Peptider från Phage Display Library modulera genuttryck i mesenkymala celler och potentiera Osteogenesis i Unicortical bendefekter

Summary

En phage display Biblioteket används för att identifiera sekvenser som riktar ben. Syftet var att undersöka effekten av dessa peptider om mesenkymala cell differentiering och att bestämma deras effekt på ben föryngring.

Abstract

Två nya syntetiska peptider snabbare benbildning och kan levereras med en kollagenmatrisen. Syftet med denna studie var att undersöka effekter på ben reparation i ett unicortical fel modell. Behandling av mesenkymala celler produceras en ökning av alkaliskt fosfatas aktivitet, visade knöl bildningen av cellerna, och ökade uttrycket av gener för runx2, osterix, ben sialoprotein och osteocalcin. En kollagen svamp indränkt med peptid främjas reparation av bendefekter, medan kontrollgruppen var mindre effektivt. Resultaten från denna studie visade att mesenkymala celler som behandlats med peptid in vitro differentiera mot osteogenesis, och att peptider levereras in vivo med hjälp av en kollagen svamp främja reparation av unicortical defekter.

Protocol

1. In vivo Biopanning att isolera Phage Det Target långa ben

Fag DNA sekvenserat och peptider med en motsvarande sekvens var syntetiseras. Peptider var syntetiseras med Gly-Gly-Gly-tjäns-lysin länkaren (länkaren behövs för att par fluorescerande kromoforer som hjälper till att spåra / spåra peptider).

1. En 10 veckor gamla BALB / c mus var sövda, var hjärta utsatt.
2. Den Ph.D-12 phage display peptid bibliotek kit (New England Biolabs, Beverly, MA) har använts för in vivo Biopanning, 10 x 1010 PFU, och sprutas in i hjärtat.
3. Efter ca 5 minuter var musen avlivas. Lårben exponerades och dissekeras, ändarna på lårben var avskurna, och benmärg togs bort.
4. Insidan och utsidan av vänster lårben var sköljas 10 gånger med PBS, och lårbenet inkom ER2537 bakterier (kallas icke-eluerade fag, gå till steg 6).
5. Den intramedullär kanalen av rätten lårbenet var sköljas med 2%-torkad skumma mjölk i en spruta med en 21-nål tio gånger för att avlägsna icke-bundet fag. Bound phage var elueras från intramedullär kanalen med HCl-glycin buffert pH 2,2, neutraliseras med 1M Tris, läggas till ER2537 bakterier, och odlade för 4,5 timmar för att förstärka fag (kallad eluerade).
6. Bakterier togs bort genom centrifugering sedimentering i 10 min vid 4 ° C, och fag fälldes över natten vid 4 ° C genom tillsats av PEG / NaCl-lösning. Den phage samlades in genom centrifugering och svävande och fälls ut två gånger genom tillsats av 1 / 6 volymen av PEG / NaCl. Den slutliga pellets var suspenderade i TBS med 0,02% NaN3.
7. Den förstärkta eluat från både eluerade och icke-elueras fag injicerades i olika möss och fag var isolerad enligt ovan. Endast den vänstra lårbenet togs bort från musen som injicerades med den icke-elueras fag och lårbenet placeras direkt i bakterier (se steg 4 ovan). Den elueras phage mus isolerades först från den högra lårbenet och phage släpptes av HCl-glycin buffert innan du lägger till bakterier (se steg 5 ovan).
8. Detta in vivo-Biopanning procedur upprepades tre gånger innan sekvensering av DNA med-98 grundfärg (följer med phage display kit).
9. Poolade phage var förstärkt i bakteriekulturer, renat, kvantifieras och sedan injicerades i en fjärde mus. Sekvensering upprepades.
10. För att visa peptid specificitet till ben och märg, fag elueras från njurar och lever analyserades enligt ovan. I samtliga fyra rundor var det mindre mängd fag i dessa organ (mindre än 10%).
11. Peptider var syntetiseras med Gly-Gly-Gly-tjäns-lys sekvens, med och utan biotin som ska användas för celler och vävnader färgning, samt för in vivo-arbetet.

