Summary
Il ya des obstacles techniques à la mesure du flux de courant à travers les canaux ioniques multiples simultanément, et plus tard exigeants quelle portion du courant transmembranaire est due à chaque type de canal. Pour répondre à ce besoin, cette méthode présente un moyen pour générer la courbe IV de types de canaux individuels en utilisant des composants de fréquence spécifique.
Abstract
INTRODUCTION: Actuellement, il n'existe aucune méthode établie pour mesurer plusieurs types de canaux ioniques simultanément et décomposer le courant mesuré en portions attribuables à chaque type de canal. Cette étude montre comment la spectroscopie d'impédance peut être utilisée pour identifier des fréquences spécifiques qui hautement corrélée avec l'amplitude état stable courant mesuré au cours des expériences de potentiel imposé. La méthode consiste à insérer une fonction de bruit contenant des fréquences spécifiques dans le protocole échelon de tension. Dans le travail présenté, une cellule modèle est utilisé pour démontrer qu'aucun des corrélations élevées sont introduits par les circuits de voltage, et aussi que la fonction de bruit lui-même ne pas introduire de fortes corrélations quand aucun des canaux ioniques sont présents. Cette validation est nécessaire avant que la technique peut être appliquée à des préparations contenant des canaux ioniques. Le but du protocole présenté est de démontrer la façon de caractériser la réponse en fréquence d'un type canal ionique unique à une fonction de bruit. Une fois les fréquences spécifiques ont été identifiés dans un type de canal individuel, ils peuvent être utilisés pour reproduire l'état d'équilibre actuel de tension (IV) la courbe. Les fréquences qui très corrélés avec un type de canal et peu corrélée avec les types de canaux d'autres peuvent ensuite être utilisées pour estimer la contribution actuelle des types de canaux multiples mesurés simultanément.
Méthodes: mesures avec la pince de tension ont été réalisées sur une cellule du modèle en utilisant un protocole standard de tension étape (-150 à +50 mV, 5mV étapes). Fonctions de bruit contenant grandeurs égales de 1-15 kHz fréquences (de zéro à amplitudes de crête: 50 ou 100 mV) ont été insérés dans chaque étape de tension. La composante réelle de la transformée de Fourier rapide (FFT) du signal de sortie a été calculée avec et sans bruit pour chaque étape potentiels. La grandeur de chaque fréquence en fonction de l'étape de tension a été corrélée avec l'amplitude du courant à la tension correspondante.
RÉSULTATS ET CONCLUSIONS: En l'absence de bruit (de contrôle), les grandeurs de toutes les fréquences, sauf la composante continue corrélée mal (| r | <0,5) avec la courbe IV, tandis que la composante continue a un coefficient de corrélation supérieur à 0,999 dans toutes les mesures. La qualité de la corrélation entre les fréquences individuelles et la courbe IV ne change pas quand une fonction de bruit a été ajouté au protocole échelon de tension. De même, l'augmentation de l'amplitude de la fonction de bruit n'a pas non plus augmenter la corrélation. Les mesures de contrôle montrent que le circuit de voltage par lui-même ne cause pas les fréquences au dessus de 0 Hz à grande corrélation avec la courbe de l'état stationnaire IV. De même, les mesures en présence de la fonction du bruit de démontrer que la fonction de bruit ne provoque pas de fréquences au-dessus de 0 Hz à corréler avec la courbe de l'état stationnaire IV quand aucun des canaux ioniques sont présents. Basé sur cette vérification, la méthode peut maintenant être appliqué à des préparations contenant un type d'ions mono-canal avec l'intention de fréquences dont l'amplitude d'identifier spécifiquement en corrélation avec ce type de canal.
Protocol
1. Préparer Fonction bruit et le signal d'entrée
- Créer une fonction de bruit contenant les composants de fréquence désirée. Cela peut être fait en décrivant les composants de fréquence souhaitée dans le domaine fréquentiel puis en calculant la transformée de Fourier rapide inverse. Dans cette étude, 1 - 15 kHz a été utilisé. Toutes les transformations de Fourier et de Fourier inverse transforme décrites dans cette étude ont été calculées en utilisant la FFT de Matlab et les fonctions IFFT.
- Échelle de l'amplitude de la fonction de bruit de manière appropriée. Dans cette étude, la fonction de bruit a été réduit de telle sorte que le zéro à pic d'amplitude de la fonction de bruit est de 50 ou 100 mV.
- Créer un fichier de relance en utilisant des méthodes appropriées pour le logiciel d'acquisition utilisé. Pour Clampex 8, d'abord créer un fichier texte avec l'en-tête approprié. Ci-dessous l'en-tête, insérez l'incrément de temps pour un seul balayage de la première colonne. Les incréments de temps devrait avoir le même espacement temporel que l'intervalle d'échantillonnage utilisé dans les mesures. Pour chaque balayage dans le protocole de l'échelon de tension d'insérer les tensions exacte souhaitée à chaque pas de temps. Ceci devrait inclure la fonction de bruit.
