Peptidi dalla libreria phage display modulare l'espressione genica nelle cellule mesenchimali e potenziare Osteogenesi in difetti ossei Unicortical

Summary

Una libreria di phage display è stato utilizzato per identificare sequenze peptidiche che l'osso di destinazione. L'obiettivo era quello di indagare l'effetto di questi peptidi sulla differenziazione delle cellule mesenchimali e di determinare il loro effetto sulla rigenerazione ossea.

Abstract

Due peptidi sintetici romanzo di accelerare la formazione delle ossa e può essere consegnata usando una matrice di collagene. Lo scopo di questo studio era di indagare gli effetti sulla riparazione ossea in un modello difetto unicortical. Il trattamento di cellule mesenchimali prodotto un aumento dell'attività della fosfatasi alcalina, ha mostrato la formazione di noduli da parte delle cellule, e aumentato l'espressione di geni per Runx2, osterix, osso sialoprotein ed osteocalcina. Una spugna imbevuta di collagene con peptide promosso riparazione di difetti ossei, mentre il controllo è meno efficace. I risultati di questo studio hanno dimostrato che le cellule mesenchimali trattati con peptide differenziarsi in vitro verso osteogenesi, e, che i peptidi consegnato in vivo, utilizzando una spugna di collagene promuovere la riparazione di difetti unicortical.

Protocol

1. Biopanning in vivo per isolare i fagi che le ossa target a lungo

Fago DNA è stato sequenziato e peptidi con una sequenza corrispondente sono stati sintetizzati. Peptidi sono stati sintetizzati con Gly-Gly-Gly-Ser-lisina linker (il linker è necessario per due cromofori fluorescenti che aiutano a tenere traccia / trace i peptidi).

1. Una settimana 10 vecchi Balb / c del mouse è stato anestetizzato, il cuore è stato esposto.
2. I-12 Ph.D Phage Display peptide biblioteca kit (New England Biolabs, Beverly, MA) è stato utilizzato per in vivo biopanning, 10 x 1010 pfu, e iniettato nel cuore.
3. Dopo circa 5 minuti, il mouse è stato eutanasia. I femori sono stati esposti e sezionati, le estremità dei femori sono stati tagliati, e il midollo osseo è stato rimosso.
4. All'interno e all'esterno del femore sinistro sono stati sciacquati 10 volte con PBS, e il femore è stato aggiunto al ER2537 batteri (di cui come non eluiti fago, passare al punto 6).
5. Il canale endomidollare del femore destro è stato lavato con 2% secchi latte scremato in una siringa con un ago da 21 gauge dieci volte per rimuovere non legato fago. Fago Bound è stato eluito dalla canale endomidollare con tampone glicina-HCl pH 2.2, neutralizzato con 1M Tris, aggiunto al ER2537 batteri, e colto per 4,5 ore per amplificare il fago (di seguito eluita).
6. I batteri sono stati rimossi per sedimentazione centrifuga per 10 min a 4 ° C era precipitata, e fago notte a 4 ° C con l'aggiunta di PEG / NaCl soluzione. Il fago è stato raccolto per centrifugazione e sospesi e precipitato due volte con l'aggiunta di 1 / 6 del volume di PEG / NaCl. Il pellet finale è stato risospeso in TBS con il 0,02% NaN3.
7. Il eluati amplificata sia dal fagi eluiti e non eluiti sono stati iniettati in topi separati, e fago è stato isolato come sopra. Solo il femore sinistro è stata rimossa dal mouse che è stato iniettato con la non-eluiti fago, e il femore piazzata direttamente sul batteri (vedi punto 4). Il mouse fagi eluiti è stato isolato solo dal femore destro e il fago rilasciato da HCl-glicina tampone prima di aggiungere ai batteri (vedi punto 5).
8. Questa procedura in biopanning vivo è stata ripetuta tre volte prima di sequenziamento del DNA utilizzando-98 Primer (fornito con il kit phage display).
9. Fago pool sono stati amplificati in colture batteriche, purificato, quantificato e poi sono state iniettate in un topo quarto. Sequenziamento è stato ripetuto.
10. Per dimostrare la specificità del peptide di ossa e midollo, fagi eluiti dai reni e fegato sono stati analizzati come descritto sopra. In tutti i quattro giri c'era piccola quantità di fagi trova a questi organi (meno del 10%).
11. Peptidi sono stati sintetizzati con una Gly-Gly-Gly-Ser-lys sequenza, con e senza biotina da utilizzare per la colorazione delle cellule e dei tessuti, così come per il lavoro nel vivo.