2. Mesenkymala cell Kultur för Osteogenic Experiment celldifferentiering

1. En klonad mus pluripotential benmärg stroma (D1) cellinje isolerade i vårt labb ¹ användes för in vitro-försök. Cellerna odlades i Dulbecco ändrade viktigt medium, DMEM, lågt glukos (Gibco katt # 11.885-084) kompletterad med 10% fetalt bovint serum (Gibco katt # 16.000-044), femtio milligram natriumaskorbat per milliliter (Sigma katt # A7631 ) och 100 U / ml penicillin G och 100 mg / ml streptomycin (Gibco katt # 15.140-122).
2. Kulturer låg kvar på 37 ° C i en fuktig atmosfär av 5% CO ₂ vatten mantlat inkubatorer och sub-odlade fram celler var ungefär 90% konfluenta.
3. Cell var trypsinized, centrifugeras för att pellets, räknad och seedade vid en koncentration på 5x10 ³ celler / cm ² i vävnadskultur behandlas plasten.

3. Peptide färgning av odlade celler och vävnader

1. D1 eller celler märg var pläterade på fibronektin-eller gelatin-belagt kammare och diabilder som innehåller DMEM och 10% fetalt bovint serum i 24 timmar.
2. Cellerna sköljdes med PBS. Celler / vävnad har fastställts med 4% paraformaldehyd i 30 minuter
3. Överskott av aldehyder var blockerade med 0,5 M Glycine (pH 7,5) i 10 minuter.
4. Endogena avidin och biotin receptorer på cellytan blockerades genom tillsats av 5% BSA + Avidin blockerande lösningen i 1 timme, sköljs en gång med PBS i 5 minuter, sedan blockeras med 5% BSA + Biotin blockerande lösningen i 1 timme.
5. Sedan 100 mikroM biotinylerad L7 och R1 peptider lades till brunnar i 30 minuter.
6. Cellerna sköljdes tre gånger med PBS i 5 min vardera och 1:1000 utspädning av Alexa Mjöl Streptavidin inkom och inkuberas i mörker i 30 minuter.
7. Celler var tvättas och täckglas monteras med vectashield montering media och undersöks under ett fluorescensmikroskop.

4. Alkalisk fosfatasaktivitet analys

1. Alkaliskt fosfatas Colorimetric analys utfördes på monolager med ett alkaliskt fosfatas kit (BioRad) som rekommenderas av tillverkaren.
2. D1 celler var klädd med en täthet 5 x 10 ³ celler / cm ² på 6-väl odlingsplattor och behandlas med R1 peptid var ALP aktivitet kvantifieras dagar 4, 8, 12, 16 och 20.
3. För att förbereda cellen lysates var cellager sköljs tre gånger med PBS-buffert och sedan skrapas in i PBS följt av ultraljudsbehandling och centrifugering för att avlägsna cellulära skräp.
4. Lika volymer av lysat (100 mikroliter) blandades sedan med 100 mikroliter av nyberedda kolorimetriska substratet para-nitrofenylfosfat, och inkuberas vid 37 ° C i 30 minuter.
5. Den enzymatiska reaktionen stoppades genom att tillsätta 100 mikroliter av 0,2 N NaOH-lösningar. ALP aktivitet mättes vid 405 nm med ELISA-läsare (Bio-Rad).
6. Protein koncentration av cellen lysates mättes med en BioRad Protein Assay Kit, och AP aktivitet uttrycktes sedan para-nitrofenol produceras i nmol / min / mg protein.
7. ALP aktiviteten beräknas enligt tillverkarens specifikationer (Sigma, Inc.).
8. Enheter av ALP aktivitet normaliserades till milligram av det totala proteininnehållet med BCA analys (Pierce, Rockford, IL) i cellen lysat.