2. Effectuer des mesures de voltage
- Créer un protocole de mesure dans le logiciel d'acquisition qui est compatible avec le fichier de relance généré précédemment. En Clampex, il ya un menu qui permet à l'utilisateur d'associer un fichier de relance avec le protocole actuel.
- Attacher un modèle (ou biologique) de cellules à l'équipement de mesure.
- Réaliser l'expérience, comme prévu. Aux fins de contrôle, assurez-vous d'inclure des mesures périodiques qui ne comprennent pas toutes les fonctions de bruit.
3. Analyse Expérience Message
- Calculer la courbe IV pour un enregistrement individuel. Si l'enregistrement est à l'état stationnaire lorsque la fonction du bruit est appliquée, la courbe IV peut être créé en utilisant une partie l'état d'équilibre de l'enregistrement temporellement dehors de la plage de la fonction de bruit. Si l'enregistrement n'a pas été à l'état stationnaire, la fonction de bruit peut interférer avec le calcul de la courbe IV, donc un deuxième enregistrement doit être fait sans la fonction de bruit présent.
- Pour chaque étape de tension dans un enregistrement de calculer la transformée de Fourier rapide de la portion de l'enregistrement où la fonction de bruit a été inséré. Combinez la transformée de Fourier pour chaque étape de tension en amxn matrice, où m est le nombre de fréquences dans la FFT, et n est le nombre d'étapes de tension. Dans cette configuration, chaque rangée de la matrice représente l'amplitude d'une fréquence unique à tous les échelons de tension dans l'expérience.
- Pour chaque fréquence (c'est à dire chaque ligne de la matrice ci-dessus) corréler la ligne avec la courbe IV généré en 3.1 et enregistrer le coefficient de corrélation.
- Tracer la fréquence en fonction du coefficient de corrélation pour visualiser les fréquences dont hautement corrélée avec la courbe IV. Depuis la composante continue est contenue dans la première fréquence de la FFT, le coefficient de corrélation pour cette fréquence doit toujours être> 0,99.
4. Les résultats représentatifs:
Des mesures représentatives de tension de serrage sont indiqués pour une cellule modèle sans (figure 1A) et avec (figure 1B) une fonction de bruit inséré dans le protocole échelon de tension. La courbe IV a également été calculée pour la cellule de modèle (figure 1C). Pour chaque balayage, dans les enregistrements de la figure 1, la FFT a été calculé sur la période où la fonction de bruit a été inséré (voir encadré rouge dans les figures 1A, 1B). Figures 2A et 2B montrent la FFT calculée pour les enregistrements de la figure 1A et 1B, respectivement. Lors de l'inspection visuelle, la composante continue (en rouge) apparaît pour imiter la forme de la courbe IV. Sans la fonction de bruit, toutes les fréquences supérieures DC semblent avoir amplitudes proche de zéro (figure 2A). Lorsque la fonction de bruit est inséré, les fréquences entre 1 et 15 kHz ont des amplitudes visuellement perceptibles (figure 2B). La figure 3 montre le résultat de la corrélation des amplitudes de fréquences individuelles au cours de la série de mesures de tension contre la courbe IV. La figure 3A-C montre les coefficients de corrélation lorsque l'expérience a été faite dans des conditions de contrôle (pas de fonction de bruit) et avec des amplitudes de bruit de 50 et 100 mV, respectivement. Avis à tous les cas, la composante continue semble être en corrélation presque parfaite avec la courbe IV. En effet, pour tous les enregistrements, le coefficient de corrélation pour cette fréquence a été supérieure à 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, moyenne ± écart type). Quand nous regardons la figure 3A (conditions de contrôle), il n'ya pas de fréquences en dehors de la composante continue dont l'amplitude est corrélée de manière significative avec la courbe IV. Plus précisément, aucun de ces fréquences ont des coefficients de corrélation supérieur à 0,5. Lors de l'insertion de la fonction de l'amplitude du bruit le plus faible (50 mV), ces mêmes fréquences avaient encore les coefficients de corrélation inférieur à 0,5. Les coefficients de corrélation pour lesfréquences soi n'a pas non plus devenir supérieure à 0,5 lorsque l'amplitude du bruit a été augmenté à 100 mV.