2. Colture Cellulari mesenchimali per esperimenti osteogenico Differenziamento Cellulare

1. Una linea cellulare clonata topo pluripotenti stroma del midollo osseo (D1) isolato nel nostro laboratorio ¹ è stato usato per esperimenti in vitro. Le cellule sono state coltivate in mezzo modificato essenziale Dulbecco, DMEM, glucosio basso (cat Gibco # 11885-084) supplementato con 10% siero fetale bovino (Gibco cat # 16000-044), cinquanta milligrammi di ascorbato di sodio per millilitro (Sigma cat # A7631 ), e 100 U / mL di penicillina G e 100 mg / ml di streptomicina (cat Gibco # 15140-122).
2. Le culture sono state mantenute a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ incubatori a camicia d'acqua e sotto-cellule sono state coltivate fino a circa il 90% confluenti.
3. Cellule sono state trypsinized, centrifugati a pellet, contati, e seminate ad una concentrazione di 5x10 ³ celle / cm ² in coltura trattata Plasticware.

3. Colorazione peptide di cellule in coltura e tessuti

1. D1 o cellule del midollo sono stati placcati in camera di fibronectina o gelatina rivestite e diapositive contenenti DMEM e il 10% di siero fetale bovino per 24 ore.
2. Le cellule sono state lavate con PBS. Cellule / tessuti sono stati fissati con paraformaldeide 4% per 30 minuti
3. Aldeide in eccesso sono stati bloccati con glicina 0,5 M (pH 7,5) per 10 minuti.
4. Recettori endogeni avidina e biotina sulla superficie cellulare è stata bloccata con l'aggiunta del 5% BSA soluzione + Avidina blocco per 1 ora, una volta sciacquate con PBS per 5 minuti, poi bloccato con 5% di BSA soluzione + Biotina blocco per 1 ora.
5. Di 100 mM biotinilato L7 e peptidi R1 sono stati aggiunti ai pozzetti per 30 minuti.
6. Le cellule sono state lavate tre volte con PBS per 5 minuti e 'stato aggiunto e di ogni diluizione di 1:1000 Farina streptavidina Alexa e incubate al buio per 30 minuti.
7. Le cellule sono state lavate e coprioggetto montato con i media Vectashield montaggio ed esaminato al microscopio a fluorescenza.

4. Fosfatasi alcalina saggio di attività

1. Fosfatasi alcalina csaggio olorimetric è stata eseguita su monostrati utilizzando un kit di fosfatasi alcalina (BioRad), come raccomandato dal produttore.
2. Cellule D1 sono stati placcati con una densità 5 x 10 ³ cellule / cm ² su 6-pozzetti cultura e trattati con R1 peptide, l'attività di ALP è stata quantificata in giorni 4, 8, 12, 16 e 20.
3. Per preparare il lisati di cellule, strati di cellule sono state lavate tre volte con tampone PBS e poi raschiato in PBS seguita da sonicazione e centrifugazione per rimuovere i detriti cellulari.
4. Volumi uguali di lisato (100 mL) è stato poi mescolato con 100 l di substrato preparati al momento colorimetrico paranitrofenil-fosfato, e incubate a 37 ° C per 30 minuti.
5. La reazione enzimatica è stata interrotta aggiungendo 100 ml di NaOH 0,2 N soluzioni. Attività di ALP è stata misurata a 405 nm con Lettore ELISA (Bio-Rad).
6. Concentrazione di proteine ​​del lisati cellulari è stata misurata con un kit di analisi delle proteine ​​BioRad, AP e l'attività è stata poi espressa come para-nitrofenolo prodotto in nmol / min / mg di proteina.
7. Attività di ALP è stato calcolato in base alle specifiche del costruttore (Sigma, Inc.).
8. Unità di attività ALP sono stati normalizzati ai milligrammi di proteine ​​totali con test BCA (Pierce, Rockford, IL) del lisato cellulare.

