ファージディスプレイライブラリーからのペプチドは、間葉系細胞における遺伝子発現を調整するとUnicortical骨欠損に骨形成を増強する

Summary

ファージディスプレイライブラリーは、ターゲットの骨そのペプチド配列を同定するために使用された。目的は、間葉系細胞の分化に対するこれらのペプチドの効果を調査すると骨再生への影響を決定することでした。

Abstract

二つの新規な合成ペプチドは、骨形成を促進し、コラーゲンマトリックスを使用して配信することができます。本研究の目的は、unicortical欠損モデルにおける骨の修復に及ぼす影響を調査することであった。間葉系細胞の治療は、アルカリホスファターゼ活性の上昇を生産細胞による小結節形成を示した、とRunx2、osterix、骨シアロタンパク質、およびオステオカルシンの遺伝子の発現を増加させた。コントロールがあまり効果があったのに対し、コラーゲンスポンジは、骨欠損のペプチドを促進修理に浸漬。この研究の結果は 、in vitro でのペプチドで処置された間葉系細胞がコラーゲンスポンジを用いた in vivo で配信されたペプチドがunicortical欠陥の修復を促進すること、骨形成に向けて差別化、およびことを示した。

Protocol

（1） 生体内ではファージを単離するためのバイオパニングそのターゲット長骨

ファージDNAの配列を決定したと、対応する配列を有するペプチドを合成した。ペプチドをGly - Glyは、グリシン- SER -リジンリンカー（リンカーは、ペプチドを追跡/トレースするのに役立つカップル蛍光発色団に必要とされる）を合成した。

1. 10週齢のBALB / cマウスに麻酔をした、心臓を露出した。
2. 博士- 12ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（New England Biolabs社、ビバリー、MA）を10 × 1010 PFU、 生体バイオパニングのために使用され、心臓に注入した。
3. 約5分後、マウスを安楽死された。大腿骨が露出し、解剖し、大腿骨の両端を切断し、骨髄を除去した。
4. 左大腿骨の内側と外側をPBSで10回洗浄した、と大腿骨がER2537細菌に追加された（非溶出したファージと呼ばれる、手順6に進みます）。
5. 右大腿骨の骨髄内管は、非結合ファージを除去するために21ゲージ針を注射器で2％乾燥スキムミルクで10回洗浄した。結合したファージは、塩酸 - グリシン緩衝液2.2、1Mトリスで中和付き髄内管から溶出ER2537細菌に加えて、ファージを（溶出と呼ばれる）を増幅するために4.5時間培養した。
6. 細菌は、° C、およびファージがPEG / NaCl溶液を添加することにより4℃で一晩沈殿して、4で10分間遠心沈降により除去した。ファージは、遠心分離により回収し、懸濁させ、PEG / NaClを1 / 6の量を添加することによって二回沈殿させた。最終ペレットを、0.02％NaN3をTBSに再懸濁させた。
7. 溶出および非溶出ファージの両方から増幅された溶出液を別々のマウスに注入した、とファージは、上記のように単離された。唯一の左大腿骨は、非溶出したファージを注射したマウスから除去し、大腿骨は、（上記のステップ4を参照）細菌に直接配置。溶出されたファージのマウスは、右大腿骨と（上記のステップ5を参照）細菌に添加する前に、塩酸 - グリシン緩衝液によって解放ファージから単離された。
8. これは、in vivoでのバイオパニングの手順でプライマー（ファージディスプレイキットに付属）- 98を使用してDNAの塩基配列決定の前に3回繰り返した。
9. プールされたファージは、細菌培養で増幅精製し、定量し、4番目のマウスに注入されたていた。シークエンシングを繰り返した。
10. 骨と骨髄にペプチド特異性を示すために、ファージは、腎臓から溶出し、上述のように肝臓を分析した。すべての4つのラウンドでは、これらの器官（10％未満）に位置するファージのマイナーな量があった。
11. ペプチドをGly - Glyは、グリシン- SER - Lysのシーケンスを持つ、とし、ビオチンを細胞や組織染色のためだけでなく、 生体内での作業のために使用されることなく合成した。

