, ökade sedan till 500 nA tills spetsen är ca 80% av den önskade slutgiltiga storlek. Strömmen ökas till 1 μA och tillämpas i 1 sek skurar fram till den sista spetsen diameter erhålls (ca 30-35 mikrometer). Slutligen är toppen sköljas i dH 2 O. givare kan förvaras vid rumstemperatur under obegränsad tid. Om sonder är skadade, kan guldet R30 kontakterna återanvändas.
[* Obs: Vissa probsystem har sonden monteras direkt anslutna till förstärkaren att bära signalen. Andra system har en separat infästningspunkt och signal-kontakt. I det senare fallet är en kort (2-3 cm) tråd med en R30-kontakt i ena änden lödas till det första R30 kontakten innan de monteras sonden (se Figur 2A).]
2. Probsystem
Sonden är ansluten till en piezoelektrisk bender monterad på en 3-dimensionell mikro-lägesställare (Figur 1). Probe vibrationer styrs av den vibrerande sond nätaggregat som även tillåter justering av vibrationer amplitud och frekvens. Sonden strömförsörjning skickar en referens signal till låset förstärkaren, vilket också visar vibrationsfrekvens och fasvinkel. Det är också bra att ansluta ett oscilloskop så man har en snabb visuell referens sond vibrationer. Signalen från sonden går till inlåsning förstärkare. Sonden och prov som ska mätas kan visas med en dissekera mikroskop (förstoring x6 till X40) med fiberoptisk belysning. Under kalibrering och prov mätningar skall en referens och en jord (jord) kabeln vara i lösningen (se Figur 2B). Förstärkaren är ansluten till en dator via en analog-digital (I / O) gränssnitt. Data registreras med hjälp av Strathclyde Elektrofysiologi Softwares helcells Program (WinWCP).
Lås förstärkare inställningar: Känslighet [200 μV], dynamisk upplösning [Normal], Offset [På] Expandera [X1], tidskonstant: pre [10 s], efter [0,1 s]. Om ett snabbare svar krävs, kan före tidskonstant reduceras till 3 s. Förskjutningen kontrollen används för att föra sonden spår till nära mitten av skärmen. Om stora svar förväntas, kan spåra flyttas uppåt eller nedåt.
WCP programvara inställningar: Rekord Duration [204,8 S], sampel per kanal [1024], Provtagning intervallet [0,2 s], Spänningsområde [+ / - 0,2 V]. Om stora strömmar förväntas, kan spänningsområdet ökas till 1 V eller 5 V.
3. Probe Inställningar
Nya sonder måste testas och deras unika frekvens och fasvinkel fastställas. Den nya sonden placeras i kalibreringen kammare som innehåller fysiologisk koksaltlösning (Figur 2B). Strömförsörjningen är påslagen och frekvensen vände upp tills maximal vibration observeras. Detta är den resonansfrekvens av sonden. Använda sonden vid denna frekvens kan orsaka instabilitet och producera ljud i inspelningen, så sonden är "de-trimmad" genom att subtrahera 10 Hz för att ge sondens arbetsfrekvens (vanligen 150-200 Hz). Den vibration amplituden justeras så att sonden vibrationer avståndet är detsamma som spetsen diameter, så att när proben vibrerade en "dubbel bild" av sondspetsen ses (se Figur 2B). För att bestämma fasvinkeln är sonden placeras i saltlösning i kalibreringen kammaren och en ström på 1,5 μA / cm 2 appliceras upprepade gånger. Fasvinkeln på låset förstärkaren justeras tills det finns inget svar. Addera eller subtrahera 90 ° till dennavinkel ger maximal respons, och denna vinkel är sondens arbetar fasvinkel. Den frekvens och fasvinkel för varje givare noteras för framtida bruk. Under ett experiment, är det viktigt att dessa inställningar av frekvens, amplitud och fas vinkel inte ändras, eftersom detta kommer att ändra sondens respons. För enkelhetens skull när strömmen flyter "syd-till-Nord", bör detta ge en uppåtgående nedböjning (kallas här "peak") i inspelningen spåra och ström "nord-syd" skall visa en nedåtgående nedböjning ( se figur 3A). Om detta är fel väg, kommer då att lägga till 180 ° fasvinkeln fixa det genom att bläddra svaren rundan. Se Reid et al. 1 för detaljerad information om teorin bakom sonden funktion, kalibrering etc.