5. Mesenkymala celldifferentiering med L7 och R1

1. Subconfluent mesenkymala (D1) celler var vuxit till cirka 90% confluency och behandlad med 5nM L7 och R1 peptid.
2. Cellerna skördades på 0,5, 2, 6, 24 och 48 timmar, och RNA var beredd att använda Qiagen RNeasy kit med tillverkarens anvisningar.
3. Omvänt transkriptas (RT) reaktioner var glödgat (37 ° C, 10 minuter) följt av första strängen cDNA syntes (42 ° C, 30 minuter) och värmeinaktivering (95 ° C i 5 minuter). Den resulterande cDNA förvarades frysta (-70 ° C) tills bestäms genom realtids-PCR.
4. Real Time PCR utfördes med hjälp av QuantiTect SYBR Grön PCR kit (Qiagen). Reaktionerna genomfördes med 25 mikroliter av SYBR Gröna kit Master Mix och framåt och bakåt grundfärger (300 nmol / L) av ben specifika gener för t.ex. Runx2, Osterix, Osteocalcin, Bone sialoprotein och Wnt gener väg såsom B-catenin, LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 och OPG och RANKL (se tabell 1).
5. Den 3 mikroliter av cDNA prov lades till den slutliga reaktionsblandningen outspädd från RT-reaktionen. Den 96-såväl realtids-PCR-format ingår sex 10-faldig utspädningar i dubblett av plasmid-DNA-standarder. Brunnarna på plattan var förseglade med optisk självhäftande täcker (BioRad) och centrifugeras vid låg hastighet (300 g, 5 minuter) en fullständig blandning.
6. Varje prov analyserades minst två gånger med iCycler instrumentet (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. PCR-protokoll som används inblandade aktivering av AmpliTaq Gold DNA-polymeras följt av 40 cykler av denaturering vid 94 ° C i 30 sekunder, respektive glödgning temperatur under 30 sekunder, och förlängning vid 72 ° C i 30 sekunder. PCR tröskeln antal cykler (CT) för varje prov beräknades vid den punkt där fluorescens överskred gränsvärdet. Gränsvärdet har fastställts längs den linjära logaritmiska fasen av fluorescens kurvor vid 10 till 20 standard avvikelser (SDS) över genomsnittet bakgrundsfluorescens. Standardkurva ekvationer beräknades genom regressionsanalys av genomsnittet CT kontra log10 av cDNA förhållande till den totala RNA närvarande. Relativ uttryck för mål gener normaliserades till 18S för ben specifika gener och b-aktin användes för Wnt väg gen.

6. In vivo Beredning av Gelfoam Composite

1. Använd aseptisk rutiner, var gelfoam cylindrar (Pharmacia & Upjohn katt # 09-0353-01), 3 mm i diameter med 8 mm lång, skapade med egendesignade instrument.
2. Tjugofyra timmar före operation var gelfoam cylindrarna blöt-laddad med antingen L7 eller R1 peptid (20 mikrometer i PBS) eller PBS-buffert utan peptid. Den gelfoam cylindrar överfördes till sterila 12 och kultur rätter och lagras över natten vid -4 ° C.
3. Vid tidpunkten för kirurgi var gelfoam komposit i kultur rätter flyttat ut från kylskåpet och sätter på is tills kirurgi.

7. Bendefekter

1. Alla animaliska förfaranden godkändes av Djurens skötsel och användning kommitté Health System vid University of Virginia, innan de utförs. Tio nio månader gammal vuxen syngena manliga Fischer 344 råttor (350-400 g) var sövda intraperitonealt med en blandning av ketamin (50 g per gram kroppsvikt) och xylazin (5 g per gram kroppsvikt).
2. Ett bilateralt kirurgisk metod gjordes till anteromedial aspekten av skenbenet. Råttor i denna ålder eller äldre visar obetydliga ökningar av tvärsnittsarea, kortikala benet område, benmassa, bentäthet, och axial längd anteromediaL aspekt av skenbenet. En stor, avlång unicortical fel skapades som mätte 3 mm bred och 8 mm lång med en pneumatisk Burr (Hall High Speed ​​Drill, Zimmer) under koksaltlösning bevattning.
3. Den bendefekten behandlades med gelfoam antingen med eller utan peptider. Alla implantat ställningar, som mäter 3 mm bredd med 8 mm längd med 1,5 mm djup, infördes genom försiktig knacka. Inga yttre eller inre lem fixationsprodukter användes postoperativt, och djur får pendla utan begränsning omedelbart efter operationen.

8. Histologi och morfometri

Benuppbyggnad utvärderades genom grov morfologi och digitala tagit bilder.