2。骨原性細胞の分化実験のための間葉系細胞培養

1. 私たちの研究室¹で単離されたクローン化マウス多能性骨髄基質（D1）細胞株はin vitroでの実験に用いた。細胞は、ダルベッコ改変必須培地、DMEM、10％ウシ胎児血清（ギブコの猫＃16000から044）を添加した低グルコース（Gibco社の猫＃11885から084）、ミリリットル当たりアスコルビン酸ナトリウム（シグマ猫＃A7631五十ミリグラムで培養し、 ）、および100 U / mlペニシリンGおよび100mgの/ mlのストレプトマイシン（ギブコの猫＃15140から122）。
2. 細胞が約90％コンフルエントになるまで培養物を37℃、5％CO ₂水ジャケットインキュベーターや継代培養の加湿雰囲気下でCに維持した。
3. 細胞をトリプシン処理し、ペレットを遠心分離し、カウント、およびプラスチック容器を扱う組織培養で5 × 10 ³細胞/ cm ²の濃度で播種した。

3。培養細胞や組織のためのペプチド染色

1. D1または骨髄細胞は、フィブロネクチン又はゼラチンコートしたチャンバーは、よく24時間DMEM、10％ウシ胎児血清を含むスライド上に播いた。
2. 細胞をPBSで洗浄した。細胞/組織は、30分間、4％パラホルムアルデヒドで固定した
3. 過剰なアルデヒドを10分間、0.5 Mグリシンを（pH7.5）を用いてブロックした。
4. 細胞表面上の内因性アビジンとビオチン受容体は1時間5％BSA +アビジンブロッキング溶液を添加することによりブロックされ、その後1時間5％BSA +ビオチンブロッキング溶液でブロッキング5分間、PBSで一回すすいだ。
5. その後、L7とR1ペプチドをビオチン化100μM、30分間ウェルに添加した。
6. 細胞を5分間ずつとアレクサ小麦粉ストレプトアビジンの1:1000希釈のためにPBSで3回洗浄し、30分間暗所で追加してインキュベートした。
7. 細胞を洗浄し、カバースリップはvectashieldマウントメディアをマウントし、蛍光顕微鏡下で観察した。

4。アルカリホスファターゼ活性アッセイ

1. アルカリホスファターゼColorimetricアッセイは、メーカーが推奨するアルカリホスファターゼキット（BioRad）を用いて単層上で実施した。
2. D1の細胞が× 10 ³細胞/ cm ^2、6ウェル培養プレート上で密度5で播種し、R1ペプチドで処理した、ALP活性は4日目、8、12、16および20で定量した。
3. 細胞ライセートを調製するために、細胞層をPBS緩衝液で3回洗浄し、次いでPBSにかき集めた細胞残渣を除去するために超音波処理と遠心分離した。
4. ライセート（100μL）の等容量は、用時調製した発色基質液100μLパラ - ニトロフェニルリン酸と混合し、37℃でインキュベートした30分間。
5. 酵素反応は、0.2 N NaOH溶液100μLを加えることにより停止されました。 ALP活性は、ELISAリーダー（Bio - Rad）を用いて405nmで測定した。
6. 細胞ライセートのタンパク質濃度を、BioRadタンパク質アッセイキットで測定した、とAP活性は、タンパク質のnmol /分/ mgで生成したパラニトロフェノールのように表現された。
7. ALP活性は、製造業者の仕様書（シグマ社）に従って算出した。
8. ALP活性の単位は、細胞溶解液のBCAアッセイ（Pierce、イリノイ州ロックフォード）と総タンパク質含有量のミリグラムに標準化した。

