Summary
Ci sono ostacoli tecnici per la misurazione del flusso di corrente attraverso i canali ionici contemporaneamente, e poi discernere quale porzione della corrente transmembrana è dovuto a ogni tipo di canale. Per rispondere a questa esigenza, questo metodo presenta un modo per generare la curva IV di tipo singolo canale utilizzando componenti di frequenza specifica.
Abstract
INTRODUZIONE: Attualmente, non esistono metodi consolidati per misurare più tipi di canali ionici contemporaneamente e decomporre la corrente misurata in porzioni attribuibile a ciascun tipo di canale. Questo studio dimostra come spettroscopia di impedenza può essere utilizzato per identificare frequenze specifiche che altamente correlato con l'ampiezza stato stazionario corrente misurata durante gli esperimenti clamp di tensione. Il metodo prevede l'inserimento di una funzione di rumore contenenti frequenze specifiche nel protocollo fase di tensione. Nel lavoro presentato, una cellula modello è usato per dimostrare che non elevate correlazioni sono introdotti dal circuito di clamp di tensione, e anche che la funzione di disturbo per sé non introduce alcuna correlazione elevata in assenza di canali ionici sono presenti. La convalida è necessario prima che la tecnica può essere applicata a preparati contenenti canali ionici. Lo scopo del protocollo presentato è quello di dimostrare come caratterizzare la risposta in frequenza di un unico tipo di canale ionico a una funzione di rumore. Una volta frequenze specifiche sono state identificate in un tipo di canale individuale, possono essere utilizzati per riprodurre il costante stato di tensione (IV) della curva. Frequenze che altamente correlati con un tipo di canale e minimamente correlato con altri tipi di canali possono poi essere utilizzate per stimare il contributo attuale di tipi di canali più misurati simultaneamente.
METODI: misurazioni con la pinza di tensione sono stati eseguiti su una cella modello utilizzando un protocollo standard passo tensione (-150 a +50 mV, 5mV gradini). Funzioni di disturbo contenenti grandezze uguali di 1-15 kHz frequenze (da zero a ampiezze di picco: 50 o 100 mV) sono stati inseriti in ogni fase di tensione. La componente reale della trasformata rapida di Fourier (FFT) del segnale di uscita è stato calcolato con e senza rumore per ciascun potenziale passo. La grandezza di ogni frequenza in funzione della fase di tensione è stata correlata con l'ampiezza della corrente a tensioni corrispondenti.
RISULTATI E CONCLUSIONI: In assenza di rumore (controllo), grandezze di tutte le frequenze eccetto la componente DC scarsamente correlati (| R | <0.5) con la curva IV, mentre la componente DC aveva un coefficiente di correlazione superiore a 0,999 in tutte le misure. La qualità della correlazione tra singole frequenze e la curva IV non cambia quando una funzione di disturbo è stato aggiunto al protocollo fase di tensione. Allo stesso modo, aumentando l'ampiezza della funzione di rumore, inoltre, non ha aumentato la correlazione. Misure di controllo dimostrino che i circuiti morsetto tensione di per sé non causa alcun frequenze superiori a 0 Hz a correlare fortemente con la steady-state della curva IV. Allo stesso modo, le misure in presenza della funzione di rumore dimostrare che la funzione di rumore non provoca alcun frequenze superiori a 0 Hz a correlare con la steady-state curva IV in assenza di canali ionici sono presenti. Sulla base di questa verifica, il metodo può ora essere applicato ai preparati contenenti un singolo tipo di canale ionico con l'intento di identificare le cui frequenze ampiezze correlare specifically con quel tipo di canale.
Protocol
1. Preparare funzione del rumore e del segnale di ingresso
- Creare una funzione rumore contenente le componenti di frequenza desiderata. Questo può essere fatto descrivendo i componenti frequenza desiderata nel dominio della frequenza e quindi il calcolo della inversa trasformata rapida di Fourier. In questo studio, 1 - 15 kHz è stato utilizzato. Tutte le trasformate di Fourier e trasformate di Fourier inversa descritto in questo studio sono stati calcolati utilizzando Matlab FFT e funzioni IFFT.
- Scala l'ampiezza della funzione di rumore in modo appropriato. In questo studio la funzione di rumore è stato scalato in modo tale che lo zero a picco di ampiezza della funzione di rumore era 50 o 100 mV.
- Creare un file stimolo con metodi adeguati per il software di acquisizione in uso. Per CLAMPEX 8, prima creare un file di testo con l'intestazione appropriata. Sotto l'intestazione, inserire gli incrementi di tempo per una sola passata nella prima colonna. Gli incrementi di tempo deve avere la stessa spaziatura temporale come l'intervallo di campionamento utilizzato nelle misure. Per ogni spazzare nel protocollo fase di tensione inserire la tensione esatta desiderato ad ogni passo. Questo dovrebbe includere la funzione del rumore.