. Figure 1 Recordings cellulaire Modèle: enregistrements pince de tension sont indiquées pour une cellule modèle sans (1A) et avec (1B) une fonction de bruit inclus dans le protocole échelon de tension. Pour la première et la dernière de 20 ms de chaque balayage, le potentiel a été maintenu à le potentiel de maintien (0 mV). Chaque étape de tension était de 80 ms de long, et la fonction de bruit a été inséré de 40 ms après le début de l'étape. La fonction de bruit avaient une durée de 30 ms et contient des fréquences entre 1 et 15 kHz. La tension était intensifié BOF, -150 à +50 mV par incréments de 5 mV. Une courbe IV de la cellule de modèle est également montré (1C). Pour faire des enregistrements plus facile à lire, que chaque coup cinquième a été inclus dans 1A et 1B, mais tous les balayages ont été inclus dans 1C.
Figure 2 FFT d'enregistrements:. La FFT a été calculé pour la portion de 30 ms de chaque balayage où la fonction de bruit doit être inséré (la zone délimitée par la boîte rouge dans les figures 1A, 1B). Figures 2A et 2B montrent la FFT calculée avec et sans la fonction de bruit, respectivement. Une fois encore, pour plus de clarté, seule la FFT de chaque balayage de cinquième est inclus dans le chiffre, mais tous les balayages ont été utilisées dans les calculs futurs.
. Figure 3 Corrélations Fréquence IV: Les résultats des corrélations entre la courbe IV d'un enregistrement et l'amplitude des fréquences individuelles au cours de la série de mesures de tension est affichée. Les figures 1A - 1C montrent le coefficient de corrélation pour des fréquences allant de 0 à 20 kHz, dans des conditions de contrôle, et en présence de 50 ou 100 mV fonctions de bruit, respectivement.
La figure 4 re-création de la courbe IV:. La courbe IV de la cellule du modèle (le même que la figure 1C) et l'ampleur des deux fréquences ont été superposées. La première fréquence est la composante continue (R = 0,995), et la seconde était une fréquence choisie au hasard avec une faible corrélation (R = 0,3212). Les amplitudes de fréquence ont été réduits à environ la même amplitude que la courbe IV.
Discussion
Il ya des obstacles techniques qui empêchent actuellement les chercheurs de mesurer plusieurs types de canaux ioniques simultanément avec l'intention de déterminer plus tard, combien de courant devrait être attribué à chaque type de canal. En raison de cette limitation, les canaux ioniques sont généralement étudiés individuellement en utilisant des techniques telles que pince potentiel de tension, courant, et l'action. 1 Pour étudier les types de canaux individuels, des systèmes d'expression hétérologues sont souvent utilisés. 2 Lorsque vous travaillez avec des cellules isolées à partir de tissus, tels que les cardiomyocytes , d'autres moyens doivent être utilisés pour bloquer les canaux ioniques différentes. Par exemple, les canaux sodiques peuvent être inactivés par une rampe de tension dépolarisants lente, 3 vers l'intérieur des canaux potassiques rectifiant peut être bloqué par BaCl2 extracellulaire, 4 et canaux calciques peut être bloquée en utilisant le vérapamil 5.
Une méthode utilisée qui surmonte partiellement cette limitation est de mesurer le flux de courant à travers deux canaux simultanément types, puis répéter la mesure après bloquant sélectivement un type de canal avec un agent approprié. Soustraction des deux mesures peuvent alors être utilisées pour estimer la quantité de courant attribuables au type de canal qui a été bloqué. 6 Toutefois, il existe deux principales limites à cette technique. Tout d'abord, les agents chimiques n'ont pas été identifiées qui peuvent bloquer sélectivement chaque canal ionique, et certains médicaments largement utilisés ont des interactions non spécifiques avec les types de canaux d'autres. 5,7 seconde, il ne peut pas être déterminée à partir de cette technique si un canal est modulée par un autre canal. Par exemple, l'expression hétérogènes de NAV 1.5 et 2.1 Kir a été montré dans les ventricules cochon de Guinée, et il a été suggéré que d'une relation synergique existe entre les deux canaux, tels que la hausse Kir 2.1 expression dans le ventricule droit déprime la vitesse de conduction. Présentement 8 , cela ne peut pas être vérifiée.