5。 L7とR1を使用して間葉系細胞の分化

1. サブコン間葉系（D1）細胞がコンフルエントに約90％にまで拡大し、5nmのL7とR1のペプチドで処理した。
2. 細胞を0.5、2、6、24および48時間で回収し、RNAを、メーカーの指示を使用して、キアゲンをRNeasyキットを用いて調製した。
3. 逆転写酵素（RT）反応をアニーリング（37℃、10分）と第一鎖cDNA合成（42℃、30分）と熱不活化（5分間95℃）が行われた。得られたcDNAをリアルタイムPCRで分析するまで（-70℃）凍結保存した。
4. リアルタイムPCRはのQuantiTect SYBRグリーンPCRキット（キアゲン）を用いて行った。反応は、例えば、Runx2は、Osterix、オステオカルシン、骨シアロタンパク、およびそのようなB -カテニンなど、Wnt経路の遺伝子のための骨特異的な遺伝子の25 SYBRグリーンキットマスターミックスのμLとフォワードプライマーとリバースプライマー（300 nmolの/ L）を用いて行ったLRP6、Wntシグナル5aは、図7b、10bは、DKK1とOPGとRANKL（表1参照）。
5. cDNAサンプル3μlのRT反応液から希釈せず、最終的な反応混合物に添加した。 96ウェルリアルタイムPCRの形式は、プラスミドDNAの規格の重複で6個の10倍希釈液が含まれています。プレートのウェルを光学接着剤のカバー（BioRad社）で密封し、完全な混合を確実にするために、低速（300 g、5分間）で遠心分離した。
6. 各サンプルは少なくともiCycler器（バイオラッドラボラトリーズ、ヘラクレス、CA）と二連で分析した。
7. PCRのプロトコールは、94℃で変性を40サイクルが続くのAmpliTaqゴールドのDNAポリメラーゼの関与する活性を用い℃30秒、30秒間、72℃で30秒、および拡張子のそれぞれのアニーリング温度。各サンプルのPCR閾値サイクル数（CT）は、蛍光がしきい値の制限を超えた時点で計算した。しきい値の制限は、平均的なバックグラウンドの蛍光上記10から20の標準偏差（SDS）での蛍光曲線の線形対数増殖期に沿って修正されました。標準曲線の方程式が存在する総RNAに対するcDNAの相対的なのlog10の対平均CTの回帰分析により算出した。標的遺伝子の相対発現はWnt経路の遺伝子のために使用された骨特定の遺伝子とβ-アクチンのための18Sに標準化した。

6 Gelfoamコンポジットのin vivoでの準備で

1. 無菌ルーチンを使用して、gelfoamシリンダー（ファルマシア＆アップジョン猫＃09-0353-01）、長さが8 mmで直径3mmは、自己設計されて楽器を使用して作成されました。
2. 二十四時間の手術の前に、gelfoamシリンダーであったソーク - ロードされたL7またはペプチドなしR1ペプチド（PBSで20μM）またはPBS緩衝液のいずれかで。 gelfoamのシリンダーは、滅菌12ウェル培養皿に移して4℃で一晩保存した。
3. 手術の時点で、培養皿でgelfoam複合材料は、冷蔵庫の外に移動され、手術するまで氷上に置く。

7。骨欠損

1. すべての動物の手続きは、バージニア大学ヘルスシステムの動物実験委員会、前に実行されるために承認された。十累計歳の成人同系の雄のFischer 344ラット（350〜400グラム）は、ケタミン（グラム体重50 g）とキシラジン（グラム体重当たり5g）の混合物で麻酔腹腔内。
2. 二国間の外科的アプローチは、脛骨の前内側面としました。この歳で歳以上のラットは、断面積の有意の増加、皮質骨面積、骨量、骨密度、およびanteromediaの軸方向の長さを示す脛骨のlの側面。生理食塩水灌漑下で、大きな、細長いunicortical欠陥は長い空気圧バリ（ジマーホール高速ドリル）を使用して、8ミリメートル、幅3 mmの測定どの作成されました。
3. 骨欠損は、ペプチドの有無に関係なくどちらgelfoamで処理した。 1.5mmの深さが8mmの長さが3 mmの幅を測定するすべての移植の足場は、、穏やかなタッピングで挿入されています。いいえ、外部または内部の四肢の固定装置は、術後に使用されず、動物が制限直後の手術をせず歩き回るさせた。