2. Effettuare misurazioni con la pinza di tensione
- Creare un protocollo di misura all'interno del software di acquisizione che è compatibile con il file stimolo generato in precedenza. In CLAMPEX, c'è un menu che consente all'utente di associare un file di stimolo con il protocollo corrente.
- Allegare un modello (o biologico) delle cellule alle apparecchiature di misura.
- Eseguire l'esperimento come programmato. A fini di controllo, assicurarsi di includere le misurazioni periodiche che non prevedono alcuna funzione del rumore.
3. Messaggio Esperimento Analisi
- Calcolare la curva IV per una registrazione individuale. Se la registrazione è a stato stazionario quando la funzione di rumore viene applicata, la curva IV possono essere creati utilizzando una parte allo stato stazionario della registrazione temporalmente al di fuori della gamma della funzione del rumore. Se la registrazione non era in stato stazionario, la funzione di rumore può interferire con il calcolo della curva IV, per cui una seconda registrazione deve essere fatta senza la funzione di rumore presente.
- Per ogni fase di tensione in una registrazione calcolare la trasformata rapida di Fourier della porzione della registrazione in cui è stata inserita la funzione di rumore. Combina la trasformata di Fourier per ogni step di tensione in amxn matrice, dove m è il numero di frequenze in FFT, e n è il numero di passi di tensione. In questa configurazione, ogni riga della matrice rappresenta l'ampiezza di una singola frequenza a tutte le fasi di tensione durante l'esperimento.
- Per ogni frequenza (cioè ogni riga della matrice sopra) correlare la riga con la curva IV generata in 3.1 e registrare il coefficiente di correlazione.
- Tracciare il coefficiente di correlazione vs frequenza per visualizzare frequenze che altamente correlati con la curva IV. Poiché la componente DC è contenuta all'interno la prima frequenza della FFT, il coefficiente di correlazione per questa frequenza dovrebbe sempre essere> 0,99.
4. Rappresentante dei risultati:
Le misurazioni rappresentative morsetto di tensione sono mostrate per una cella modello senza (Figura 1A) e con (Figura 1B) una funzione di disturbo inseriti nel protocollo fase di tensione. La curva IV è stato calcolato per il modello di cellulare (Figura 1C). Per ogni sweep, nelle registrazioni dalla Figura 1, la FFT è stato calcolato nel periodo di tempo in cui è stata inserita la funzione di rumore (vedi riquadro rosso nelle Figure 1A, 1B). Figure 2A e 2B mostrano la FFT calcolato per le registrazioni Figura 1A e 1B, rispettivamente. Su ispezione visiva, la componente DC (evidenziati in rosso) sembra imitare la forma della curva IV. Senza la funzione di rumore, tutte le frequenze sopra DC sembrano avere ampiezze vicino allo zero (Figura 2A). Quando la funzione rumore viene inserito, frequenze comprese tra 1 e 15 kHz hanno ampiezze visivamente evidente (Figura 2B). La figura 3 mostra il risultato di correlare ampiezze di frequenza individuale su tutta la gamma di gradini di tensione contro la curva IV. Figura 3A-C mostra i coefficienti di correlazione, quando l'esperimento è stato fatto in condizioni di controllo (nessuna funzione rumore) e con ampiezze di rumore di 50 e 100 mV, rispettivamente. Si noti in tutti i casi, la componente DC sembra essere correlata quasi perfettamente con la curva IV. Infatti, per tutte le registrazioni, il coefficiente di correlazione per questa frequenza è stata superiore a 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, media ± deviazione standard). Quando guardiamo figura 3A (condizioni di controllo), non ci sono frequenze oltre alla componente continua la cui ampiezza è correlata in modo significativo con la curva IV. In particolare, nessuna di queste frequenze hanno coefficienti di correlazione superiore a 0,5. Al momento l'inserimento della funzione di ampiezza minore rumorosità (50 mV), queste stesse frequenze ancora coefficienti di correlazione inferiore a 0,5. I coefficienti di correlazione per l'frequenze anche se non sono diventati superiori a 0,5 quando l'ampiezza del rumore è stato aumentato a 100 mV.
