Summary
有技术上的障碍，通过多种离子通道同时测量电流磁通后雪亮的跨膜电流的部分是由于每个通道的类型。为了满足这一需要，这种方法提出了一种方法来生成个别通道，使用特定的频率成分类型的IV曲线。
Abstract
简介：目前，有没有既定的方法来测量多种离子通道类型的同时，并分解到每个通道类型的部分占被测电流。这项研究表明，阻抗谱可用于识别与稳态电流在电压钳实验测量的幅度，高度相关的特定频率。该方法包括插入一个电压一步协议将包含特定频率的噪音功能。在工作中，一个细胞模型是用来证明没有很高的相关性，介绍了电压钳位电路，还噪音功能本身不引入任何高度相关时，没有离子通道是存在。前的技术可应用于含有离子通道，这种验证是必要的。提出的协议的目的是演示如何噪音功能特征的单一离子通道类型的频率响应。一旦特定的频率已确定在一个单独的通道类型，它们可以被用来重现的稳态电流电压（IV）曲线。高度相关的一个通道类型和微创与其他类型的通道相关的频率，然后可以用来估计同时测量多通道类型的电流贡献。
方法：使用标准电压一步协议（-150至+50 mV时，为5mV步骤）的细胞模型上进行钳位电压测量。噪音的功能，包含1-15千赫频率（零峰值幅度：50或100mV的）的平等程度，分别插入到每个电压的一步。计算每一步的潜力和无噪音的输出信号的快速傅立叶变换（FFT）的真正组成部分。每个频率的电压阶跃函数幅度与相应的电压电流的幅值。
结果与结论：在噪音的情况下（控制）的直流分量之外的所有频率的大小相关性较差（| R | <0.5）的IV曲线，直流分量，而在所有的测量相关系数大于0.999。个别频率和IV曲线之间的相关性的质量并没有改变时的噪音功能被添加到电压阶跃协议。同样，增加幅度噪声功能的同时，也没有增加相关。控制测量表明，电压钳位电路本身不会引起0赫兹以上的频率，以高度关联与稳态的IV曲线。同样，在存在噪声功能测量表明，噪声功能不会导致0赫兹以上的频率与稳态的IV曲线没有离子通道是存在关联时。基于此验证，该方法可以适用于含有单一离子通道类型的识别频率，其振幅相关专门与该通道类型的意图。
Protocol
1。准备噪声功能和输入信号
- 创建噪音的功能，包含所需的频率成分。这可以通过在频域描述所需的频率成分，然后计算逆快速傅立叶变换。在这项研究中，1 - 15千赫。傅立叶变换和逆傅里叶变换在这项研究中中所描述的所有计算使用Matlab的FFT和IFFT功能。
- 适当规模的噪音功能的振幅。在这项研究中，噪声功能，缩放等零到峰值噪声功能的幅度是50或100毫伏。
- 适用于正在使用的数据采集软件的使用方法，创建一个激励文件。对于Clampex 8，首先要创建一个文本文件，用适当的头。标题下方，插入在第一列的单次扫描的时间增量。时间增量应在测量中使用的采样间隔相同的时间间隔。对于每个电压阶跃协议的扫描插入在每个时间步所需的精确电压。这应包括噪音的功能。
2。执行电压钳测量
- 内采集软件兼容与以前生成的刺激文件的测量协议。在Clampex，有一个菜单，允许用户与当前协议相关联的激励文件。
- 将模型（或生物）细胞的测量设备。
- 如期进行实验。控制的目的，确保包括定期测量，不包括任何噪音功能。
3。发布实验分析
- 计算个人录制的IV曲线。如果录音是在稳定状态时的噪音功能，IV曲线可以创建使用稳态部分的录音时间外的噪音功能的范围。如果录制处于稳定状态，噪音的功能可能会干扰IV曲线的计算，所以，第二个记录应无噪音的功能目前。
- 对于中的每个记录的电压步骤，计算快速傅立叶变换的噪声功能插入记录的部分。结合傅立叶变换，每个电压阶跃到amxn矩阵，其中m是在FFT的频率数，而n是电压步骤。在此配置中，矩阵的每一行代表一个单频的振幅电压在实验中的所有步骤。