Kalibrering: Svaret av sonden till en "standardiserad" ström på exakt 1,5 μA / cm 2, beräknat för sonden i en kalibrering kammare, används för att beräkna strömmen i urvalet (se Figur 2B, 3A). Före mätning på, är sonden kalibrerad i lämplig lösning, t.ex. BSS + Artificiell Riv lösning hornhinna. Aktuell tillämpas i två riktningar: syd-nord och nord-syd, som producerar en uppåtgående och en nedåtgående nedböjning, respektive, motsvarande utåt och inåt strömmar, beroende på orientering av provet. Sonden spår bör ha en stabil baslinje och låg ljudnivå (jämför figurerna. 3A och 3B). Sonden är kalibrerad vid slutet av experimentet i använda lösningen för att kompensera för osmolalitet ändras på grund av avdunstning. Vid analys av data, kan mätningar från första hälften av experimentet beräknas med hjälp av start kalibreringsvärdena, och mätningar från andra hälften beräknas med slutet kalibreringen.
Exempel Mätning: En avdelning kan behöva utformas för att hålla och immobilisera provet. Till exempel visar figur 3C petriskålar med tråd öglor att hålla ögonen på hornhinnan mätningar. Skålen med fysiologisk koksaltlösning placeras under dissekera mikroskop och området av intresse på provet placeras i fokus i synfältet. Sonden placeras sedan i lösning och orienterade parallellt med provets yta och också i fokus så det är på samma nivå som den punkt på det prov som skall mätas. Sonden flyttas så långt det är praktiskt (t ex 1-2 cm) från provet, vände vibrationer (och programvara som att spela in) för att upprätta en stabil (horisontellt) baslinjen (se Figur 4A). Sonden ställs in i mätläge, ca 50 ìm från ytan. När den nya ("peak") med stabilt värde, är sonden flyttade tillbaka till utgångsposition och spåra tillbaka till baslinjen. Detta kan upprepas med jämna tidpunkter för att producera timelapse data eller provet flyttas / roteras något och upprepas vid olika positioner för att ge rumsliga aktuella kartdata (se figur 4B, 5B).
Dataanalys: Data analyseras med WinWCP (se Figur 5A). Den horisontella röda "noll" linjen flyttas uppåt eller nedåt så det är parallellt med spåret baslinjen innan mätning topp. Den lodräta gröna mätsnöret flyttas över till spår baslinjen. Utgången behandlingen i grönt längst ned på den gröna linjen ska vara nära noll (t.ex. 0,00012). Detta nummer visar differnce mellan den punkt där de röda och gröna linjer kors och den blå kurvan. Den röda linjen är sedan flyttas upp tills det är parallellt med toppen av toppen. Den gröna utgång läsning är storleken på topp i mV. Uppgifterna för samtliga mätningar toppar och kalibreringsdata, läggs i en Microsoft Excel-mall (se tabell 1). Relevant information såsom datum, sond nummer, spänningsområde (VR), lösning som används, mätning positioner, tid etc., kan också sättas i kalkylbladet. Den nuvarande riktning (in eller ut ur provet: 'I / O ") är noterat, och inåt strömmar ges också ett negativt värde i" topp "kolumn. Strömmen i den högra kolumnen beräknas enligt formeln: nuvarande = peak * (1.5/calibration) där 1,5 är den aktuella i μA / cm 2 tillämpas vid kalibrering. Alltså: 'unw1' = 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 μA / cm 2.
4. Hemligheter till framgång
Som i alla elektrofysiologi, hjälper korrekt jordning (jordning) av vital utrustning för att eliminera brus. Således, åtminstone mikro-positioner och chassit i mikroskop ska vara jordad, och kanske också ljuskällan (se figur 1). Användaren kan också vara en källa till statisk elektricitet, så jordning via en handled-band kan förhindra instabilitet av sonden i vissa fall, men är inte alltid nödvändigt. En Faradays bur är inte nödvändigt, eftersom låset förstärkaren filtrerar bort alla frekvenser (t.ex. 60 Hz från kraftnät) förutom frekvensen sonden vibrerar på. En vibrationsisolering tabellen är användbart men inte nödvändigt. En solid, stabil bänk eller bord fungerar lika bra. Bortsett från de grundläggandeinformation i Excel (se ovan) är det bra att spela in i ett labb-boken ytterligare användbar information såsom förändringar i temperatur, drog tillägg, etc. Om fotografierna är tagna ner i mikroskop, notera förstoringen. Om relevant, är det också lämpligt att rita en skiss av provet (n) som visar position och / eller orientering sond mätningar (se figur 6).