. Figura 1 Modello di Registrazioni Cell: registrazioni morsetto di tensione sono indicati per una cella modello senza (1A) e con (1B) una funzione di rumore compresi nel protocollo fase di tensione. Per i primi e ultimi 20 ms di ogni scansione, il potenziale è stato mantenuto al potenziale tenendo (0 mV). Ogni passo tensione era lungo 80 ms, e la funzione di rumore è stato inserito 40 ms dopo l'inizio del passo. La funzione del disturbo ha una durata di 30 ms e contenuti frequenze comprese tra 1 e 15 kHz. Tensione è stato un passo indietro, -150 a +50 mV con incrementi di 5 mV. Una curva IV per la cella modello è inoltre mostrato (1C). Per rendere le registrazioni più facili da leggere, solo ogni spazzare quinto è stato incluso nella 1A e 1B, ma tutto spazza sono stati inclusi nella 1C.
Figura 2 FFT delle registrazioni:. La FFT è stato calcolato per la quota di 30 ms di ciascuna scansione in cui la funzione di rumore è da inserire (l'area delimitata dal riquadro rosso nelle Figure 1A, 1B). Figure 2A e 2B mostrano la FFT calcolata senza e con la funzione di rumore, rispettivamente. Ancora una volta, per chiarezza, solo la FFT da ogni scansione quinto è incluso nella figura, ma tutto spazza sono stati utilizzati nei calcoli futuri.
. Figura 3 Correlazioni Frequenza IV: I risultati delle correlazioni tra la curva IV di una registrazione e l'ampiezza delle singole frequenze sopra la gamma di gradini di tensione è mostrato. Figure 1A - 1C mostrano il coefficiente di correlazione per frequenze da 0 a 20 kHz in condizioni di controllo, e in presenza di 50 o 100 funzioni di disturbo mV, rispettivamente.
Figura 4 Ri-Creazione della Curva IV:. La curva IV della cella modello (lo stesso di Figura 1C) e la grandezza di due frequenze sono stati sovrapposti. La prima frequenza è stata la componente DC (R = 0,995), e il secondo è stato una frequenza scelta a caso con una bassa correlazione (R = 0,3212). Le ampiezze di frequenza sono stati scalati a circa la stessa ampiezza della curva IV.
Discussion
Ci sono ostacoli tecnici che attualmente impediscono ai ricercatori di misurare più tipi di canali ionici in contemporanea con l'intento poi di determinare la quantità di corrente deve essere attribuito a ciascun tipo di canale. A causa di questa limitazione, i canali ionici sono solitamente studiati singolarmente utilizzando tecniche come la tensione, corrente, e l'azione morsetto potenziale. 1 Per studiare i singoli tipi di canali, sistemi di espressione eterologa sono spesso utilizzati. 2 Quando si lavora con le cellule isolate dal tessuto, come cardiomiociti , altri mezzi devono essere utilizzati per bloccare i canali ionici diversi. Per esempio, i canali del sodio può essere inattivato da una rampa lenta di tensione depolarizzanti, 3 canali di potassio verso l'interno rettificazione può essere bloccato con extracellulare BaCl2, 4 e canali del calcio possono essere bloccati con verapamil 5.
Un metodo usato che supera in parte questa limitazione è quella di misurare il flusso di corrente attraverso due tipi di canali contemporaneamente, quindi ripetere la misurazione dopo bloccando selettivamente un tipo di canale con un agente adeguato. Sottrazione delle due misurazioni possono quindi essere utilizzate per stimare la quantità di corrente riconducibile al tipo di canale che è stato bloccato. 6 Tuttavia, ci sono due limitazioni principali di questa tecnica. In primo luogo, gli agenti chimici non sono stati identificati in grado di bloccare selettivamente ogni canale ionico, e alcuni farmaci ampiamente utilizzati sono non-specifici interazioni con altri tipi di canale. 5,7 secondo luogo, non può essere determinato da questa tecnica se un canale è modulata da un altro canale. Per esempio, l'espressione eterogenea di Nav 1.5 e Kir 2.1 è stato mostrato in India ventricoli di maiale, ed è stato suggerito che un rapporto sinergico esistente tra i due canali, in modo che più Kir 2,1 espressione nel ventricolo destro deprime velocità di conduzione. Attualmente 8 , questo non può essere verificata.