- 针对每一个频率（即在上述矩阵的每一行）3.1产生的IV曲线相关联行和记录的相关系数。
- 画出相关系数随频率的可视化高度相关IV曲线的频率。由于直流分量载内的FFT第一频率，这个频率的相关系数应始终> 0.99。
4。代表性的成果：
代表钳位电压测量显示为细胞模型（图1A）（图1B）插入电压阶跃协议噪音功能。 IV曲线计算模型细胞（图1C）。每次扫描，从图1的录音，FFT计算超过时限插入噪声功能（参见图1A，1B红色框）。图2a和2b显示分别显示在图1A和1B，录音计算的FFT。目视检查后，出现的直流分量（以红色突出显示），以模仿的IV曲线的形状。无噪音的功能，直流以上的所有频率似乎已经接近零振幅（图2A）。噪音的功能是当插入，1至15千赫的频率有明显的视觉振幅（图2B）。图3显示的关联比对IV曲线的电压步骤的范围内各个频率振幅的结果。图3A - C的显示时，实验控制的条件下（无噪声功能）和噪声幅度分别为50和100 mV时，相关系数。请注意在所有情况下，出现的直流成分几乎完全相关的IV曲线。事实上，所有的录音，这个频率的相关系数大于0.99（R = 0.9996 ± 1E - 5，平均±标准偏差）。当我们在图3A（控制条件），有没有频率除了直流分量，其幅度明显IV曲线相关。具体地说，这些频率的相关系数大于0.5。最低幅度噪声功能（50毫伏）插入后，这些相同的频率仍然相关系数小于0.5。为相关系数SE的频率也没有成为噪声的幅度大于0.5时提高到100 mV。
图1模型细胞录音：电压钳记录一个细胞模型（1A）及（1B）电压步进协议中包含一个噪音功能。对于第一个和最后一个20毫秒每次扫描，潜力保持在控股的潜力（0 mV时）。每个电压步长80毫秒，和噪音功能的步骤开始后插入40毫秒。噪声功能持续时间30毫秒，含有1至15千赫的频率。电压为加强回回，在-150至+50 mV的5 mV递增。还表现为细胞模型的IV曲线（1C）。为了使录音更容易阅读，只有五分之一扫描是包括在1A和1B，但所有的扫描，在1C。
图2 FFT录音：FFT的计算为30毫秒每次扫描部分噪音的功能是要插入（红色方块图1A，1B范围内）。图2a和2b显示的FFT计算分别与无噪音功能。再次，为清晰起见，，只有FFT五分之一的扫描图中，但所有的扫描，在未来的计算。
图3四频率的相关性：录制的IV曲线和对个人的电压步骤范围频率的振幅之间的相关性的结果显示。图1A - 1C显示相关系数分别控制的条件下从0到20 kHz的频率，并在50或100毫伏的噪声功能的存在。
图4再创造的IV曲线：细胞模型（图1C相同）和两个频率的幅度IV曲线叠加。第一频率的直流分量（R = 0.995），第二个是随机选择的频率低相关性（r = 0.3212）。频率振幅缩小约IV曲线的幅度相同。
Discussion
有技术障碍，目前防止研究人员同时测量后确定多大的电流应归功于每个通道类型的意图的多种离子通道类型。由于此限制，通常是研究离子通道是单独使用，如电压，电流和动作电位钳技术（1）为了研究异源表达系统通常使用的通道类型，（2）当工作从组织中分离出的细胞，如心肌细胞， ，必须使用其他手段来阻止各种离子通道。例如，钠通道，可以通过一个缓慢的去极化电压斜坡灭活，3内向整流钾通道可以阻止外氯化钡，第4和可阻断钙离子通道的使用维拉帕米5 。
使用的方法之一，部分克服了这个限制是通过两个渠道类型来衡量当前通量同时，选择性地阻断一个渠道类型与相应的代理后，再重复测量。两次测量的加减就可以被用来估计电流的通道被阻塞占的数量 。然而，这种技术有两个主要限制。首先，化学制剂没有被确定，可以选择性地阻断每个离子通道，和一些广泛使用的药物与其他类型的通道的非特异性相互作用 。5,7秒，它可以从这种技术不能确定是否一个渠道是由另一调制通道。例如，资产净值的1.5和2.1 KIR表达异构已被证明在豚鼠心室，并已建议，两个通道之间存在一种协同关系，例如，更高的KIR 2.1在右心室的表达抑制传导速度。8目前，这无法验证。