1. Råttor avlivas och skenben samlades in vid 3, 5 och 12 veckor för att kvantifiera mängden av nytt ben skapas som svar på skada.
2. Efter kontroll av bendefekten noga, var den skördade skenbenet som fastställs i 10% neutral buffrad formalin, urkalkade i RDO snabb Kalklösare under 72 timmar, därefter bearbetas rutinmässigt och bäddas in i paraffin och snittades longitudinellt.
3. Benuppbyggnad utvärderades av brutto-och ljus mikroskopisk undersökning.
4. Tio djuren användes för varje tillstånd (dvs tomma defekt, gelfoam ensam, och gelfoam plus R1 peptid). Den 8mm unicortical felet representerade på ~ 40 vävnadssnitt, som alla var 8 ìm tjock. Av de 40 avsnitten använde vi ett minimum av 6 avsnitt för att kvantifiera mängden av nytt ben.
5. Alla vävnadssnitt färgades med hematoxylin / eosin (H & E), vilka etiketter osteoid matris.
6. Alla bilder har utvärderats av mikroskopi.

9. Bone Reparation

Översikt

Bone reparation är helt klart ett mycket viktigt område för övervägande inom rörelseorganens vävnadsregenerering. De peptider som riktar ben kunde ha stor nytta av i praktiken av Ortopedisk kirurgi, särskilt i användningen av proteser som kan vara inneboende i flera år om inte årtionden. Den biomimetiska egenskaper av ben tropiska faktorer som kan skapa ett tekniskt steg framåt när det gäller tissue engineering, liksom för proteskirurgi av ben. Införande av ben som riktar faktorer i syntetiska eller naturliga polymerer kan hjälpa specificitet cell följsamhet och därmed sophantering endogena celler i vävnader som genomgår reparation och förnyelse. Ett ytterligare mål var att fastställa om våra unika ben inriktning peptider identifieras av in vivo Biopanning av en fag display bibliotek skulle binda till celler isolerade från ben och benmärg och har potential att modulera osteogenesis in vitro och benuppbyggnad in vivo.

I våra experiment, levererade vi peptider till femoral defekter hos råttor med hjälp av naturliga och syntetiska polymerer matriser och benuppbyggnad granskas av histologi, biokemi, genuttryck, mikro-CT och biomekanik för att klarlägga detaljer i peptid aktivitet på benuppbyggnad. Fortsatt utveckling av detta tillvägagångssätt kan leda till upptäckt och utveckling av biologiskt aktiva substanser med inriktning ben och potentiera reparation genom mekanismer som är väl kännetecknas biologiskt på cellulär och molekylär nivå.

Färgning

De peptider var syntetiseras med biotin-etiketter för att fastställa bindande och lokalisering till mesenkymala celler. Fluorescein-(FITC)-märkta avidin användes för att lokalisera mikroskopiskt bindningen av peptider i celler som odlas in vitro. Peptiderna binder till mesenkymala celler i kultur samt att ben och märg i vävnaden mus rib delar in vitro (figur 1).

Von Kossa färgning

En mesenkymala celler (D1) var klonad från benmärg och används för att bestämma osteogenic effekten av peptider på celler in vitro. Cellerna behandlades med peptider L7 och R1 för att fastställa förändringar i cell morfologi och genuttryck. På dag 4 hade cellerna börjat att aggregera och aggregat förstoras med tid att bilda knölar, en cell beteendemönster som liknar ben celler i kultur (Figur 2).

Tillägget av peptid L7 eller R1 till cellerna bättre färgning av kulturer med von Kossa. Celler har sedan behandlats med olika koncentrationer av peptid L7 eller R1 för upp till 16 dagar i kulturen. Det var bestämt att 5 nM peptid var mest effektiv in vitro. Alkaliskt fosfatas aktivitet i de kulturer som behandlades med peptid ökade från mellan 2 och 3,5 gånger. Den faldig ökning berodde på koncentrationen av peptiden och tiden för behandling i kultur.

Realtids-PCR

Celler som behandlats med L7 och R1 peptider analyserades med hjälp av Real-Time PCR för genuttryck för två kända transkriptionsfaktorer bencellsaktivitet faktorer (Osterix och Runx2) och tre ben proteiner matris (ben sialoprotein, osteocalcin och kollagen typ I). Behandling med R1 visade på ökningar i Osterix och Runx2 genuttryck. Kollagen typ 1 genuttryck oförändrad. Behandling med L7 visade en ökning av BSP och osteocalcin genuttryck samt uttryck för typ I-kollagen genen. Detta visar att båda peptider har en effekt på gener som är relaterade till uppkomsten och utvecklingen av osteogenesis i mesenkymala cellkulturer.