5. Differenziazione delle cellule mesenchimali con L7 e R1

1. Subconfluent mesenchimali (D1), le cellule sono state coltivate a circa il 90% di confluenza e trattati con 5nm L7 e peptide R1.
2. Le cellule sono state raccolte a 0,5, 2, 6, 24 e 48 ore, e l'RNA è stato preparato utilizzando il kit Qiagen RNeasy utilizzando le istruzioni del produttore.
3. Trascrittasi inversa (RT) reazioni sono state ricotto (37 ° C, 10 minuti) e seguita da sintesi del primo filamento di cDNA (42 ° C, 30 minuti) e l'inattivazione di calore (95 ° C per 5 minuti). Il cDNA risultante era conservati congelati (-70 ° C) fino analizzati mediante PCR in tempo reale.
4. Real Time PCR è stata effettuata utilizzando il QuantiTect SYBR Green PCR kit (Qiagen). Le reazioni sono state effettuate con 25 ml di maestro SYBR Green mix kit e in avanti e primer reverse (300 nmol / L) di osso geni specifici, ad esempio per Runx2, Osterix, osteocalcina, sialoprotein Bone, e geni percorso wnt come b-catenina, LRP6, 5a Wnt, 7b, 10 ter, DKK1 e OPG e RANKL (vedi tabella 1).
5. Il 3 ml di campione di cDNA è stato aggiunto alla miscela di reazione finale non diluito dalla reazione RT. Il 96-e real-time PCR formato comprendeva sei 10-diluizioni in duplice copia degli standard di DNA plasmidico. I pozzetti della piastra sono stati sigillati con coperchi adesivo ottico (BioRad) e centrifugati a bassa velocità (300 g, 5 minuti) per garantire la completa miscelazione.
6. Ogni campione è stato analizzato almeno in doppio con lo strumento iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. I protocolli di PCR utilizzato attivazione coinvolti di DNA polimerasi AmpliTaq oro seguita da 40 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 secondi, rispettivamente temperatura di ricottura per 30 secondi, e l'estensione a 72 ° C per 30 secondi. Il numero soglia PCR ciclo (CT) per ogni campione è stato calcolato nel punto in cui la fluorescenza superato il limite di soglia. Il limite di soglia è stata fissata lungo la fase logaritmica lineare delle curve di fluorescenza a 10-20 deviazioni standard (SD) al di sopra della media di fluorescenza di fondo. Equazioni curva standard sono stati calcolati mediante analisi di regressione di media CT contro il log10 del cDNA relativo al totale presente RNA. Espressione relativa dei geni bersaglio era normalizzata a 18S geni specifici per l'osso e la b-actina è stata usata per gene pathway Wnt.

6. In preparazione vivo di Gelfoam Composite

1. Utilizzando routine asettico, cilindri Gelfoam (Pharmacia & Upjohn cat # 09-0353-01), 3 mm di diametro di 8 mm di lunghezza, sono stati creati utilizzando lo strumento di auto-progettato.
2. Ventiquattro ore prima dell'intervento chirurgico, i cilindri erano Gelfoam ammollo-caricato sia con L7 o R1 peptide (20 mM in PBS) o tampone PBS senza peptide. I cilindri Gelfoam sono stati trasferiti in sterili 12 piatti della cultura e ben conservato durante la notte a -4 ° C.
3. Al momento dell'intervento, il composito Gelfoam in capsule di Petri sono stati spostati fuori dal frigorifero e mettere in ghiaccio fino chirurgia.

7. Difetti ossei

1. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del sistema sanitario presso l'Università della Virginia, prima di essere eseguiti. Dieci nove mesi di età adulta di sesso maschile singenici ratti Fischer 344 (350-400 g) sono stati intraperitoneale anestetizzati con una miscela di ketamina (50 g per grammo di peso corporeo) e xilazina (5 g per grammo di peso corporeo).
2. Un approccio bilaterale chirurgico è stato fatto per l'aspetto antero-mediale della tibia. Ratti a questa età o più anziani mostrano un aumento insignificante in sezione trasversale, l'area corticale ossea, la massa ossea, la densità ossea, e la lunghezza assiale del anteromedial aspetto della tibia. Un grande difetto oblungo unicortical è stato creato che misurava 3 mm di larghezza di 8 mm di lunghezza con una bava pneumatico (drill ad alta velocità Sala; Zimmer) sotto irrigazione salina.
3. Il difetto osseo è stato trattato con Gelfoam con o senza peptidi. Tutti i ponteggi impiantato, misura 3 mm di larghezza di 8 mm di lunghezza per 1,5 mm di profondità, sono stati inseriti con lievi colpetti. Nessun esterno o interno dispositivi di fissazione degli arti sono stati utilizzati dopo l'intervento, e gli animali permesso di deambulare senza limitazioni subito dopo l'intervento.

8. Istologia e morfometria

Rigenerazione ossea è stata valutata dalla morfologia lordo e immagini digitali scattate.