In questo studio, si consiglia di spettroscopia di impedenza può essere un utile strumento per lo studio di più tipi di canali ionici misurate simultaneamente. Anche se il metodo presentato non è mai stato utilizzato per distinguere le correnti da due tipi di canali di misura contemporaneamente, spettroscopia di impedenza è stata utilizzata per studiare una serie di altri aspetti della funzione di canale ionico. Goodman e Art ha dimostrato utilizzando tartaruga cellule ciliate uditive che i protocolli di pinza di corrente può essere modificato per sintonizzare una cella a diverse frequenze, e le oscillazioni del potenziale transmembrana è dovuto ad un interazione tra un interno rettificare K + canale e un canale di Ca 2 +. 9 Han e Frazier ha dimostrato che l'impedenza può essere misurata in una singola cella in un ampio range di frequenze (100 Hz a 5 MHz), e l'aumento di impedenza osservata quando K + o Ca 2 + canali sono stati bloccati potrebbe essere un mezzo semplice per rilevare blocco dei canali in schermi ad alta velocità di droga 10. Hayashi e Fishman hanno usato conduttanza complessi per studiare le proprietà cinetiche di un interno rettificare K + canale. 11 Altri gruppi hanno inserito una singola frequenza nel protocollo morsetto tensione di diversi tipi di canale e ha mostrato che il risposta in frequenza osservata d'accordo con la risposta attesa per alcune frequenze, ma non altri. 12,13 Millonas e Hanck suggerito la ragione per alcune frequenze non ha prodotto la risposta attesa è la presenza di costanti di velocità più nel modello di Markov. 12 Studi come questi, così come altri, hanno dimostrato che vi sono casi in cui le correnti ioniche misurate dai canali ionici, mentre utilizzando la spettroscopia di impedenza non sono d'accordo con la risposta in frequenza teorica. Questo non è un problema in questo studio perché lo scopo del metodo in questo studio è quello di identificare le frequenze che correlano con l'ampiezza indipendente corrente degli assunti alla base del circuito elettrico della membrana. Furtheremore, l'ampiezza della corrente viene calcolata dalle parti di registrazioni che non hanno funzioni di disturbo inseriti al loro interno. Un certo numero di altri studi, anche attuali modelli di canali ionici numerosi espositori numerosi stati condurre e non di conduzione, tutte con le loro costanti ritmo. 14,15,16 Thompson et al ha mostrato che il filtro di selettività del canale KcsA ha diversi siti di legame per il Na +, Li + e K +, ed i costi energetici di spostarsi da un sito di legame a un altro come si muove ioni attraverso il filtro di selettività è ciò che rende il canale preferenziale condotta K + ioni attraverso i suoi pori. 17 In questo lavoro abbiamo inserito una gamma di frequenze (funzione rumore) in un protocollo fase di tensione e cercato le frequenze la cui ampiezza altamente correlato con l'ampiezza di corrente globale. Dal forte evidenza è stato presentato suggerendo costanti di velocità più svolgere un ruolo nella conduzione degli ioni attraverso different canali, l'introduzione delle frequenze associate a questi costanti di velocità può causare certe frequenze di risonanza o altamente correlato con l'ampiezza della corrente, che non sarebbe altrimenti. La tecnica ha dimostrato in questo studio viene eseguita su un modello di cellulare, che è un circuito parallelo RC che di solito è utilizzato per testare i circuiti di tensione morsetto e apparecchiature di acquisizione. Non è previsto che tutte le frequenze oltre DC sarebbe correlato con l'entità attuale, e questo è dimostrato nei nostri dati. Mostriamo anche che l'aggiunta della funzione di rumore non ha causato alcuna frequenza di correlare fortemente con l'ampiezza della corrente. Questi due risultati sono fondamentali perché dimostrano che le apparecchiature di misura e la funzione del rumore per sé, non causa alcun frequenze di correlare con l'ampiezza della corrente. Quando gli studi futuri effettuare la misurazione in membrane contenenti i canali ionici, si prevede che, a seconda del canale utilizzato, le frequenze che corrispondono alle costanti di velocità nel filtro di selettività o, eventualmente, il poro influenzano la risposta in frequenza del canale e influenzano le frequenze che hanno un elevato o bassa correlazione con l'ampiezza della corrente.
Poiché questo metodo è una nuova tecnica per lo studio dei canali ionici, ci sono una serie di direzioni studi futuri potrebbero seguire. In primo luogo, la tecnica deve essere utilizzata per caratterizzare la risposta in frequenza di specifici canali isolati. Lavoro in più ha anche bisogno di essere fatto per calibrare le ampiezze di frequenza per le ampiezze di corrente. Una volta di più canali sono caratterizzati individualmente, tipi di canali multipli devono essere misurate simultaneamente. La tecnica potrebbe anche essere adattati per l'uso in morsa del potenziale d'azione, pinza elettrica, e studi di stimolazione del campo. Mentre questa è una nuova tecnica, mostra quello che potrebbe essere un potente strumento per effettuare misurazioni elettrofisiologiche che non erano precedentemente possibili e fornire preziose intuizioni nuove informazioni sul ruolo fisiologico dei canali ionici.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of numero Salute concedere R21-HL094828-01 assegnato al Dr. Poelzing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
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