8。組織学および形態計測

骨再生は、総形態と撮影されたデジタル画像により評価した。

1. 傷害に応答して生成される新たな骨の量を定量化するためにラットを安楽死させ、脛骨を3で採取し、5、および12週間。
2. 慎重に骨欠損を確認した後、収穫された脛骨は、縦方向に日常的に処理し、パラフィンに包埋、および切片、72時間RDO急速decalcifierで脱灰、中性緩衝ホルマリン10％に固定した。
3. 骨の再生は、肉眼および光学顕微鏡検査により評価した。
4. 10匹は、それぞれの条件（すなわち、空の欠陥、gelfoam単独で、とgelfoamプラスR1ペプチド）を使用しました。 8ミリメートルunicortical欠陥は、8μmの厚さだったそれぞれが〜40組織切片、全体で表現した。それらの40のセクションから、我々は新たな骨の量を定量化するための6つのセクションの最小値を使用していました。
5. すべての組織切片は、類骨マトリックスをラベルヘマトキシリン​​/エオシン（H＆E）で染色した。
6. すべてのスライドを顕微鏡により評価した。

9。骨の修復

概要

骨の修復は明らかに筋骨格系組織再生の分野での考慮の非常に重要な領域です。ターゲットの骨は、特に年間でない場合は数十年にわたり留置することができますprothesesの使用で、整形外科の実践に重要なユーティリティを持っている可能性がペプチド。骨熱帯因子のバイオミメティック特性は、技術的組織工学の分野で一歩前進だけでなく、骨の補綴手術を作成することができます。合成または天然高分子の要因を標的と骨を含めると、それによって修復および再生を受けている組織内で内因性の細胞を清掃、細胞接着の特異性を支援することができる。追加の目標は、ファージディスプレイライブラリーのバイオパニングin vivoでのことで同定されたペプチドを標的とする当社独自の骨は、骨と骨髄から単離した細胞に結合、 および in vivo でのin vitroで骨形成と骨再生を調節する可能性があるかどう確立することだった。

我々の実験では、我々は、骨再生に関するペプチドの活性の詳細を解明するために大腿骨の天然および合成ポリマーマトリクスを用いたラットにおける欠陥や組織学、生化学、遺伝子発現、マイクロCTとバイオメカニクスによって検査、骨再生にペプチドを伝えた。このアプローチのさらなる発展は、生物学的に活性な化合物、そのターゲットの骨の発見と開発につながるとよく細胞および分子レベルで生物学的に特徴づけているメカニズムを介して修復を増強することができます。

染色

ペプチドは、間葉系細胞への結合および局在を決定するためにビオチン - ラベルを使用して合成した。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識アビジンは、微視的にin vitroで培養した細胞上でのペプチドの結合をローカライズするために使用されていました。ペプチドは、培養中の間葉細胞にだけでなく、in vitroでマウスのリブの組織切片（ 図1）の骨と骨髄にバインドします。

von Kossa染色

間葉系細胞（D1）は、骨髄からクローニングし、in vitroでの細胞に対するペプチドの骨形成作用を決定するために使用されていました。細胞は細胞形態と遺伝子発現の変化を決定するためにペプチドL7とR1で処理した。 4日目に、細胞は、培養中の骨の細胞（ 図2）と同様の細胞の振る舞いのパターンを集計するために始めた、と結節を形成するために、時間とともに拡大を集約していた。

細胞にペプチドL7またはR1の加算は、フォンコッサと文化の染色を強化。次いで、細胞を、最大の文化の16日間のためのペプチドL7またはR1の異なる濃度で処理した。それは、5 nMのペプチドは、in vitroで最も効果的であると判断した。ペプチドで処理した培養物中のアルカリホスファターゼ活性は2〜3.5倍に増加した。倍の増加は、ペプチドと培養中の治療の時の濃度に依存していた。