Utmanande steg
- Probe gör: det måste finnas en god kontakt mellan sonden och R30 kontakten. Om inget händer på elektrolytisk skede, då detta är förmodligen orsaken.
- Kalibrering: använd lämpliga saltlösning eller odlingsmedium för provet kommer du att mäta. Inte över-eller under-fylla kalibrering kammaren eftersom detta kan ändra svaret. Ytan av vätskan ska vara platt överst i kammaren.
- Exempel på mått: Planera i förväg, gör t.ex. du måste göra en särskild avdelning för att hålla / montera provet (se figur 3C)? Vid mätning från ett prov, ska sonden orienterat med den långa axeln parallellt med provets yta, så att sondens riktning vibrationer (och därmed strömriktningen som skall mätas) är vinkelrät mot provets yta (till exempel, se figur 4B ). Provet kan flyttas och / eller roteras för mätningar i olika positioner. Det är viktigt att bibehålla en konsekvent avstånd mellan sonden och provets yta vid mätning. Den nuvarande uppmätta är proportionell mot avståndet från provets yta, som sonden rör sig bort från provets yta, den nuvarande sjunker med inverse square lag. Det är, när man mäter en ström genereras vid provets yta, är den nuvarande detekteras omvänt proportionell mot kvadraten på avståndet från ytan. En okularfokalplattan kan användas för att bedöma avståndet mellan sonden och provets yta.
Felsökning
- Problem: inget svar vid kalibrering. Lösning: Kontrollera koksaltlösning kontakta båda elektroderna. Kontrollera batteriet i konstant ström kalibrator.
- Problem: små svar. Lösning: Rengör sonden i dH 2 O och / eller aceton. Kontrollera fasvinkel.
- Problem: buller eller instabil baslinjen (se figur 3B). Lösning: Kontrollera jordledare.
- Problem: trace hoppar utanför skärmen. Lösning: Låt inte sondens spets till beröring prov.
5. Representativa resultat
Figur 3A visar ett bra exempel på en kalibrering spår. Notera den stabila (horisontellt) baslinjen, låg ljudnivå och stor respons. Som jämförelse visar Figur 3B en bullrig spår med instabil baslinjen. Aktuella mätningar i olika positioner på en mus hornhinnan sår visas i figur 4B. Den övre panelen visar sonden positioner, visar den mellersta panelen sonden spår som spelats in på datorn och den undre panelen är en graf över strömmar på olika positioner, som visar en profil av sår ström. Figur 5B visar mätningar på en mus hudsår göras med regelbundna tidsintervall för att fram uppgifter om såret aktuell tid-kurs.
Figur 1. Vibrerande prob-system. Se text för närmare beskrivning. Blå text beskriver funktionen hos den anslutande ledningar. Gröna symboler visar jordning poäng.
Figur 2. A. Probe montering. Sonden är limmas in i en guld R30-kontakt med silver-laddad epoxi, innan electroporating. I vissa system, är ett andra kontakten med en kort tråd att bära signalen lödda på. Skala bar 3 mm. Den platina bollen är inte att skala. B. Probe kalibrering. Den ständiga ström kalibratorn (till vänster) tillämpar en ström på 1,5 μA / cm 2 till sonden i kalibreringen kammare (höger). Nedre vänster: närbild av en sond. När sonden vibrerade (nedre högra) är amplituden justeras så en dubbel bild av spetsen ses. Skala bar 100 ìm.
Figur 3. A. Kalibrering spår. Exempel på en bra Kalibrering spår, med en stabil baslinje, låg ljudnivå och stor respons. Ström som flyter syd-nordlig ger en uppåtgående böjning och ström nord-syd ger en nedåtgående böjning. B. En instabil, bullriga sond spår. C. Chambers gjorde för montering musen (vänster) eller råtta (till höger) ögon för hornhinna mätningar. Skala bar 5mm.
Figur 4. Bevisa mätning exempel. A. En stabil baslinje är etablerad med sonden i referens läge 1-2 från provet. När sonden har flyttats till mätposition nära provet, upptäcker ennuvarande och spår deformeras uppåt (utåt ström). B. Mätningar vid olika positioner i en mus hornhinna skulle. Probe är orienterad parallellt med ytan, så vibration är vinkelrät. Uppåt toppar visa utåt strömmar. Maximal ström ses på sårkanterna (positioner B & F). Den schematiska av sonden visas på mätläge F (höger sår kant). Skala bar 300 ìm.