Behandlingen av in vitro cellodlingar med peptider R1 och L7 har avslöjat en anabol effekt relaterade till benbildning med mesenkymala celler. En ökning av kvoten mellan osteoprotegerin till RANKL indikerar en nedgång i rekryteringen av benet resorberande celler som kallas osteoklaster. Behandling av celler med peptiderna leder också till ett ökat uttryck av gener som är kopplade till benbildning och minskar de faktorer som hämmar osteogenesis.

Histologi

Att bestämma mängden av ben, utsätts vi skivor av ben till μLtraviolet ljus varvid det bildas autofluorescens. Detta ger större kontrast mellan ben och icke-benvävnad för att kvantifiering ^2. Avsnitten fotograferades med både ljusa fält och UV-ljus (Figur 3) en Nikon och UV-ljus genom en Nikon digital bildbehandling systemet på samma förstoring (x10 mål). Den resulterande digitala bilder analyserades med Metavue bildbehandlingsprogram (Molecular Devices). Vi valde en fast, rektangulärt område av intresse (ROI) som innehöll 8 mm unicortical defekt. Skadan platsen var alltid representerade inuti denna avkastning genom att manuellt placera boxen i rätt position på varje bild. H & E-positiva pixlar delvis automatiserad med trollstaven inställd på en färg tolerans. Denna tolerans inställning resulterade i markerade pixlar med en rad gröna som exakt motsvarade den histologiska utseendet på benvävnaden i H & E-färgade snitt. Det totala antalet H & E-positiva pixlar för varje avsnitt spelades in. Den pixelantal från enskilda avsnitten var i genomsnitt för varje tibia prov och skillnaderna inom och mellan behandlingsgrupperna var beräknats utifrån dessa medelvärden. De områden för samtliga prover jämfördes sedan baserat på mängden av nya kortikala benet (Figur 4).

Förekomsten av ben i avsnitten kvantifierades att avgöra ben reparation i de defekter som behandlas med gelfoam + peptid i jämförelse med gelfoam ensam. Defekter som var fyllda med gelfoam + R1 peptid uppvisade den största mängden kortikala reparera med en 10, 7 och 2-faldig ökning vid 3, 5, 12 veckor. Skillnaderna i kortikala benet reparation i gelfoam + peptid jämfört med gelfoam enbart var mest märkbar vid 3 och 5 veckor visar att peptiden främjar kortikala benet regenerering (Figur 5).

10. Anabola effekten av Osteogenic Peptides

Den OPG / RANKL förhållandet är större än RANKL / OPG förhållande, vilket tyder på att peptider kan ha en direkt effekt på osteoblaster och reglerar benresorption.

Syntetiska peptider kan ha fördelar jämfört med större molekyler som hastighet av förberedelser, molekylär stabilitet, lång livslängd hylla och potentiellt terapeutiska tillämpningar. Betydande framsteg har gjorts i försök att modulera benförlust och förnyelse genom att kontrollera cytokiner och tillväxtfaktorer. Dessa osteotropic peptider kan erbjuda attraktiva alternativ till befintliga behandlingar som stimulerar ben anabolism och ben förnyelse.

Figur 1. Peptid binda till märg och ben i mus resår vävnad avsnitt in vitro.

Figur 2. Mesenkymala celler (D1) form knölar efter peptid behandling.

Figur 3. Histologi av ben reparera med hjälp av osteogenic peptider, L7 och R1.

Figur 4. Bone sektioner färgas med H & E under UV-ljus som orsakar autofluorescens. Detta ger större kontrast mellan ben och icke-benvävnad för kvantifiering ändamål.

Figur 5. Kvantifiering av ben i histologi avsnitt visade den största mängden av kortikal reparation var på 5 veckor meden 10-faldig förändring, 7 och 2-faldigt vid 3 och 5 veckor visar att peptiden främjar kortikala benet förnyelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S