リアルタイムPCR

L7とR1ペプチドで処理した細胞は、リアルタイムPを用いて解析したつの既知の骨細胞の転写因子の遺伝子発現（OsterixとRunx2）と3つの骨基質蛋白質（骨シアロタンパク、オステオカルシンおよびI型コラーゲン）のためのCR。 R1による治療はOsterixとRunx2遺伝子発現の増加を示した。コラーゲンタイプ1の遺伝子発現は変化しなかった。 L7による治療は、BSPおよびオステオカルシン遺伝子発現の増加だけでなく、I型コラーゲン遺伝子の発現を示した。これは、両方のペプチドが間葉系細胞培養における骨形成の発症と進行に関連する遺伝子に影響を与えることを示している。

ペプチドを用いたin vitro細胞培養での治療は、R1とL7は間葉系細胞を用いた骨形成に関連する同化作用を明らかにした。 RANKLにオステの比率の増加は、破骨細胞として知られている骨resorbing細胞の動員の減少を示している。ペプチドと細胞の治療は、骨の形成と関連し、骨形成を阻害する要因を減少している遺伝子の発現の増加につながる。

組織学

骨の量を決定するために、我々はそれによって自家蛍光を生産μLtraviolet光に骨のスライスを露呈した。これは、定量²の目的のために骨と非骨組織との間の大きなコントラストを提供します。セクションは、同じ倍率（× 10目標）でニコンデジタルイメージングシステムによって明視野と紫外線（ 図3）ニコンとUV光の両方を使用して撮影した。結果として得られるデジタル画像はMetavueイメージングソフトウェア（Molecular Devices社）で分析した。我々は8mm unicortical欠陥が含まれている興味の固定、矩形領域（ROI）を選んだ。損傷部位は、常に手動で各画像上の正しい位置にボックスを配置することにより、このROI内部で表現された。 H＆E -正のピクセルは、部分的に色の許容値に設定された魔法の杖ツールを使って自動化された。この許容値の設定は、H＆E染色切片における骨組織の組織学的外観を正確に対応した緑の範囲は強調表示されたピクセルをもたらした。各セクションのためのH＆E -正のピクセルの合計数を記録した。個別のセクションからのピクセル数は、各脛骨のサンプルについて平均したと治療群内および間の違いについては、これらの平均に基づいて算出した。すべてのサンプルのための領域が、新しい皮質骨（ 図4）の量に基づいて比較した。

セクション内の骨の存在は、単独でgelfoamに比較してgelfoam +ペプチドで処置された欠陥の骨修復を決定するために定量した。 gelfoam + R1ペプチドで満たされた個数は3個で最大10の皮質修理の量、7と2倍に増加、5、12週をそれぞれ示した。 gelfoamの皮質骨の修復の違い+ペプチドは、単独でgelfoamと比較してペプチドは、皮質骨の再生（ 図5）を促進することを示す3〜5週間で最も顕著であった。

10。骨形成ペプチドのアナボリック効果

OPG / RANKLの比率は、ペプチドが骨芽細胞に直接影響を与えると骨吸収を調節する可能性があることを示唆RANKL / OPG比よりも大きい。

合成ペプチドは、そのような準備の速度、分子の安定性、長い貯蔵寿命と潜在的に治療への応用などの大きな分子上の利点を有することができる。大きな進展は、制御サイトカインや成長因子により、骨の損失と再生を調節する試みがなされている。これらの骨指向性のペプチドは、骨同化作用と骨の再生を刺激する既存の治療法に魅力的な選択肢を提供することがあります。

図1 in vitroでマウスのリブの組織切片における骨髄と骨に結合するペプチド。

図2。ペプチド治療後の間葉系幹細胞（D1）フォームの結節。

図3。骨形成ペプチド、L7とR1を用いて骨修復の組織学。

図4。骨のセクションでは、自家蛍光の原因UV光下で、H＆Eで染色。これは定量目的のために骨と非骨組織との間の大きなコントラストを提供します。

図5。組織切片における骨の定量は、皮質修理の最大量は、5週でであることを示した10倍の変化、7と2倍3に、ペプチドは、皮質骨の再生を促すことを示している5週間。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S