Figur 5. A. Analysera sond spår. Övre panel: den röda nollinjen flyttas uppåt eller nedåt så det är parallellt med spåret baslinjen, sedan den gröna mätsnöret flyttas över till baslinjen och ansluta utsignalen behandlingen i grönt är nära noll (0,00012). Nedre panelen: den röda linjen är sedan flyttas upp tills det är parallellt med toppen av spår topp, och den utgående läsning ger storleken på topp mV (12,45). Aktuell beräknas från detta genom att använda kalibreringsdata (se tabell 1). B. Mus hudsår Timelapse data. Aktuell innan såra visas vid tiden noll (röd symbol). Mätningar gjordes på samma position vid en mus hudsår regelbundna tidpunkter efter att såra. Efter inledande övergående inåt strömmar (under noll), vände den nuvarande och den utåt strömmar (positiv) steg långsamt och planade.
Figur 6. Lab-bok skisser som visar sond mäta positioner. A. Rat hjärnan, röda prickarna visar att mäta positioner och symboler sond visa sond läggning. B. Råtta hornhinnan sår, röda prickarna visar att mäta positioner och pilar visar riktning nuvarande mätas.
Tabell 1. Exempel på Excel-ark för att lagra och kvantifiera sond data. pN2_cal1 = start kalibrering, CAL + och Cal-= kalibreringsvärden i mV, VR = spänningsområde, peak = prov mätningar i mV, I / O = strömflödet (in eller ut ur prov).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en låg kostnad, grundläggande, men mycket känslig vibrerande sond system för att mäta icke-invasivt elektrisk ström i olika biologiska system.
Eventuella ändringar
- Om platina / iridium elektroder (World precisionsinstrument, katt # PTM23B20) används i stället för rostfritt stål, då förgyllning skede kan elimineras.
Applikationer
Vi har använt den vibrerande sond för att mäta elektrisk ström i: råtta hornhinna 2, råtta lins 3,4; musen huden 5, Xenopus grodyngel 6, mänsklig hud 7, mänskliga hornhinnan 8, Zebrafish embryo 1, Dictyostelium 1, råtta hjärnan 1. Den vibrerande sond beskrevs först av Jaffe och Nuccitelli 9. En datorstyrd sond som mäter strömmen i två dimensioner har också beskrivits 10. Relevanta intressanta recensioner är också 11-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till professor Richard Borgens, Centrum för Förlamning forskning, Purdue University, för hjälp med montering av vibrerande sond systemet. Denna studie stöddes av NEI bevilja NIH 1R01EY019101 till MZ och BR, dels genom anslag från California Institute of regenerativ medicin RB1-01.417, NSF MCB-0.951.199 och med ett obegränsat Grant från Forskning kring att förebygga blindhet, UC Davis oftalmologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eligoy-Stainless Electrode | World Precision Instruments, Inc. | SSM33A70 | 76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip |
| Gold R30 connector | www.vectorelect.com | R30 | Re-usable |
| Silver-loaded epoxy | 3M | SL65 | Mix 1-part Resin with 1-part Hardener |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ40 | Magnification x6 to x40 |
| Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2) | Sigma-Aldrich | 379867 | CAUTION: Toxic |
| Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O) | Sigma-Aldrich | 520896 | CAUTION: Toxic |
| Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O) | Sigma-Aldrich | 185191 | CAUTION: Toxic |
| Nano-Amp power source | Home made | - | Powered by six 1.5 V (AAA) batteries |
| 3-dimensional micro-positioner | Line Tool Co. | Model H | |
| Lock-in amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Digital I/O interface | National Instruments | PCI-6220 | |
| Shielded Connector Block with BNC connections | National Instruments | BNC-2110 | |
| Strathclyde Electrophysiology Software | University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK | WinWCP V4.1.5 | Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm |
| Calibration Chamber | Home made | ||
| Constant Current Calibrator | Vibrating Probe Company | Powered by one 9 V (PP3) battery |
References
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).
- Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. Wound healing in rat cornea: the role of electric currents. FASEB J. 19, 379-386 (2005).
- Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electric currents and lens regeneration in the rat. Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).
- Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract. FASEB J. 19, 842-844 (2005).
- Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts. J. Invest. Derm. , (2010).
- Reid, B., Song, B., Zhao, M. Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration. Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ. 442, 457-460 (2006).
- Reid, B., EO, G. raue-H. ernandez, Mannis, M. J., Zhao, M. Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes. Cornea. , Forthcoming (2010).
- Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).
- Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns. J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).
- Nuccitelli, R. Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues. Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).
- Levin, M. Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).
- Zhao, M. Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).