1. I ratti sono stati eutanasia e le tibie sono stati raccolti a 3, 5, e 12 settimane di quantificare la quantità di osso nuovo generato in risposta al danno.
2. Dopo aver controllato attentamente il difetto osseo, la tibia raccolti sono stati fissati nel 10% formalina tamponata neutra, decalcificata in RDO rapida decalcificante per 72 ore, poi elaborati di routine e inclusi in paraffina e sezionati longitudinalmente.
3. Rigenerazione ossea è stata valutata al lordo e la luce esame microscopico.
4. Dieci animali sono stati utilizzati per ogni condizione (per esempio, difetto vuoto, Gelfoam da solo, e Gelfoam più R1 peptide). Il difetto 8 millimetri unicortical è stato rappresentato in tutto ~ 40 sezioni di tessuto, ognuno dei quali è stato di 8 micron di spessore. Di questi 40 sezioni, abbiamo usato un minimo di 6 sezioni per quantificare la quantità di osso nuovo.
5. Tutte le sezioni di tessuto sono state colorate con ematossilina / eosina (H & E), che le etichette matrice osteoide.
6. Tutte le diapositive sono stati valutati al microscopio.

9. Osso di riparazione

Panoramica

Riparazione ossea è chiaramente una zona molto importante di considerazione nel campo della rigenerazione dei tessuti muscolo-scheletrico. I peptidi che l'osso obiettivo potrebbe essere assai utile nella pratica della chirurgia ortopedica, in particolare l'uso di protesi che possono essere interiore per anni se non decenni. Le proprietà biomimetici di fattori tropico osso potrebbe creare un passo tecnologico in avanti nel campo della ingegneria dei tessuti, così come per la chirurgia protesica delle ossa. L'inclusione di osso targeting fattori in polimeri sintetici o naturali possono aiutare specificità di adesione delle cellule, quindi scavenging cellule endogene all'interno dei tessuti che sono in fase di riparazione e rigenerazione. Un ulteriore obiettivo era quello di stabilire se il nostro unico osso targeting peptidi identificati da biopanning in vivo di una libreria di phage display si legano alle cellule isolate da ossa e midollo osseo, e hanno la capacità di modulare l'osteogenesi in vitro e in vivo la rigenerazione ossea.

Nei nostri esperimenti, abbiamo consegnato i peptidi in difetti femorali in ratti usando matrici polimeriche naturali e sintetiche e rigenerazione ossea esaminato da istologia, biochimica, l'espressione genica, micro-CT e biomeccanica per chiarire i dettagli di attività peptide sulla rigenerazione ossea. Ulteriore sviluppo di questo approccio può portare alla scoperta e lo sviluppo di composti biologicamente attivi che l'osso di destinazione e potenziare la riparazione attraverso meccanismi che sono ben caratterizzati biologicamente a livello cellulare e molecolare.

Colorazione

I peptidi sono stati sintetizzati con biotina-etichette per determinare vincolanti e la localizzazione di cellule mesenchimali. Fluoresceina isotiocianato (FITC)-avidina marcato è stato utilizzato per localizzare microscopicamente il legame di peptidi su cellule coltivate in vitro. I peptidi si legano alle cellule mesenchimali nella cultura e per ossa e midollo nelle sezioni di tessuto costola del mouse in vitro (Figura 1).

Von Kossa colorazione

Una cellula mesenchimale (D1) è stato clonato dal midollo osseo e utilizzato per determinare l'effetto dei peptidi osteogenico su cellule in vitro. Le cellule sono state trattate con peptidi L7 e R1 per determinare cambiamenti nella morfologia cellulare e l'espressione genica. Al giorno 4, le cellule avevano iniziato ad aggregarsi, e gli aggregati allargata con il tempo di formare noduli, un modello di comportamento delle cellule simili alle cellule ossee in coltura (Figura 2).

L'aggiunta di peptide L7 o R1 per la colorazione delle cellule migliore delle culture con von Kossa. Le cellule sono state poi trattate con diverse concentrazioni di peptide L7 o R1 per fino a 16 giorni in coltura. E 'stato stabilito che il 5 peptide nM è stato più efficace in vitro. Fosfatasi alcalina nelle culture che sono stati trattati con il peptide è aumentato da tra 2 e 3,5 volte. L'aumento piega dipendeva dalla concentrazione di peptide e il tempo di trattamento nella cultura.

PCR in tempo reale

Cellule trattate con L7 e peptidi R1 sono stati analizzati utilizzando in tempo reale PCR per l'espressione genica per due fattori noti cellulare ossea trascrizione (Osterix e Runx2) e tre proteine ​​della matrice ossea (osso sialoprotein, osteocalcina e collagene di tipo I). Il trattamento con R1 ha mostrato aumenti di Osterix e l'espressione genica Runx2. Collagene di tipo 1 l'espressione genica è rimasta invariata. Il trattamento con L7 ha mostrato un aumento di espressione genica BSP e osteocalcina, nonché espressione del gene del collagene di tipo I. Questo dimostra che entrambi i peptidi hanno un effetto sui geni che sono collegati alla comparsa e la progressione della osteogenesi in colture di cellule mesenchimali.