Dans cette étude, nous suggérons que la spectroscopie d'impédance peut être un outil utile pour étudier plusieurs types de canaux ioniques mesurés simultanément. Bien que la méthode présentée n'a jamais été utilisé à discerner les courants à partir de deux types de canaux mesurés simultanément, la spectroscopie d'impédance a été utilisée pour étudier un certain nombre d'autres aspects de la fonction des canaux ioniques. Goodman et Art montré en utilisant des cellules auditives de tortues de cheveux que les protocoles de pince de courant peut être modifiée pour accorder une cellule pour différentes fréquences, et les oscillations dans le potentiel transmembranaire est due à une interaction entre un intérieur rectifier canal K + et d'un canal Ca 2 +. 9 Han et Frazier a démontré que l'impédance peut être mesurée dans une cellule unique sur un large éventail de fréquences (100 Hz à 5 MHz), et l'augmentation de l'impédance observée lorsque K + ou Ca 2 + canaux ont été bloqués pourrait être un moyen simple de détecter les blocs de canaux en haute écrans de drogue débit. Hayashi et 10 ont utilisé la conductance Fishman complexe à étudier les propriétés cinétiques d'un intérieur rectifier canal K +. 11 D'autres groupes ont inséré une seule fréquence dans le protocole de voltage des types de canaux différents et a montré que la réponse en fréquence observée d'accord avec la réponse attendue pour certaines fréquences mais pas les autres. 12,13 Millonas et Hanck suggéré la raison certaines fréquences ne produisent pas la réponse attendue est la présence de constantes de vitesse multiples dans le modèle de Markov. 12 Des études comme celles-ci, ainsi que d'autres, ont démontré qu'il ya des cas où des courants ioniques mesurés à partir des canaux ioniques tout en utilisant la spectroscopie d'impédance ne sont pas d'accord avec la réponse en fréquence théorique. Ce n'est pas une préoccupation dans cette étude parce que le but de la méthode dans cette étude est d'identifier des fréquences qui sont en corrélation avec l'amplitude de courant indépendante du hypothèses sous-jacentes du circuit de la membrane électrique. Furtheremore, l'amplitude du courant est calculé à partir de portions des enregistrements qui n'ont pas de fonctions de bruit inséré dans eux. Un certain nombre d'autres études également des modèles présents sur de nombreux canaux ioniques présentant de nombreux États la conduite et non-conduction ensemble avec leurs constantes de vitesse propres. 14,15,16 Thompson et al ont montré que le filtre de sélectivité du canal KcsA a différents sites de liaison pour Na +, Li + et K +, et les coûts énergétiques de passer d'un site de liaison à l'autre comme un bouge d'ions à travers le filtre de sélectivité est ce qui rend le canal préférentiellement conduite ions K + à travers ses pores. 17 Dans ce papier nous avons inséré une gamme de fréquences (fonction de bruit) dans un protocole échelon de tension et cherché des fréquences dont l'amplitude hautement corrélée avec l'amplitude globale actuelle. Depuis des preuves solides a été présenté suggérant constantes de vitesse multiples jouent un rôle dans la conduction des ions à travers différent canaux, l'introduction des fréquences associées à ces constantes de vitesse peut causer certaines fréquences de résonance ou fortement corrélée avec l'amplitude du courant, ce qui n'aurait pas autrement. La technique démontrée dans cette étude est réalisée sur une cellule du modèle, qui est un circuit RC parallèle qui est habituellement utilisé pour tester les circuits voltage et de l'équipement d'acquisition. Il n'est pas prévu que toutes les fréquences en dehors DC serait en corrélation avec l'ampleur actuelle, et cela est montré dans nos données. Nous montrons aussi que l'ajout de la fonction de bruit ne cause aucun des fréquences à très corrélée avec l'amplitude du courant. Ces deux constatations sont importantes parce qu'elles montrent que l'équipement de mesure et de la fonction du bruit ne cause aucun d'eux-mêmes fréquences à corréler avec l'amplitude du courant. Lorsque les études futures effectuer des mesures en utilisant des membranes contenant les canaux ioniques, il est prévu que, selon le canal utilisé, les fréquences qui correspondent aux constantes de vitesse dans le filtre de sélectivité ou, éventuellement, le pore va influencer la réponse en fréquence du canal et affecter les fréquences qui ont une grande ou de faible corrélation avec l'amplitude du courant.
Puisque cette méthode est une nouvelle technique pour étudier les canaux ioniques, il ya un certain nombre de directions futures études pourraient suivre. D'abord, la technique devrait être utilisée pour caractériser la réponse en fréquence des canaux spécifiques isolées. D'autres travaux doivent également être fait pour calibrer les amplitudes de fréquence pour les amplitudes actuelles. Une fois de multiples canaux sont caractérisés individuellement, plusieurs types de canaux doivent être mesurées simultanément. La technique pourrait aussi être adapté pour une utilisation dans la pince du potentiel d'action, pince de courant, et les études de stimulation de champ. Bien que ce soit une nouvelle technique, il montre ce que peut être un moyen puissant de faire des mesures électrophysiologiques qui n'étaient précédemment pas possible et de fournir de nouvelles perspectives intéressantes dans le rôle physiologique des canaux ioniques.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health numéro de la subvention R21-01-HL094828 décerné au Dr Poelzing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA |
| Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA |
| Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA |
| Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA |
| 16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA |
| Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |
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