在这项研究中，我们建议，阻抗谱可能是一种有用的工具，用于研究离子通道同时测量多个类型。虽然提出的方法从来没有被用来辨别从两个通道同时测量类型的电流，阻抗谱已被用于研究离子通道的功能等方面。古德曼和艺术表现出使用龟听觉毛细胞电流钳协议可以修改，调整一个单元，以不同的频率，并在跨膜电位的振荡是由于一个内向整流钾离子通道和Ca 2 +通道之间的相互作用。 9韩和弗雷泽表明，阻抗，可在一个单元格来衡量一个宽的频率范围（100 Hz到5 MHz），并观察阻抗增加， 当 K + 或Ca 2 +通道被堵塞，可能是一个简单的方法来检测通道高通量药物屏幕块。10林和Fishman使用复杂的电导研究一个内向整流钾离子通道，11个其他团体已插入单一的频率和电压钳位到不同类型的通道协议的动力学特性，结果显示，观察到的频率响应，同意与预期的响应某些频率，而不是其他。12,13 Millonas和Hanck建议的原因，某些频率没有产生预期的反应是马尔可夫模型中存在的多速率常数12这类研究，以及其他表明，有实例，当同时使用阻抗谱测量从离子通道的离子电流与理论频率响应不同意。这是不是在这项研究中关注的问题，因为在这项研究中的方法的目的是要找出与膜的电路的基本假设独立的电流幅值相关的频率。 Furtheremore，电流的幅度计算，从没有任何噪音功能插入到他们的录音部分。其他一些研究也目前许多离子通道模型参展的所有用自己的速率常数众多国家进行非传导。14,15,16汤普森等人发现，KCSA通道的选择性过滤器有不同的结合位点的Na +李+和K +，和移动之一约束力的站点通过的选择性过滤器一个离子移动到另一个的充满活力的成本是什么使得通道优先进行通过其孔隙钾离子。本文17，我们插入一个范围成一个电压阶跃协议（噪音的功能）的频率和频率的振幅高度关联的整体电流幅值。由于强有力的证据已提出建议，多速率常数发挥离子传导通过分化的作用T频道，推出这些速率常数相关的频率可能会导致某些频率产生共鸣，或与电流的幅度，否则不会有高度关联。在这项研究中表现出的技术是执行上的细胞模型，这是一个并联的RC电路，通常是用来测试的电压钳位电路和数据采集设备。预计不会直流以外的任何频率与电流的大小相关联，这是在我们的数据显示。我们还表明，另外噪音功能没有造成任何频率高度相关的电流幅值。这两项调查结果是至关重要的，因为它们显示测量设备和噪声功能本身并不能造成任何频率电流幅值相关。当未来的研究中使用膜含有离子通道进行测量，它预计，取决于所使用的通道，选择性过滤器或可能的孔隙率常数对应的频率会影响通道的频率响应，影响频率高或关联度低，与当前的振幅。
由于这种方法是一种用于研究离子通道的新技术，也有未来的研究可以遵循的方向。首先，这项技术应该被用来描述特定的隔离通道的频率响应。其他工作也需要进行校准的频率振幅的电流幅度。一旦多渠道的特点是单独的，应同时测量多通道类型。该技术也可以适应动作电位钳，电流钳，并刺激研究使用。虽然这是一种新技术，它说明了什么，可能是一种强有力的方式，使以前不可能的电生理测量和离子通道的生理作用提供了有价值的新见解。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家卫生部授予R21 - HL094828 - 01授予博士Poelzing研究院支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
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