Il trattamento delle colture cellulari in vitro con la R1 peptidi e L7 ha rivelato un effetto anabolizzante relativi alla formazione del tessuto osseo utilizzando cellule mesenchimali. Un aumento del rapporto tra osteoprotegerina a RANKL indica una diminuzione del reclutamento delle cellule ossee riassorbimento che sono noti come osteoclasti. Il trattamento di cellule con i peptidi porta anche ad un aumento dell'espressione dei geni che sono associati con la formazione ossea e riduce i fattori che inibiscono l'osteogenesi.

Istologia

Per determinare la quantità di osso, abbiamo esposto le fette di osso alla luce μLtraviolet producendo così autofluorescenza. Questo fornisce un maggiore contrasto tra osso e osso non tessuti a fini di quantificazione ^2. Le sezioni sono stati fotografati utilizzando sia campo chiaro e luce UV (Figura 3) una Nikon e ai raggi UV da un sistema di imaging digitale Nikon allo stesso ingrandimento (x10 obiettivo). Le immagini risultanti sono stati analizzati con il digitale Metavue software di imaging (Molecular Devices). Abbiamo scelto un fisso, un'area rettangolare di interesse (ROI) che conteneva gli 8 difetto unicortical mm. Il sito del pregiudizio è stato sempre rappresentato all'interno di questa ROI manualmente posizionando il box nella posizione corretta per ogni immagine. I pixel H & E-positivi sono stati parzialmente automatizzato con lo strumento bacchetta magica insieme ad una tolleranza del colore. Questa impostazione ha portato la tolleranza in pixel evidenziato con una gamma di verde che corrispondeva esattamente con l'aspetto istologico del tessuto osseo in H & E-macchiato sezioni. Il numero totale di H & E-positivi pixel per ogni sezione è stato registrato. I conteggi dei pixel da singole sezioni sono state in media per ogni campione della tibia e le differenze all'interno e tra i gruppi di trattamento sono stati calcolati sulla base di queste medie. Le aree per tutti i campioni sono stati poi confrontati in base alla quantità di nuovo osso corticale (Figura 4).

La presenza di osso in sezioni è stato quantificato per determinare la riparazione ossea nei difetti trattati con il peptide Gelfoam + rispetto a Gelfoam solo. Difetti che erano pieni di Gelfoam + R1 peptide ha mostrato il maggior numero di riparazione corticale con un 10, 7 e aumento di 2 volte a 3, 5, 12 settimane, rispettivamente. Le differenze nella riparazione ossea corticale nel Gelfoam + peptide rispetto Gelfoam monoterapia, sono stati più evidenti a 3 e 5 settimane dimostrano che il peptide favorisce la rigenerazione ossea corticale (Figura 5).

10. Effetto anabolizzante di Peptidi osteogenico

L'OPG / RANKL rapporto è superiore al rapporto RANKL / OPG, il che suggerisce che i peptidi possono avere un effetto diretto sugli osteoblasti e regolano il riassorbimento osseo.

Peptidi sintetici possono avere vantaggi rispetto alle molecole più grandi come la velocità di preparazione, stabilità molecolare, durata di conservazione a lungo e applicazioni potenzialmente terapeutiche. Notevoli progressi sono stati fatti nel tentativo di modulare la perdita di tessuto osseo e di rigenerazione da citochine controllo e fattori di crescita. Questi peptidi osteotropic possono offrire interessanti alternative alle terapie attuali che stimolano anabolismo osseo e la rigenerazione ossea.

Figura 1. Peptide vincolante al midollo osseo e nella sezione di tessuto costola topo in vitro.

Figura 2. Cellule mesenchimali (D1) formano noduli dopo il trattamento con il peptide.

Figura 3. Istologia della riparazione ossea mediante peptidi osteogenico, L7 e R1.

Sezioni Bone Figura 4. Colorate con H & E ai raggi UV che provoca autofluorescenza. Questo fornisce un maggiore contrasto tra osso e non-tessuti ossei per scopi quantificazione.

Figura 5. Quantificazione di osso in sezioni esame istologico ha mostrato il maggior numero di riparazione corticale era a 5 settimane condi 10 volte il cambiamento, 7 e 2 volte a 3 e 5 settimane dimostrano che il peptide favorisce la rigenerazione ossea corticale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S